Молекулярная модуляция доставляемыми лентивирусом специфическими шРНК в нейронах, подверженных стрессу эндоплазматического ретикулума

Резюме

В настоящем исследовании экспрессия сбивается двумя нисходящими сигнальными компонентами пути PERK, цитопротекторным кальциневрином и проапоптотическим CHOP, с использованием специфических шРНК. Противоположным образом, они модулируют восприимчивость первичных корковых нейронов к атрофии нейритов после индукции стресса эндоплазматического ретикулума.

Аннотация

Накопление развернутых белков в эндоплазматическом ретикулуме (ER), вызванное любым стрессовым состоянием, вызывает реакцию развернутого белка (UPR) посредством активации специализированных датчиков. УПО пытается сначала восстановить гомеостаз; Но если повреждение сохраняется, передача сигналов вызывает апоптоз.

Появляется все больше доказательств того, что устойчивый и неразрешенный стресс ER способствует развитию многих патологических состояний, включая нейродегенеративные заболевания. Поскольку UPR контролирует судьбу клеток, переключаясь между цитопротекторными и апоптотическими процессами, важно понимать события, определяющие этот переход, а также элементы, участвующие в его модуляции.

Недавно мы продемонстрировали, что аномальное накопление ганглиозидов GM2 вызывает истощение содержания ER^{Ca 2+} , что, в свою очередь, активирует PERK (PKR-подобную киназу ER), один из датчиков UPR. Кроме того, передача сигналов PERK участвует в атрофии нейритов и апоптозе, вызванных накоплением GM2. В связи с этим мы создали экспериментальную систему, которая позволяет нам молекулярно модулировать экспрессию нижестоящих компонентов PERK и, таким образом, изменять уязвимость нейронов к нейритной атрофии.

Мы выполнили нокдаун экспрессии кальциневрина (цитопротекторного) и CHOP (проапоптотического) в культурах нейронов коры крыс. Клетки инфицировали доставляемой лентивирусом специфической шРНК, а затем обрабатывали GM2 в разное время, фиксировали и иммуноокрашивали антителом против MAP2 (микротрубка-ассоциированный белок 2). Позже изображения клеток были записаны с помощью флуоресцентного микроскопа, а общий рост нейрита был оценен с помощью общедоступного программного обеспечения для обработки изображений ImageJ. Ингибирование экспрессии этих сигнальных компонентов PERK явно позволяло либо ускорить, либо отсрочить нейритную атрофию, вызванную стрессом ER.

Этот подход может быть использован в моделях клеточной системы стресса ER для оценки уязвимости нейронов к атрофии нейритов.

Введение

Стресс эндоплазматического ретикулума (ER) определяется как любое возмущение, которое ставит под угрозу способность сворачивать белок в органелле. Накопление развернутых белков в просвете ER активирует сигнал каскада трансдукции, называемый развернутым белковым ответом (UPR). Этот сложный сигнальный путь управляется тремя датчиками стресса: PERK (протеинкиназная РНК [PKR]-подобная ER-киназа), IRE1 (инозитол-требующий фермент 1) и ATF6 (активированный транскрипционный фактор 6). Все вместе пытаются восстановить гомеостаз. Но если стресс сохраняется, UPR в конечном итоге вызывает гибель клеток путем апоптоза¹.

PERK, трансмембранный белок ER, при стрессе ER приводит к фосфорилированию эукариотического фактора инициации-2 альфа (eIF2α), снижая глобальный синтез белка и, следовательно, белковую нагрузку в ER². Показано, что кальциневрин A/B (CNA/B), гетеродимерная фосфатаза^Ca2+, непосредственно связывает цитозольный домен PERK, увеличивая его аутофосфорилирование и значительно усиливая ингибирование трансляции белка и жизнеспособность клеток ^3,4. Интересно, что CNA/B в изобилии встречается в мозге млекопитающих, различая две изоформы субъединицы A CN: α и β.

При длительном стрессе ER сигнальный путь PERK является единственной ветвью UPR, которая остается активированной, тем самым опосредуя как выживаемость, так и апоптотическую реакцию. В хронической фазе одним из основных последующих событий является индукция фактора транскрипции, CHOP (гомологичный белок, связывающий CCAAT/энхансер)⁵. Хронический стресс ER также все чаще признается в качестве общего фактора, способствующего широкому спектру патологических расстройств, включая нейродегенеративные заболевания⁶. Важно понять, как УПО может способствовать цитопротекторной передаче сигналов вместо гибели клеток ⁷. Однако в настоящее время мало что известно о точном механизме, контролирующем переход между этими двумя фазами УПО.

Недавно мы обнаружили, что в культивируемых нейронах ганглиозид GM2 накапливается в мембранах ER и индуцирует истощение кальция в просвете. Это, в свою очередь, активирует передачу сигналов PRK, которая опосредует атрофию нейритов и апоптоз ⁸. В этом исследовании накопление GM2 в культивируемых нейронах используется в качестве модели клеточной системы атрофии нейритов, вызванной стрессом ER. В частности, манипулируются двумя экспрессиями фактора PERK, CN-Aα и CHOP, которые переключают переход между ранними/защитными событиями и хронической/апоптотической фазой. Для этого соответствующие гены заглушаются; таким образом, первичные культуры корковых нейронов инфицируются доставляемой лентивирусом специфической шРНК. Вестерн-блоттинг выявляет значительное снижение уровней экспрессии CN-Aα и CHOP по сравнению с контрольными клетками, инфицированными лентивирусом, несущим скремблированную шРНК. После этого лечения нейроны подвергаются различным инкубационным периодам экзогенного GM2, фиксированного и иммуноокрашенного антителом 9 к ассоциированному белку 2 (MAP2)^{против микротрубочек}. Изображения получаются с помощью эпифлуоресцентного микроскопа. Общий рост нейрита оценивается по отношению к общему количеству клеток.

протокол

Процедуры на животных выполняются в соответствии с утвержденными протоколами Руководства Национального института здравоохранения по уходу и использованию лабораторных животных. Разрешение на проведение исследования выдается Комитетом по уходу за животными и этике (CICUAL) INIMEC-CONICET-UNC (резолюции No 014/2017 B и 006/2017 A).

1. Первичные культуры нейронов коры крысы

1. Анестезируйте беременных крыс E18 Wistar в камере CO 2 смесью 80% CO 2/20% O ₂ в течение 60 с воздействия, а затем жертвуйте, затем вывихивая шейные позвонки.
2. Выполните следующие действия в вытяжном шкафу с ламинарным потоком. Извлеките головной мозг из эмбрионов с помощью щипцов #3 и прямых острых маленьких пружинных ножниц (Таблица материалов) для раствора Хэнкса в чашках для клеточных культур.
3. Рассеките ткань под 20-кратным увеличительным стеклом, используя два щипца с тонким наконечником в стиле #5, отделяющих лобную кору от мозговых оболочек. Перенесите лобную кору в коническую трубку объемом 15 мл и инкубируйте ткань с 3-4 мл трипсина-ЭДТА (0,25%) в течение 15 минут при 37 ° C для химического разложения.
4. После пищеварения разбавьте его 3-4 мл модифицированной орлиной среды Дульбекко (DMEM) плюс 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FCS). Затем промойте его 3 раза раствором сбалансированной соли Хэнкса без Ca 2+/Mg²⁺ и 0,1% глюкозы центрифугированием (3000 г в течение 5 мин).
5. Механически диссоциируйте ткань 10 раз, пипеткой вверх и вниз с помощью наконечника 1000 мкл в DMEM плюс 10% FCS (таблица материалов). Затем центрифугируют гомогенат при 100 х г в течение 1 мин, собирают надосадочную жидкость и заполняют оставшийся объем до 1000 мкл.
6. Планшет клеточной суспензии на чашках для клеточных культур плотностью 520 клеток/мм 2 с² мл DMEM, содержащего 10% FCS, 1% пенициллина/стрептомицина и 1% незаменимой аминокислотной добавки (см. Таблицу материалов). Затем инкубировать при 37 °C в увлажненной среде с 5%_CO2 в течение 2 ч.
   1. Удаление органических веществ и поли-L-лизиновое покрытие чашек для культивирования клеток
      1. Удалите органическое вещество, поместив стеклянный материал в реакционную камеру и добавив 96% этилового спирта, чтобы покрыть материал. Затем добавляйте 68% (мас./об.) азотной кислоты по каплям, пока не начнут появляться коричневато-зеленоватые пузырьки. Как только это произойдет, частично накройте контейнер и дайте реакции продолжаться до тех пор, пока взрыв не прекратится.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Удалите органические вещества под кабиной для вытяжки газа, чтобы избежать воздействия вредных газов.
      2. Перед нанесением поли-L-лизинового покрытия промойте стаканы стерильной водой Mili-Q около десяти раз. Затем инкубируют культуральные стаканы и чашки с 0,1 мкг/мкл поли-L-лизина в течение 4 ч перед использованием. После инкубации ополосните стаканы стерильной водой Mili-Q около десяти раз.
7. Чтобы обеспечить дифференцировку нервных клеток, замените среду на нейробазальную среду без сыворотки с добавкой без сыворотки (таблица материалов). Хранить культуры при температуре 37 °C с содержанием_СО2 5% до обработки.

2. Производство лентивирусов

ПРИМЕЧАНИЕ: Олигонуклеотиды, содержащие последовательности, нацеленные на 3'UTRs изоформы CN-Aα или CHOP, и с нецелевыми последовательностями (скремблами), перечислены в таблице 1.

1. Для отжига смешайте два одноцепочечных олигонуклеотида с комплементарными последовательностями в равных молярных количествах, используя буфер для отжига (10 мМ Tris-HCl, pH 7,5-8,0, 50 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА).
2. Нагрейте при 95 °C в течение 2 минут, а затем медленно охладите, перенеся образцы из нагревательного блока или водяной бани на столешницу при комнатной температуре. Разбавьте полученный продукт [короткую шпилечную РНК (шРНК) с когезионными концами] до конечной концентрации 0,5 мкМ, аликвотируйте их и храните при -20 °C.
3. Клонируйте вставку шРНК в лентивирусный вектор pLKO.3G с GFP в качестве зеленого флуоресцентного маркера. Для этого переваривают 1 мкг вектора с ферментами рестрикции EcoRI и PacI, смешивая в стерильной пробирке следующее: 2 мкл 10-кратного буфера рестрикционного фермента (100 мМ бис-трис пропана-HCl, рН 6,5, 100 мМ MgCl₂, 1 мг/мл бычьего сывороточного альбумина), 1 мкл 1 мкг/мкл pLKO.3G, 0,5 мкл 10 ЕД/мкл ECoRI, 0,5 мкл PacI (10 ЕД/мкл) и 16 мкл стерильной ионизированной воды.
   1. Аккуратно перемешайте пипеткой. Инкубировать реакцию в течение 3-4 ч при 37 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ночные пищеварения, как правило, не нужны и могут привести к деградации ДНК.
4. Для лигирования смешайте переваренный вектор и вставьте в молярном соотношении 3:1 и инкубируйте его с лигазой Т4 и буфером лигазы (предоставленными производителем) в течение ночи при 16 ° C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе реакцию лигирования можно хранить при температуре 4 °C до дальнейшего использования.
5. Трансформируют DH5α компетентные клетки (таблица материалов) или другой подходящий штамм E. coli с реакцией лигирования следующим образом.
   1. Смешайте компетентную кишечную палочку с общим объемом реакции лигирования и охладите ее на льду в течение 15 минут, поместите в ванну с температурой 42 ° C на 2 минуты, а затем снова охладите ее на льду в течение 15 минут.
   2. Перенесите весь объем, подвергшийся тепловому удару, в пробирку объемом 15 мл и дополните объем до 1000 мкл жидкой средой Лурия-Бертани (LB), которая ранее поддерживалась при температуре 37 °C. Встряхните бактерии в течение 90 мин при 37 ° C в орбитальном шейкере примерно при 330 об/мин.
   3. Центрифугируйте их при 5000 x g в течение 5 мин при 4 ° C и выбросьте 900 мкл надосадочной жидкости. Используйте оставшуюся надосадочную жидкость для ресуспендирования гранулы. Равномерно распределите суспензию бактерий по твердой пластине ампициллина (100 мкг / мл) LB.
   4. Инкубировать при 37 °C в течение ночи, затем проверить рост бактерий. На этом этапе бактерии могут храниться при температуре 4 ° C в течение 4-5 дней.
   5. Выберите одну колонию для переноса в пробирку объемом 50 мл с 10 мл жидкой среды LB и ампициллином (100 мкг / мл). Встряхните бактерии при 37 °C при примерно 330 об/мин.
   6. Центрифугируйте культуру, чтобы гранулировать бактерии в 5,000 x g в течение 5 мин при 4 ° C, выбросьте надосадочную жидкость и сохраните бактериальную гранулу. Его можно хранить при температуре -20 °C.
6. Очистите плазмиду с помощью набора для очистки ДНК от гранул бактерий, следуя инструкциям производителя (таблица материалов). Рассчитайте концентрацию ДНК, измерив поглощение при 260 нм и умножив на коэффициент разбавления, используя следующее соотношение: A₂₆₀ 1,0 = 50 мкг/мл чистой двухцепочечной (ds) ДНК.

3. Лентивирусная инфекция

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните процедуру генерации лентивируса в капюшоне с ламинарным потоком класса II.

1. За 24 ч до трансфекции высевают семена 1-5 × 10⁶ HEK 293 клетки в культуральные чашки диаметром 100 мм в 8 мл питательной среды и инкубируют их при 37 °C, 5% CO₂ в течение ночи.
2. Смешайте 14 мкг вектора pKLO.3G со специфической вставкой, 10,5 мкг упаковочной плазмиды psPAX и 3,5 мкг плазмиды оболочки pMD2.G (Таблица материалов). Разведите 45 мкл реагента для трансфекции плазмиды (Таблица материалов) в 700 мкл восстановленной сывороточной среды (Таблица материалов) и инкубируйте в течение 5 мин при комнатной температуре. Затем смешайте смесь ДНК с разбавленным реагентом для трансфекции плазмиды, аккуратно перемешайте и инкубируйте в течение 20 минут при комнатной температуре.
3. Между тем, замените на свежий DMEM среду чашки для культивирования клеточных культур HEK 293 (70% сливающихся во время трансфекции). Затем добавьте весь объем раствора ДНК по каплям. Аккуратно покачайте блюдо. Нет необходимости добавлять/менять среду после трансфекции.
4. Инкубируйте клетки при 37 ° C, 5% CO₂ в течение 48-72 часов, чтобы позволить шРНК достичь оптимальной трансдукции, проверенной флуоресценцией GFP с помощью флуоресцентного микроскопа. После этого соберите среду с лентивирусом и храните при температуре 4 °C.
5. Фильтрат вирусной надосадочной жидкости с нейлоновой мембраной 0,45 мкм. Аликвота проточной в 1 мл. Затем центрифугу при 17 000 х г в течение 4 ч. Выбросьте надосадочную жидкость и законсервируйте гранулы. Дайте невидимым гранулам высохнуть, а после высыхания храните при температуре -80 °C.
   1. Выполняют титрование вирусов с помощью флюсовой цитометрии. Засейте 4 x 10⁵ HEK 293 ячейки в 24-луночные планшеты и инкубируйте при 37 ° C в течение 24 часов. Затем ресуспендируют вирусные частицы в 200 мкл питательной среды DMEM (таблица материалов) и добавляют 0,05, 0,02 и 0,005 мкл в каждую лунку.
   2. Инкубировать вирусную инфекцию в течение 72 ч, удалить среду и трипсинизировать (0,05% трипсина, 1 мл) в течение 3 мин. Добавьте 1 мл DMEM в 10% раствор FCS и центрифугу при 500 x g в течение 5 мин. Выбросьте надосадочную жидкость и дважды промойте гранулы с помощью PBS.
   3. Ресуспендируют гранулу 100 мкл PBS и фиксируют ячейки 100 мкл 2% параформальдегида (PFA) в PBS. Проанализируйте клетки с помощью флюометрического цитометра и определите процент флуоресцентных клеток GFP. Соберите эти данные, чтобы рассчитать титрование вируса по следующей формуле:
      Титрование вирусов
      

4. Культуры первичных нейронов, подвергшиеся стрессу с накоплением ганглиозида GM2 и иммуноцитохимией с использованием антител против MAP2

1. Инфицируют первичные культуры корковых нейронов (15 дней in vitro) специфическими олигонуклеотидами шРНК, нацеленными на 3'-UTR CN-Aα или CHOP, и инкубируют их при 37 ° C с 5% CO₂ в течение 1 дня.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Первичные культуры корковых нейронов в течение 7-8 дней in vitro также могут быть использованы, если клетки демонстрируют высокий рост нейритов.
   1. Приготовьте 500 мкМ исходный раствор ганглиозида GM2 в этаноле и обработайте его ультразвуком в течение 1 часа.
   2. Добавьте исходный раствор GM2 в питательную среду в конечной концентрации 2 мкМ. Дайте инкубировать при 37 ° C с 5% CO₂ в течение 16, 24 и 48 часов.
2. Используйте некоторые культуры для приготовления клеточного гомогената для анализа вестерн-блоттинга (спецификацию антител см. в Таблице материалов).
3. Выполните шаги 1.4. и 1.5. а затем зафиксируйте ячейки 4% PFA и сахарозой 120 мМ в PBS на 20 мин при 37 °C, а затем промойте PBS. Выполняйте эту процедуру на противоскользящей мембране во влажной камере. После этого добавьте раствор для пермеабилизации (0,2% Triton X-100 в PBS) в течение 5 минут и смойте PBS.
   1. Используйте 5% BSA, разведенный в PBS, в течение 45 мин, чтобы обеспечить блокировку, затем инкубируйте с антителом против MAP2, разбавленным 1:800 в блокирующем растворе, при 4 ° C в течение ночи.
   2. По окончании инкубационного времени дважды промыть PBS и инкубировать со вторичными антителами (Таблица материалов) в течение 1 ч. Затем промойте ячейки с помощью PBS и установите стекла на предметные стекла с помощью водной монтажной среды (Таблица материалов).

5. Анализ атрофии нейритов

1. Получение изображений с помощью 20-кратной воздушной линзы (NA 0.8) с помощью эпифлуоресцентного инвертированного микроскопа, оснащенного ПЗС-камерой. Анализируйте изображения с помощью подключаемых модулей ImageJ. Для этого загрузите изображение в ImageJ и вычтите фон, нажав « Обработать» | Вычтите фон.
2. Нажмите на изображение | Отрегулируйте | Пороговое значение или введите следующие клавиши: Ctrl (или Cmd) + Shift + T. Откроется окно для настройки минимальных значений, что позволит различить трассировку пути и сомы. Кликните по бинарному изображению (нейриты и сомы белого цвета). На этом изображении используйте выделение от руки, чтобы удалить сомы; Выбранная область сомы снова становится черной.
3. Выберите трассировки и нажмите кнопку Редактировать | Выбор | Создать выделение. Получите ROI, нажав клавиши Ctrl (или Cmd) и T выделения, и сохраните его. Откройте исходное изображение, затем нажмите на панель менеджера ROI и выберите принадлежащий ROI, полученный ранее. Затем нажмите на исходное изображение.
4. Как только ROI будет отслеживаться на изображении, введите клавиши Ctrl (или Cmd) и M (Analyze | Мера). Окно открывается; Скопируйте среднее значение (произвольные единицы а.е.) для обработки статистического анализа.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы получить значения в мкм, нажмите «Анализировать» | Установите масштаб. Откроется окно для установки значений. Убедитесь, что вы добавили правильный масштаб (Analyze | Set Scale) в зависимости от характеристик используемого микроскопа.

Результаты

Здесь мы рассматриваем вопрос о том, влияет ли молчание двух последующих компонентов PERK на переходную фазу UPR в модели стрессовых клеток ER. Чтобы достичь этого, мы заглушаем ген CN-Aα, а также ген CHOP двумя специфическими последовательностями шРНК для каждой (таблица 1) в культуре клеток пер...

Обсуждение

Мы описываем экспериментальную систему, которая обеспечивает молекулярную модуляцию перехода от фаз выживания к апоптотическим фазам UPR в модели нейрональной клетки.

Для правильного анализа атрофии нейритов необходимо получить первичные культуры нейронов с многочисл...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 488 anti-Mouse	Thermo Fisher Scientific	#R37120
anti-CHOP	Thermo Fisher	# MA1 - 250
Anti-CN-Aα	Millipore	# 07-067
Anti-GM2	Matreya	#1961
anti-MAP2	Sigma Aldrich	# M2320
anti-β-actin	Thermo Fisher	# PA1 - 183
aprotinin	Santa Cruz Biotechnology	#3595
Axiovert 200 epifluorescence microscope	Zeiss
B27 supplement	Life Technologies	#17504944
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	Life Technologies	#11966025
EcoRI	Promega	#R6011
Fetal Calf Serum (FCS)	Life Technologies	#16000044
Fine-tippeds forceps  style #5	Dumont
Forcep style #3	Dumont
HEK 293	ATCC	#CRL-1573
IRDye 680 CW secondary antibody	LI-COR Biosciences	#92632221
IRDye 680 secondary antibody	LI-COR Biosciences	#92632220
IRDye 800 CW secondary antibody	LI-COR Biosciences	#92632210
IRDye 800 CW secondary antibody	LI-COR Biosciences	#92632211
lentiviral envelope plasmid pMD2.G	Addgene	#12259
lentiviral packing plasmid psPAX2	Addgene	#12260
lentiviral vector pLKO.3G	Addgene	#14748
Leupeptin hemisulfate	Santa Cruz Biotechnology	#295358
Lipofectamine LTX & Plus Reagent (plasmid transfection reagent)	Life Technologies	#A12621
MISSION shRNA	Sigma Aldrich
Monosialoganglioside GM2	Matreya	#1502
NanoDrop 2000	Thermo Scientific
Neurobasal Medium	Life Technologies	#21103049
Nitrocellulose membrane 0.45 µm	BIO-RAD	#1620115
Odyssey infrared imaging system	LI-COR Bioscience
OneShot Top 10	Life Technology	#C404010
Opti-MEM (Reduced serum media)	Life Technologies	#105802
PacI	BioLabs	#R0547S
penicillin-streptomycin	Life Technologies	#15140122
Pepstatin A	Santa Cruz Biotechnology	#45036
phenylmethylsulfonyl fluoride	Santa Cruz Biotechnology	#329-98-6
Poly-L-lysine	sigma aldrich	P#2636
Straight sharp small spring scissors	Fine Science Tools
T4 DNA Ligase	Promega	#M1801
Trypsin-EDTA 0.25 %	Life Technologies	#25200056
Vibra-Cell Ultrasonic Liquid Processor (VCX 130)	Sonics
Wizard plus SV Minipreps DNA purification system	Promega	#A1330