Modulation moléculaire par des shRNAs spécifiques délivrés par lentivirus dans des neurones stressés par le réticulum endoplasmique

Résumé

Dans la présente étude, l’expression est réduite de deux composants de signalisation en aval de la voie PERK, la calcineurine cytoprotectrice et le CHOP pro-apoptotique, en utilisant des shRNAs spécifiques. De manière opposée, ceux-ci modulent la susceptibilité des neurones corticaux primaires à l’atrophie des neurites après induction d’un stress du réticulum endoplasmique.

Résumé

L’accumulation de protéines dépliées dans le réticulum endoplasmique (RE), causée par toute condition de stress, déclenche la réponse protéique dépliée (UPR) par l’activation de capteurs spécialisés. L’EPU tente d’abord de restaurer l’homéostasie; Mais si les dommages persistent, la signalisation induit l’apoptose.

Il est de plus en plus évident que le stress prolongé et non résolu des urgences contribue à de nombreuses pathologies, y compris les maladies neurodégénératives. Parce que l’UPR contrôle le devenir cellulaire en basculant entre les processus cytoprotecteurs et apoptotiques, il est essentiel de comprendre les événements définissant cette transition, ainsi que les éléments impliqués dans sa modulation.

Récemment, nous avons démontré que l’accumulation anormale de gangliosides GM2 provoque l’épuisement de la teneur en ER Ca²⁺ , qui à son tour active PERK (PKR-like-ER kinase), l’un des capteurs UPR. De plus, la signalisation PERK participe à l’atrophie des neurites et à l’apoptose induite par l’accumulation de GM2. À cet égard, nous avons mis en place un système expérimental qui nous permet de moduler moléculairement l’expression des composants PERK en aval et ainsi modifier la vulnérabilité des neurones à subir une atrophie neuritique.

Nous avons effectué l’élimination de l’expression de la calcineurine (cytoprotectrice) et CHOP (pro-apoptotique) dans des cultures neuronales corticales de rat. Les cellules ont été infectées par un shRNA spécifique délivré par lentivirus, puis traitées avec du GM2 à différents moments, fixées et immunocolorées avec un anticorps anti-MAP2 (protéine 2 associée aux microtubes). Plus tard, les images cellulaires ont été enregistrées à l’aide d’un microscope à fluorescence et la croissance totale des neurites a été évaluée à l’aide du logiciel de traitement d’images du domaine public ImageJ. L’inhibition de l’expression de ces composants de signalisation PERK a clairement permis d’accélérer ou de retarder l’atrophie neuritique induite par le stress ER.

Cette approche pourrait être utilisée dans les modèles du système cellulaire du stress ER pour évaluer la vulnérabilité des neurones à l’atrophie des neurites.

Introduction

Le stress du réticulum endoplasmique (RE) est défini comme toute perturbation qui compromet la capacité de repliement des protéines dans l’organite. L’accumulation de protéines dépliées dans la lumière ER active un signal en cascade de transduction appelé réponse protéique dépliée (UPR). Cette voie de signalisation complexe est orchestrée par trois capteurs de stress : PERK (protéine kinase ARN [PKR]-like ER kinase), IRE1 (enzyme 1 nécessitant de l’inositol) et ATF6 (facteur de transcription activé 6). Tous ensemble tentent de restaurer l’homéostasie. Mais si le stress persiste, l’UPR finit par induire la mort cellulaire par apoptose¹.

PERK, une protéine transmembranaire ER, lors du stress ER, conduit à la phosphorylation du facteur d’initiation eucaryote 2 alpha (eIF2α), réduisant la synthèse globale des protéines et donc la charge protéique dans l’ER². Nous avons démontré que la calcineurine A/B (CNA/B), une phosphatase hétérodimère^Ca2+, se lie directement au domaine cytosolique de la PERK, augmentant son auto-phosphorylation et améliorant significativement l’inhibition de la traduction des protéines et la viabilité cellulaire ^3,4. Fait intéressant, le CNA/B est abondant dans le cerveau des mammifères, distinguant deux isoformes de la sous-unité A du CN : α et β.

Sous un stress ER soutenu, la voie de signalisation PERK est la seule branche de l’UPR qui reste activée, médiant ainsi à la fois la réponse pro-survie et la réponse apoptotique. Dans la phase chronique, un événement majeur en aval est l’induction du facteur de transcription, CHOP (CCAAT/enhancer binding protein homologous protein)⁵. Le stress chronique des urgences est également de plus en plus reconnu comme un contributeur commun à un large éventail de troubles pathologiques, y compris les maladies neurodégénératives⁶. Il est important de comprendre comment l’UPR peut faciliter la signalisation cytoprotectrice au lieu de la mort cellulaire ⁷. Cependant, à l’heure actuelle, on sait peu de choses sur le mécanisme exact contrôlant la transition entre ces deux phases de l’EPU.

Récemment, nous avons constaté que, dans les neurones en culture, le ganglioside GM2 s’accumule dans les membranes RE et induit une déplétion en calcium luminal. Cela active à son tour la signalisation PERK, qui intervient dans l’atrophie des neurites et l’apoptose ⁸. Dans cette étude, l’accumulation de GM2 dans les neurones en culture est utilisée comme modèle du système cellulaire de l’atrophie des neurites induite par le stress ER. Plus précisément, deux expressions de facteur PERK sont manipulées, CN-Aα et CHOP, ce qui commute la transition entre les événements précoces / protecteurs et une phase chronique / apoptotique. Pour ce faire, les gènes respectifs sont réduits au silence; ainsi, les cultures de neurones corticaux primaires sont infectées par des shRNA spécifiques délivrés par lentivirus. L’analyse par transfert Western révèle une réduction significative des niveaux d’expression de CN-Aα et CHOP par rapport aux cellules témoins, qui sont infectées par des lentivirus porteurs d’un shRNA brouillé. Après ce traitement, les neurones sont soumis à différents temps d’incubation de GM2 exogène, fixes, et immunocolorés avec l’anticorps anti-microtubule associated protein 2 (MAP2)⁹. Les images sont obtenues avec un microscope à épifluorescence. La croissance totale des neurites est évaluée par rapport au nombre total de cellules.

Protocole

Les procédures animales sont effectuées conformément aux protocoles approuvés du Guide de l’Institut national de la santé pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire. L’autorisation de mener l’étude est accordée par le Comité de protection et d’éthique des animaux (CICUAL) de l’INIMEC-CONICET-UNC (Résolution numéros 014/2017 B et 006/2017 A).

1. Cultures de neurones corticaux primaires chez le rat

1. Anesthésier les rates gravides E18 Wistar dans une chambre de CO 2 avec un mélange de 80% de CO₂/20%_O2 pendant 60 s d’exposition puis sacrifier ensuite en disloquant les vertèbres cervicales.
2. Effectuez les étapes suivantes dans une hotte à flux laminaire. Extraire l’encéphale des embryons avec une pince de style # 3 et de petits ciseaux à ressort droits et tranchants (table des matériaux) à la solution de Hanks dans des boîtes de culture cellulaire.
3. Disséquer le tissu sous une loupe 20x, à l’aide de deux pinces à pointe fine style #5, séparant le cortex frontal des méninges. Transférer le cortex frontal dans un tube conique de 15 mL et incuber le tissu avec 3-4 mL de trypsine-EDTA (0,25%) pendant 15 min, à 37 °C pour la digestion chimique.
4. Après la digestion, diluez-le avec 3 à 4 ml de milieu aigle modifié (DMEM) de Dulbecco plus 10 % de sérum de veau fœtal (FCS). Ensuite, lavez-le 3 fois avec la solution de sel équilibré Hanks libre de^Ca2+/Mg²⁺ et 0,1% de glucose par centrifugation (3000 g pendant 5 min).
5. Dissocier mécaniquement le tissu 10 fois en pipetant de haut en bas à l’aide d’une pointe de 1000 μL, dans DMEM plus 10% FCS (Table of Materials). Puis centrifuger l’homogénat à 100 x g pendant 1 min, recueillir le surnageant et compléter le volume restant à 1000 μL.
6. Plaquer la suspension cellulaire sur des boîtes de culture cellulaire à une densité de 520 cellules/^mm2 avec 2 mL de DMEM contenant 10 % de FCS, 1 % de pénicilline/streptomycine et 1 % d’un additif d’acide aminé essentiel (voir le tableau des matières). Puis incuber à 37 °C dans un environnement humidifié avec 5% de_CO2 pendant 2 h.
   1. Élimination de la matière organique et enrobage de poly-L-lysine de boîtes de culture cellulaire
      1. Enlevez la matière organique en plaçant le matériau en verre dans une chambre de réaction et ajoutez de l’alcool éthylique à 96% pour couvrir à peu près le matériau. Ajoutez ensuite 68% (p / v) d’acide nitrique goutte à goutte jusqu’à ce que des bulles brunâtres-verdâtres commencent à apparaître. Une fois que cela se produit, couvrez partiellement le récipient et laissez la réaction se poursuivre jusqu’à ce que l’explosion cesse.
         REMARQUE : Retirer la matière organique sous une cabine d’extraction de gaz pour éviter l’exposition aux gaz nocifs.
      2. Avant l’enrobage de poly-L-lysine, rincez les verres avec de l’eau Mili-Q stérile une dizaine de fois. Incuber ensuite les verres de culture et les plats avec 0,1 μg/μL de poly-L-lysine pendant 4 h avant de les utiliser. Après l’incubation, rincer les verres avec de l’eau Mili-Q stérile une dizaine de fois.
7. Pour permettre la différenciation des cellules neurales, changez le milieu pour un milieu neurobasal sans sérum, avec le supplément sans sérum (Table of Materials). Conserver les cultures à 37 °C avec 5 % de CO₂ jusqu’au traitement.

2. Production de lentivirus

REMARQUE : Les oligonucléotides contenant les séquences ciblant les 3'UTR de l’isoforme CN-Aα ou CHOP et les séquences non ciblées (brouillages) sont énumérés dans le tableau 1.

1. Pour le recuit, mélanger deux oligonucléotides simple brin avec des séquences complémentaires en quantités molaires égales, à l’aide d’un tampon de recuit (10 mM Tris-HCl, pH 7,5-8,0, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA).
2. Chauffer à 95 °C pendant 2 minutes, puis refroidir lentement en transférant les échantillons du bloc de chaleur ou du bain-marie sur une paillasse à température ambiante. Diluer le produit obtenu [ARN court en épingle à cheveux (shRNA) à extrémités cohésives] jusqu’à une concentration finale de 0,5 μM, les aliquoter et les conserver à -20 °C.
3. Cloner l’insert shRNA dans le vecteur lentiviral pLKO.3G, avec GFP comme marqueur fluorescent vert. Pour cela, digérer 1 μg de vecteur avec les enzymes de restriction EcoRI et PacI en mélangeant les éléments suivants dans un tube stérile : 2 μL de tampon enzymatique de restriction 10x (100 mM bis-Tris propane-HCl, pH 6,5, 100 mM MgCl2, 1 mg/mL d’albumine sérique bovine), 1 μL de 1 μg/μL de pLKO.3G,_0,5 μL de 10 U/μL d’ECoRI, 0,5 μL de PacI (10 U/μL) et 16 μL d’eau ionisée stérile.
   1. Mélanger doucement par pipetage. Incuber la réaction pendant 3-4 h à 37 °C.
      REMARQUE: Les digestions nocturnes sont généralement inutiles et peuvent entraîner une dégradation de l’ADN.
4. Pour la ligature, mélanger le vecteur digéré et l’insérer dans un rapport molaire de 3:1 et l’incuber avec le tampon T4 ligase et ligase (fourni par le fabricant) pendant une nuit à 16 °C.
   NOTE: À ce stade, la réaction de ligature peut être conservée à 4 ° C jusqu’à une utilisation ultérieure.
5. Transformer les cellules compétentes DH5α (Tableau des matériaux) ou une autre souche appropriée d’E. coli avec la réaction de ligature comme suit.
   1. Mélanger E. coli compétent avec le volume total de la réaction de ligature et le refroidir sur la glace pendant 15 min, le placer dans un bain à 42 °C pendant 2 min, puis le refroidir à nouveau sur la glace pendant 15 min.
   2. Transférer le volume total soumis au choc thermique dans un tube de 15 mL et compléter le volume à 1000 μL avec le milieu liquide Luria-Bertani (LB) préalablement maintenu à 37 °C. Agiter les bactéries pendant 90 min à 37 °C dans un agitateur orbital à environ 330 tr/min.
   3. Les centrifuger à 5 000 x g pendant 5 min à 4 °C et éliminer 900 μL de surnageant. Utilisez le surnageant restant pour remettre la pastille en suspension. Répartir uniformément la suspension bactérienne sur une plaque solide d’ampicilline (100 μg/mL) LB.
   4. Incuber à 37 °C pendant une nuit, puis vérifier la croissance bactérienne. À ce stade, les bactéries peuvent être stockées à 4 ° C pendant 4-5 jours.
   5. Choisissez une seule colonie à transférer dans un tube de 50 mL contenant 10 mL de milieu liquide LB et d’ampicilline (100 μg/mL). Agiter les bactéries ON à 37 °C à environ 330 tr/min.
   6. Centrifuger la culture pour granuler les bactéries à 5 000 x g pendant 5 min à 4 °C, éliminer le surnageant et conserver la pastille bactérienne. Celui-ci peut être stocké à -20 °C.
6. Purifier le plasmide avec un kit de purification de l’ADN à partir de pastilles de bactéries en suivant les instructions du fabricant (Tableau des matériaux). Calculer la concentration d’ADN en mesurant l’absorbance à 260 nm et en multipliant par le facteur de dilution, en utilisant la relation suivante : A₂₆₀ d’ADN pur double brin (ds) de 1,0 = 50 μg/mL pur double brin (ds).

3. Infection à lentivirus

REMARQUE : Effectuer la procédure de génération de lentivirus dans une hotte à flux laminaire de classe II.

1. 24 h avant la transfection, semer 1-5 × 10⁶ cellules HEK 293 dans des boîtes de culture de 100 mm de diamètre dans 8 ml de milieu de croissance et les incuber à 37 °C, 5% CO₂ pendant la nuit.
2. Mélanger 14 μg de vecteur pKLO.3G avec insert spécifique, 10,5 μg de plasmide d’emballage psPAX et 3,5 μg de plasmide d’enveloppe pMD2.G (tableau des matériaux). Diluer 45 μL de réactif de transfection plasmidique (Table des matières) dans 700 μL de milieu sérique réduit (Tableau des matières) et incuber pendant 5 min à température ambiante. Ensuite, combinez le mélange d’ADN avec le réactif de transfection plasmidique dilué, mélangez doucement et incuber pendant 20 minutes à température ambiante.
3. Pendant ce temps, changer pour le DMEM frais le milieu de la boîte de culture de cultures cellulaires HEK 293 (70% confluent au moment de la transfection). Ajoutez ensuite tout le volume de la solution d’ADN goutte à goutte. Bercer doucement le plat. Il n’est pas nécessaire d’ajouter/changer de milieu après la transfection.
4. Incuber les cellules à 37 °C, 5% de CO₂ pendant 48 h à 72 h pour permettre aux shRNA d’atteindre leur transduction optimale vérifiée par fluorescence GFP à l’aide d’un microscope à fluorescence. Ensuite, prélever le milieu avec le lentivirus et conserver à 4 °C.
5. Surnageant viral filtré avec une membrane de nylon de 0,45 μm. Aliquote l’écoulement continu dans 1 mL. Ensuite, centrifuger à 17 000 x g pendant 4 h. Jeter le surnageant et conserver la pastille. Laisser sécher les granulés invisibles et, une fois séchés, conserver à - 80 °C.
   1. Effectuer le titrage viral par cytométrie de flux. Ensemencer 4 x 10^{5 cellules} HEK 293 dans des plaques à 24 puits et incuber à 37 °C pendant 24 h. Ensuite, remettez les particules virales en suspension dans 200 μL de milieu de culture DMEM (Tableau des matériaux) et ajoutez 0,05, 0,02 et 0,005 μL à chaque puits.
   2. Incuber l’infection virale pendant 72 h, retirer le milieu et trypsiniser (0,05 % de trypsine, 1 mL) pendant 3 min. Ajouter 1 mL de DMEM dans une solution de FCS à 10 % et centrifuger à 500 x g pendant 5 min. Jetez le surnageant et lavez la pastille deux fois avec du PBS.
   3. Remettez la pastille en suspension avec 100 μL de PBS et fixez les cellules avec 100 μL de paraformaldéhyde (PFA) à 2% dans du PBS. Analysez les cellules à l’aide d’un cytomètre de flux et déterminez le pourcentage de cellules fluorescentes GFP. Recueillez ces données pour calculer le titrage viral à l’aide de la formule suivante :
      Titrage viral
      

4. Cultures de neurones primaires stressées par l’accumulation de gangliosides GM2 et l’immunocytochimie à l’aide d’anticorps anti-MAP2

1. Infecter les cultures de neurones corticaux primaires (15 jours in vitro) avec des oligonucléotides shRNA spécifiques ciblant les UTR 3' de CN-Aα ou CHOP et les incuber à 37 °C avec 5% de CO₂ pendant 1 jour.
   REMARQUE: Des cultures de neurones corticaux primaires de 7-8 jours in vitro pourraient également être utilisées si les cellules présentent une croissance élevée des neurites.
   1. Préparer une solution mère de 500 μM de ganglioside GM2 dans de l’éthanol et la sonifier pendant 1 h.
   2. Ajouter la solution mère de GM2 au milieu des boîtes de culture à une concentration finale de 2 μM. Laisser incuber à 37 °C avec 5% de CO₂ pendant 16, 24 et 48 h.
2. Utiliser certaines cultures pour préparer l’homogénat cellulaire pour l’analyse par transfert Western (pour la spécification des anticorps, voir le tableau des matériaux).
3. Suivez les étapes 1.4. et 1.5. puis fixer les cellules avec 4% de PFA et 120 mM de saccharose dans du PBS pendant 20 min à 37 °C, puis les laver avec du PBS. Effectuez cette procédure sur une membrane antidérapante dans une chambre humide. Ensuite, ajouter la solution de perméabilisation (0,2% Triton X-100 dans PBS) pendant 5 min et laver avec du PBS.
   1. Utiliser 5% de BSA dilué dans du PBS pendant 45 min pour permettre le blocage, puis incuber avec un anticorps anti-MAP2, dilué à 1:800 dans une solution bloquante, à 4 °C pendant une nuit.
   2. À la fin du temps d’incubation, laver deux fois avec PBS et incuber avec un anticorps secondaire (Tableau des matériaux) pendant 1 h. Ensuite, lavez les cellules avec du PBS et montez les verres sur des lames à l’aide d’un support de montage aqueux (Table of Materials).

5. Analyse de l’atrophie des neurites

1. Obtenez des images avec une lentille à air 20x (NA 0,8) à l’aide d’un microscope inversé par épifluorescence équipé d’une caméra CCD. Analysez des images avec des plug-ins ImageJ. Pour cela, chargez l’image dans ImageJ et soustrayez l’arrière-plan en cliquant sur Processus | Soustrayez l’arrière-plan.
2. Cliquez sur l’image | Ajuster | Seuil ou tapez les touches suivantes : Ctrl (ou Cmd) + Maj + T. Une fenêtre s’ouvre pour ajuster les valeurs minimales, ce qui permet de distinguer les tracés de chemin et de soma. Cliquez sur l’image binaire (les neurites et les somas sont de couleur blanche). Sur cette image, utilisez la sélection à main levée pour supprimer les somas ; La zone SOMA sélectionnée redevient noire.
3. Sélectionnez les traces et cliquez sur Modifier | Sélection | Créer une sélection. Obtenez le retour sur investissement en cliquant sur les touches Ctrl (ou Cmd) et T de la sélection et conservez-le. Ouvrez l’image originale, puis cliquez sur le panneau du gestionnaire de ROI et sélectionnez le ROI d’appartenance, précédemment obtenu. Cliquez ensuite sur l’image originale.
4. Une fois le retour sur investissement tracé sur l’image, tapez les touches Ctrl (ou Cmd) et M (Analyser | mesure). Une fenêtre s’ouvre; Copier la valeur moyenne (unités arbitraires a.u.) pour traiter l’analyse statistique.
   REMARQUE: Pour obtenir des valeurs en μm, cliquez sur Analyser | Définir l’échelle. Une fenêtre s’ouvre pour définir des valeurs. Veillez à ajouter la bonne échelle (Analyser | Set Scale) en fonction des caractéristiques du microscope utilisé.

Résultats

Ici, nous abordons la question de savoir si le silence de deux composants PERK en aval affecte la phase de transition de l’UPR dans un modèle de cellule de contrainte ER. Pour ce faire, nous faisons taire le gène CN-Aα ainsi que le gène CHOP par deux séquences shRNA spécifiques pour chacune (Tableau 1) en culture cellulaire de neurones primaires pendant 1 jour¹⁰. L’expression est analysée par Western blot (Figure 1 et

Discussion

Nous décrivons un système expérimental qui permet la modulation moléculaire de la transition des phases de survie aux phases UPR apoptotiques dans un modèle cellulaire neuronal.

Pour une analyse correcte de l’atrophie des neurites, il est essentiel d’obtenir des cultures de neurones primaires avec de nombreux processus longs et très ramifiés ^9,11. Cela facilite l’examen de l’extension du processus neuronal, ce qui permet...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 488 anti-Mouse	Thermo Fisher Scientific	#R37120
anti-CHOP	Thermo Fisher	# MA1 - 250
Anti-CN-Aα	Millipore	# 07-067
Anti-GM2	Matreya	#1961
anti-MAP2	Sigma Aldrich	# M2320
anti-β-actin	Thermo Fisher	# PA1 - 183
aprotinin	Santa Cruz Biotechnology	#3595
Axiovert 200 epifluorescence microscope	Zeiss
B27 supplement	Life Technologies	#17504944
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	Life Technologies	#11966025
EcoRI	Promega	#R6011
Fetal Calf Serum (FCS)	Life Technologies	#16000044
Fine-tippeds forceps  style #5	Dumont
Forcep style #3	Dumont
HEK 293	ATCC	#CRL-1573
IRDye 680 CW secondary antibody	LI-COR Biosciences	#92632221
IRDye 680 secondary antibody	LI-COR Biosciences	#92632220
IRDye 800 CW secondary antibody	LI-COR Biosciences	#92632210
IRDye 800 CW secondary antibody	LI-COR Biosciences	#92632211
lentiviral envelope plasmid pMD2.G	Addgene	#12259
lentiviral packing plasmid psPAX2	Addgene	#12260
lentiviral vector pLKO.3G	Addgene	#14748
Leupeptin hemisulfate	Santa Cruz Biotechnology	#295358
Lipofectamine LTX & Plus Reagent (plasmid transfection reagent)	Life Technologies	#A12621
MISSION shRNA	Sigma Aldrich
Monosialoganglioside GM2	Matreya	#1502
NanoDrop 2000	Thermo Scientific
Neurobasal Medium	Life Technologies	#21103049
Nitrocellulose membrane 0.45 µm	BIO-RAD	#1620115
Odyssey infrared imaging system	LI-COR Bioscience
OneShot Top 10	Life Technology	#C404010
Opti-MEM (Reduced serum media)	Life Technologies	#105802
PacI	BioLabs	#R0547S
penicillin-streptomycin	Life Technologies	#15140122
Pepstatin A	Santa Cruz Biotechnology	#45036
phenylmethylsulfonyl fluoride	Santa Cruz Biotechnology	#329-98-6
Poly-L-lysine	sigma aldrich	P#2636
Straight sharp small spring scissors	Fine Science Tools
T4 DNA Ligase	Promega	#M1801
Trypsin-EDTA 0.25 %	Life Technologies	#25200056
Vibra-Cell Ultrasonic Liquid Processor (VCX 130)	Sonics
Wizard plus SV Minipreps DNA purification system	Promega	#A1330