Modulação molecular por shRNAs específicos entregues por lentivírus em neurônios estressados do retículo endoplasmático

Resumo

No presente estudo, a expressão é derrubada de dois componentes sinalizadores a jusante da via PERK, a calcineurina citoprotetora e o CHOP pró-apoptótico, utilizando shRNAs específicos. De maneiras opostas, eles modulam a suscetibilidade dos neurônios corticais primários à atrofia da neurite após a indução do estresse do retículo endoplasmático.

Resumo

O acúmulo de proteínas desdobradas dentro do retículo endoplasmático (RE), causado por qualquer condição de estresse, desencadeia a resposta proteica desdobrada (UPR) através da ativação de sensores especializados. UPR tenta primeiro restaurar a homeostase; mas se o dano persistir, a sinalização induz a apoptose.

Há evidências crescentes de que o estresse ER sustentado e não resolvido contribui para muitas condições patológicas, incluindo doenças neurodegenerativas. Como a RPU controla o destino celular alternando entre processos citoprotetores e apoptóticos, é essencial entender os eventos que definem essa transição, bem como os elementos envolvidos em sua modulação.

Recentemente, demonstramos que o acúmulo anormal de gangliosídeos GM2 causa o esgotamento do conteúdo de ER Ca²⁺ , que por sua vez ativa a PERK (PKR-like-ER quinase), um dos sensores UPR. Além disso, a sinalização PERK participa da atrofia neurítica e da apoptose induzida pelo acúmulo de GM2. A este respeito, estabelecemos um sistema experimental que nos permite modular molecularmente a expressão de componentes PERK a jusante e, assim, alterar a vulnerabilidade dos neurônios para sofrer atrofia neurítica.

Realizamos knockdown da expressão de calcineurina (citoprotetora) e CHOP (pró-apoptótica) em culturas neuronais corticais de ratos. As células foram infectadas com shRNA específico entregue por lentivírus e, em seguida, tratadas com GM2 em diferentes momentos, fixadas e imunocoradas com anticorpo anti-MAP2 (proteína 2 associada a microtubos). Posteriormente, as imagens celulares foram registradas usando um microscópio de fluorescência e o crescimento total de neuritos foi avaliado usando o software de processamento de imagens de domínio público ImageJ. A inibição da expressão desses componentes de sinalização PERK claramente tornou possível acelerar ou retardar a atrofia neurítica induzida pelo estresse do RE.

Essa abordagem pode ser usada em modelos de sistema celular de estresse de RE para avaliar a vulnerabilidade dos neurônios à atrofia de neuritos.

Introdução

O estresse do retículo endoplasmático (RE) é definido como qualquer perturbação que comprometa a capacidade de dobramento de proteínas na organela. O acúmulo de proteínas desdobradas dentro do lúmen do ER ativa um sinal de cascata de transdução chamado resposta proteica desdobrada (UPR). Esta via de sinalização complexa é orquestrada por três sensores de estresse: PERK (proteína quinase RNA [PKR]-like ER quinase), IRE1 (enzima 1 que requer inositol) e ATF6 (fator de transcrição ativado 6). Todos juntos tentam restaurar a homeostase. Mas se o estresse persistir, a RPU eventualmente induz a morte celular por apoptose¹.

PERK, uma proteína transmembrana de RE, sob estresse de RE, lidera a fosforilação do fator de iniciação eucariótico-2 alfa (eIF2α), reduzindo a síntese proteica global e, portanto, a carga proteica no RE². Demonstramos que a calcineurina A/B (CNA/B), um heterodímero Ca²⁺ fosfatase, liga-se diretamente ao domínio citosólico da PERK, aumentando sua autofosforilação e aumentando significativamente a inibição da tradução de proteínas e a viabilidade celular ^3,4. Curiosamente, o CNA/B é abundante no cérebro de mamíferos, distinguindo duas isoformas da subunidade A do CN: α e β.

Sob estresse sustentado do RE, a via de sinalização PERK é o único ramo UPR que permanece ativado, mediando assim tanto a resposta pró-sobrevivência quanto a resposta apoptótica. Na fase crônica, um dos principais eventos a jusante é a indução do fator de transcrição, CHOP (CCAAT/enhancer binding protein homóloga protein)⁵. O estresse crônico do RE também é cada vez mais reconhecido como um contribuinte comum para uma extensa gama de distúrbios patológicos, incluindo doenças neurodegenerativas⁶. É importante compreender como a RPU pode facilitar a sinalização citoprotetora em vez da morte celular ⁷. No entanto, atualmente pouco se sabe sobre o mecanismo exato que controla a transição entre essas duas fases da RPU.

Recentemente, descobrimos que, em neurônios cultivados, o gangliosídeo GM2 se acumula nas membranas do RE e induz a depleção de cálcio luminal. Isso, por sua vez, ativa a sinalização PERK, que medeia a atrofia neurítica e a apoptose ⁸. Neste estudo, o acúmulo de GM2 em neurônios cultivados é usado como um modelo de sistema celular de atrofia de neurite induzida por estresse de ER. Especificamente, duas expressões do fator PERK são manipuladas, CN-Aα e CHOP, o que alterna a transição entre eventos precoces/protetores e uma fase crônica/apoptótica. Para conseguir isso, os respectivos genes são silenciados; assim, as culturas primárias de neurônios corticais são infectadas com shRNA específico entregue por lentivírus. A análise de Western blot revela uma redução significativa dos níveis de expressão de CN-Aα e CHOP em comparação com as células de controle, que estão infectadas com lentivírus que carregam um shRNA embaralhado. Após esse tratamento, os neurônios são submetidos a diferentes tempos de incubação de GM2 exógeno, fixo e imunocorado com anticorpo anti-proteína 2 associada a microtúbulos (MAP2)⁹. As imagens são obtidas com um microscópio de epifluorescência. O crescimento total de neuritos é avaliado em relação ao número total de células.

Protocolo

Os procedimentos animais são realizados seguindo protocolos aprovados pelo Instituto Nacional de Saúde Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. A aprovação para a realização do estudo é concedida pelo Comitê de Ética e Cuidado Animal (CICUAL) do INIMEC-CONICET-UNC (Resoluções nºs 014/2017 B e 006/2017 A).

1. Culturas primárias de neurônios corticais de ratos

1. Anestesiar ratas E18 Wistar prenhes em uma câmara de CO 2 com uma mistura de 80% de CO₂ /₂₀% O₂ por 60 s de exposição e, em seguida, sacrificar as vértebras cervicais.
2. Execute as etapas a seguir em um exaustor de fluxo laminar. Extraia o encéfalo dos embriões com um estilo de pinça # 3 e tesoura de mola pequena afiada reta (Tabela de Materiais) para solução de Hanks em pratos de cultura de células.
3. Dissecar o tecido sob lupa de 20x, usando duas pinças de ponta fina estilo # 5, separando o córtex frontal das meninges. Transfira o córtex frontal para um tubo cônico de 15 mL e incube o tecido com 3-4 mL de tripsina-EDTA (0,25%) por 15 min, a 37 °C para digestão química.
4. Após a digestão, dilua-o com 3-4mL de meio águia modificado (DMEM) da Dulbecco mais 10% de soro fetal de bezerro (FCS). Em seguida, lave-o 3 vezes com Ca²+/Mg²⁺ solução livre de Sal Balanceado de Hanks e glicose a 0,1% por centrifugação (3000 g por 5 min).
5. Dissociar mecanicamente o tecido 10 vezes pipetando para cima e para baixo usando uma ponta de 1000 μL, em DMEM mais 10% FCS (Tabela de Materiais). Em seguida, centrifugar o homogeneizado a 100 x g por 1 min, coletar o sobrenadante e completar o volume restante a 1000 μL.
6. Chapear a suspensão celular em placas de cultura celular a uma densidade de 520 células/mm 2 com² ml de DMEM contendo 10% de FCS, 1% de penicilina/estreptomicina e 1% de um aditivo de aminoácidos essenciais (ver Tabela de Materiais). Em seguida, incubar a 37 °C em ambiente umidificado com 5% de CO 2 por₂ h.
   1. Remoção de matéria orgânica e revestimento de poli-L-lisina de placas de cultura celular
      1. Remova a matéria orgânica colocando o material de vidro em uma câmara de reação e adicione 96% de álcool etílico para cobrir o material. Em seguida, adicione 68% (p/v) de ácido nítrico gota a gota até que bolhas acastanhadas-esverdeadas comecem a aparecer. Quando isso acontecer, cubra parcialmente o recipiente e permita que a reação continue até que a explosão cesse.
         NOTA: Remova a matéria orgânica sob uma cabine de extração de gás para evitar a exposição a gases nocivos.
      2. Antes do revestimento de poli-L-lisina, lave os copos com água Mili-Q estéril cerca de dez vezes. Em seguida, incube os copos e pratos de cultura com 0,1 μg/μL de poli-L-lisina por 4 h antes de usá-los. Após a incubação, lave os copos com água Mili-Q estéril cerca de dez vezes.
7. Para permitir a diferenciação das células neurais, troque o meio por um meio neurobasal livre de soro, com o suplemento sem soro (Tabela de Materiais). Manter as culturas a 37 °C com 5% de CO₂ até ao tratamento.

2. Produção de lentivírus

NOTA: Os oligonucleótidos que contêm as sequências que visam as 3'UTRs da isoforma CN-Aα ou CHOP e com as sequências não direcionadas (scrambles) estão listados na Tabela 1.

1. Para o recozimento, misture dois oligonucleotídeos de fita simples com sequências complementares em quantidades molares iguais, usando tampão de recozimento (10 mM Tris-HCl, pH 7,5-8,0, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA).
2. Aquecer a 95 °C durante 2 min e, em seguida, arrefecer lentamente, transferindo amostras do bloco de calor ou do banho-maria para uma bancada à temperatura ambiente. Diluir o produto resultante [ARN de hairpin curto (shRNA) com extremidades coesivas] até uma concentração final de 0,5 μM, alíquota e conservar a -20 °C.
3. Clone a inserção de shRNA no vetor lentiviral pLKO.3G, com GFP como marcador fluorescente verde. Para isso, digerir 1 μg de vetor com as enzimas de restrição EcoRI e PacI misturando o seguinte em um tubo estéril: 2 μL de tampão enzimático de restrição de 10x (100 mM bis-Tris propano-HCl, pH 6,5, 100 mM MgCl₂, 1 mg/mL de albumina sérica bovina), 1 μL de 1 μg/μL pLKO.3G, 0,5 μL de 10 U/μL ECoRI, 0,5 μL de PacI (10 U/μL) e 16 μL de água ionizada estéril.
   1. Misture suavemente por pipetagem. Incubar a reacção durante 3-4 h a 37 °C.
      NOTA: As digestão durante a noite são geralmente desnecessárias e podem resultar em degradação do DNA.
4. Para a ligadura, misturar o vector digerido e introduzir numa proporção molar de 3:1 e incubá-lo com a ligase T4 e o tampão ligase (fornecidos pelo fabricante) durante a noite a 16 °C.
   NOTA: Neste ponto, a reacção de ligadura pode ser armazenada a 4 °C até nova utilização.
5. Transformar células competentes DH5α (Tabela de Materiais) ou outra cepa de E. coli adequada com a seguinte reação de ligadura.
   1. Misture a E. coli competente com o volume total da reacção de ligadura e arrefeça-a no gelo durante 15 min, coloque-a num banho de 42 °C durante 2 min e depois arrefeça-a novamente no gelo durante 15 min.
   2. Transferir o volume total submetido a choque térmico para um tubo de 15 ml e completar o volume para 1000 μL com meio líquido Luria-Bertani (LB) previamente mantido a 37 °C. Agitar as bactérias durante 90 minutos a 37 °C num agitador orbital a aproximadamente 330 rpm.
   3. Centrifugar-os a 5.000 x g durante 5 min a 4 °C e eliminar 900 μL de sobrenadante. Use o sobrenadante restante para ressuspender o pellet. Espalhe a suspensão de bactérias uniformemente sobre uma placa LB sólida de ampicilina (100 μg/mL).
   4. Incubar a 37 °C durante a noite e, em seguida, verificar o crescimento bacteriano. Neste ponto, as bactérias podem ser armazenadas a 4 °C por 4-5 dias.
   5. Escolha uma única colônia para transferir para um tubo de 50 mL com 10 mL de meio líquido LB e ampicilina (100 μg/mL). Agitar as bactérias ON a 37 °C a aproximadamente 330 rpm.
   6. Centrifugar a cultura para peletizar as bactérias a 5.000 x g durante 5 min a 4 °C, eliminar o sobrenadante e conservar o pellet bacteriano. Este pode ser armazenado a -20 °C.
6. Purifice o plasmídeo com um kit de purificação de DNA de pellets de bactérias seguindo as instruções do fabricante (Tabela de Materiais). Calcular a concentração de ADN medindo a absorvância a 260 nm e multiplicando pelo factor de diluição, utilizando a seguinte relação: A₂₆₀ de 1,0 = 50 μg/ml de ADN de fita dupla pura (ds).

3. Infecção por Lentivirus

NOTA: Execute o procedimento de geração de lentivírus em um exaustor de fluxo laminar Classe II.

1. 24 h antes da transfecção, a semente 1-5 × 10⁶ células HEK 293 em placas de cultura de 100 mm de diâmetro em 8 mL de meio de crescimento e incubá-las a 37 °C, 5% de CO₂ durante a noite.
2. Misture 14 μg de vetor pKLO.3G com inserção específica, 10,5 μg de plasmídeo de embalagem psPAX e 3,5 μg de plasmídeo de envelope pMD2.G (Tabela de Materiais). Diluir 45 μL de reagente de transfecção plasmídica (Tabela de Materiais) em 700 μL de meio sérico reduzido (Tabela de Materiais) e incubar por 5 min à temperatura ambiente. Em seguida, combine a mistura de DNA com o reagente de transfecção de plasmídeo diluído, misture suavemente e incube por 20 minutos à temperatura ambiente.
3. Enquanto isso, mudar para DMEM fresco o meio do prato de cultura de culturas de células HEK 293 (70% confluente no momento da transfecção). Em seguida, adicione todo o volume da solução de DNA gota a gota. Agite o prato suavemente. Não é necessário adicionar/trocar o meio após a transfecção.
4. Incubar as células a 37 °C, 5% de CO₂ durante 48 h-72 h para permitir que os shRNAs atinjam a sua transdução óptima verificada por fluorescência de GFP utilizando um microscópio de fluorescência. Depois, recolher o meio com lentivírus e conservar a 4 °C.
5. Sobrenadante viral filtrado com membrana de nylon de 0,45 μm. Aliquotar o fluxo-através em 1 mL. Em seguida, centrifugar a 17.000 x g por 4 h. Descarte o sobrenadante e conserve o pellet. Deixe o pellet invisível secar e, uma vez seco, armazene a - 80 °C.
   1. Realizar titulação viral por citometria de fluxo. Semear 4 x 10⁵ células HEK 293 em placas de 24 poços e incubar a 37 °C por 24 h. Em seguida, ressuscite as partículas virais em 200 μL de meio de cultura DMEM (Tabela de Materiais) e adicione 0,05, 0,02 e 0,005 μL a cada poço.
   2. Incubar a infecção viral por 72 h, remover o meio e tripsinizar (tripsina a 0,05%, 1 mL) por 3 min. Adicionar 1 mL de DMEM em solução FCS a 10% e centrifugar a 500 x g por 5 min. Descarte o sobrenadante e lave o pellet duas vezes com PBS.
   3. Ressuscite o pellet com 100 μL de PBS e fixe as células com 100 μL de paraformaldeído a 2% (PFA) em PBS. Analise as células com um citômetro de fluxo e determine a porcentagem de células fluorescentes GFP. Colete esses dados para calcular a titulação viral usando a seguinte fórmula:
      Titulação Viral
      

4. Culturas primárias de neurônios estressadas com acúmulo de gangliosídeos GM2 e imunocitoquímica usando anticorpo anti-MAP2

1. Infectar as culturas de neurônios corticais primários (15 dias in vitro) com oligonucleotídeos específicos de shRNA visando as UTRs de 3' de CN-Aα ou CHOP e incubá-las a 37 °C com 5% de CO₂ por 1 dia.
   NOTA: Culturas primárias de neurônios corticais de 7-8 dias in vitro também podem ser usadas se as células apresentarem alto crescimento de neurites.
   1. Preparar uma solução-mãe de 500 μM de gangliosídeo GM2 em etanol e sonicá-la por 1 h.
   2. Adicionar a solução-mãe GM2 ao meio dos pratos de cultura a uma concentração final de 2 μM. Deixar incubar a 37 °C com 5% de CO₂ durante 16, 24 e 48 h.
2. Use algumas culturas para preparar o homogeneizado celular para análise de western blot (para especificação de anticorpos, consulte a Tabela de Materiais).
3. Siga os passos 1.4. e 1.5. e, em seguida, fixar as células com PFA a 4% e sacarose a 120 mM em PBS por 20 min a 37 °C e, em seguida, lavá-las com PBS. Realize este procedimento em uma membrana antiderrapante em uma câmara úmida. Posteriormente, adicionar solução de permeabilização (Triton X-100 a 0,2% em PBS) por 5 min e lavar com PBS.
   1. Use BSA a 5% diluído em PBS por 45 min para permitir o bloqueio, em seguida, incubar com anticorpo anti-MAP2, diluído 1:800 em solução de bloqueio, a 4 °C durante a noite.
   2. Ao final do tempo de incubação, lavar duas vezes com PBS e incubar com anticorpo secundário (Tabela de Materiais) por 1 h. Em seguida, lave as células com PBS e monte os óculos em lâminas usando um meio de montagem aquoso (Tabela de Materiais).

5. Análise da atrofia neurítica

1. Obtenha imagens com uma lente de ar de 20x (NA 0,8) usando um microscópio invertido de epifluorescência equipado com uma câmera CCD. Analise imagens com plug-ins ImageJ. Para isso, carregue a imagem no ImageJ e subtraia o plano de fundo clicando em Processo | Subtraia o plano de fundo.
2. Clique na imagem | Ajustar | Limite ou digite as seguintes teclas: Ctrl (ou Cmd) + Shift + T. Uma janela se abre para ajustar os valores mínimos, permitindo que os traçados de caminho e soma sejam distinguíveis. Clique na imagem binária (neurites e somas são de cor branca). Nesta imagem, use a seleção à mão livre para excluir somas; a área do soma selecionada fica preta novamente.
3. Selecione rastreamentos e clique em Editar | Seleção | Criar seleção. Obtenha o ROI clicando nas teclas Ctrl (ou Cmd) e T da seleção e conserve-o. Abra a imagem original, clique no painel do gerenciador de ROI e selecione o ROI correspondente, obtido anteriormente. Em seguida, clique na imagem original.
4. Depois que o ROI for rastreado na imagem, digite Ctrl (ou Cmd) e as teclas M (Analisar | Medida). Uma janela se abre; copiar o valor médio (unidades arbitrárias a.u.) para processar a análise estatística.
   NOTA: Para obter valores como μm, clique em Analisar | Definir escala. Uma janela aparece aberta para definir valores. Certifique-se de adicionar a escala correta (Analisar | Set Scale) dependendo das características do microscópio utilizado.

Resultados

Aqui, abordamos a questão de saber se o silenciamento de dois componentes PERK a jusante afeta a fase de transição da UPR em um modelo de célula de estresse ER. Para conseguir isso, silenciamos o gene CN-Aα, bem como o gene CHOP por duas sequências específicas de shRNA para cada um (Tabela 1) em cultura de células de neurônios primários por 1 dia¹⁰. A expressão é analisada por Western blotting (Figura 1 e

Discussão

Descrevemos um sistema experimental que permite a modulação molecular da transição das fases de sobrevida para UPR apoptótica em um modelo celular neuronal.

Para uma análise adequada da atrofia neurítica, é essencial a obtenção de culturas primárias de neurônios com processos numerosos, longos e altamente ramificados ^9,11. Isso facilita o exame da extensão do processo dos neurônios, permitindo que as diferenças claras en...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 488 anti-Mouse	Thermo Fisher Scientific	#R37120
anti-CHOP	Thermo Fisher	# MA1 - 250
Anti-CN-Aα	Millipore	# 07-067
Anti-GM2	Matreya	#1961
anti-MAP2	Sigma Aldrich	# M2320
anti-β-actin	Thermo Fisher	# PA1 - 183
aprotinin	Santa Cruz Biotechnology	#3595
Axiovert 200 epifluorescence microscope	Zeiss
B27 supplement	Life Technologies	#17504944
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	Life Technologies	#11966025
EcoRI	Promega	#R6011
Fetal Calf Serum (FCS)	Life Technologies	#16000044
Fine-tippeds forceps  style #5	Dumont
Forcep style #3	Dumont
HEK 293	ATCC	#CRL-1573
IRDye 680 CW secondary antibody	LI-COR Biosciences	#92632221
IRDye 680 secondary antibody	LI-COR Biosciences	#92632220
IRDye 800 CW secondary antibody	LI-COR Biosciences	#92632210
IRDye 800 CW secondary antibody	LI-COR Biosciences	#92632211
lentiviral envelope plasmid pMD2.G	Addgene	#12259
lentiviral packing plasmid psPAX2	Addgene	#12260
lentiviral vector pLKO.3G	Addgene	#14748
Leupeptin hemisulfate	Santa Cruz Biotechnology	#295358
Lipofectamine LTX & Plus Reagent (plasmid transfection reagent)	Life Technologies	#A12621
MISSION shRNA	Sigma Aldrich
Monosialoganglioside GM2	Matreya	#1502
NanoDrop 2000	Thermo Scientific
Neurobasal Medium	Life Technologies	#21103049
Nitrocellulose membrane 0.45 µm	BIO-RAD	#1620115
Odyssey infrared imaging system	LI-COR Bioscience
OneShot Top 10	Life Technology	#C404010
Opti-MEM (Reduced serum media)	Life Technologies	#105802
PacI	BioLabs	#R0547S
penicillin-streptomycin	Life Technologies	#15140122
Pepstatin A	Santa Cruz Biotechnology	#45036
phenylmethylsulfonyl fluoride	Santa Cruz Biotechnology	#329-98-6
Poly-L-lysine	sigma aldrich	P#2636
Straight sharp small spring scissors	Fine Science Tools
T4 DNA Ligase	Promega	#M1801
Trypsin-EDTA 0.25 %	Life Technologies	#25200056
Vibra-Cell Ultrasonic Liquid Processor (VCX 130)	Sonics
Wizard plus SV Minipreps DNA purification system	Promega	#A1330