Molekulare Modulation durch Lentivirus-gelieferte spezifische shRNAs in endoplasmatischen Retikulum-gestressten Neuronen

Zusammenfassung

In der vorliegenden Studie wird die Expression von zwei nachgeschalteten Signalkomponenten des PERK-Signalwegs, dem zytoprotektiven Calcineurin und dem pro-apoptotischen CHOP, unter Verwendung spezifischer shRNAs abgeschaltet. Auf entgegengesetzte Weise modulieren diese die Anfälligkeit primärer kortikaler Neuronen für Neuritenatrophie nach Induktion von endoplasmatischem Retikulumstress.

Zusammenfassung

Die Anhäufung von ungefalteten Proteinen im endoplasmatischen Retikulum (ER), die durch einen Stresszustand verursacht wird, löst die ungefaltete Proteinantwort (UPR) durch die Aktivierung spezialisierter Sensoren aus. UPR versucht zunächst, die Homöostase wiederherzustellen; Wenn der Schaden jedoch anhält, induziert die Signalübertragung Apoptose.

Es gibt immer mehr Hinweise darauf, dass anhaltender und ungelöster ER-Stress zu vielen pathologischen Zuständen, einschließlich neurodegenerativer Erkrankungen, beiträgt. Da die UPR das Zellschicksal steuert, indem sie zwischen zytoprotektiven und apoptotischen Prozessen wechselt, ist es wichtig, die Ereignisse, die diesen Übergang definieren, sowie die Elemente, die an seiner Modulation beteiligt sind, zu verstehen.

Kürzlich haben wir gezeigt, dass eine abnormale GM2-Gangliosidakkumulation zu einer Erschöpfung des ER Ca²⁺ -Gehalts führt, was wiederum PERK (PKR-like-ER-Kinase), einen der UPR-Sensoren, aktiviert. Darüber hinaus ist der PERK-Signalweg an der Neuritenatrophie und Apoptose beteiligt, die durch die GM2-Akkumulation induziert wird. In dieser Hinsicht haben wir ein experimentelles System etabliert, das es uns ermöglicht, die Expression von nachgeschalteten PERK-Komponenten molekular zu modulieren und so die Anfälligkeit von Neuronen für eine neuritische Atrophie zu verändern.

Wir führten einen Knockdown der Calcineurin- (zytoprotektiven) und CHOP- (pro-apoptotischen) Expression in kortikalen neuronalen Kulturen von Ratten durch. Die Zellen wurden mit Lentivirus-gelieferter spezifischer shRNA infiziert und dann zu unterschiedlichen Zeitpunkten mit GM2 behandelt, fixiert und mit Anti-MAP2-Antikörpern (Mikroröhren-assoziiertes Protein 2) immungefärbt. Später wurden Zellbilder mit einem Fluoreszenzmikroskop aufgenommen und das totale Neuritenwachstum mit der gemeinfreien Bildverarbeitungssoftware ImageJ ausgewertet. Die Hemmung der Expression dieser PERK-Signalkomponenten ermöglichte es eindeutig, die durch ER-Stress induzierte neuritische Atrophie entweder zu beschleunigen oder zu verzögern.

Dieser Ansatz könnte in Zellsystemmodellen von ER-Stress verwendet werden, um die Anfälligkeit von Neuronen für Neuritenatrophie zu bewerten.

Einleitung

Stress im endoplasmatischen Retikulum (ER) ist definiert als jede Störung, die die Proteinfaltungskapazität in der Organelle beeinträchtigt. Die Anhäufung von ungefalteten Proteinen innerhalb des ER-Lumens aktiviert ein Transduktionskaskadensignal, das als ungefaltete Proteinantwort (UPR) bezeichnet wird. Dieser komplexe Signalweg wird von drei Stresssensoren orchestriert: PERK (Proteinkinase-RNA [PKR]-ähnliche ER-Kinase), IRE1 (Inositol-erforderliches Enzym 1) und ATF6 (aktivierter Transkriptionsfaktor 6). Alle zusammen versuchen, die Homöostase wiederherzustellen. Wenn der Stress jedoch anhält, induziert UPR schließlich den Zelltod durch Apoptose^1<....

Protokoll

Die Tierverfahren werden nach den genehmigten Protokollen des National Institute of Health Guide für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt. Die Genehmigung zur Durchführung der Studie wird von der Tierpflege- und Ethikkommission (CICUAL) des INIMEC-CONICET-UNC erteilt (Beschlussnummern 014/2017 B und 006/2017 A).

1. Primäre kortikale Neuronenkulturen der Ratte

1. Betäuben Sie trächtige Ratten in einer CO 2 -Kammer mit einer Mischung aus 80% CO 2 / 20% O₂ für 60 s Exposition und opfern Sie sie dann durch Luxation der Halswirbel.
2. Führen Sie die folgenden Schritte in einer Lami....

Ergebnisse

Hier gehen wir der Frage nach, ob die Stummschaltung zweier PERK-Downstream-Komponenten die Übergangsphase von UPR in einem ER-Stresszellmodell beeinflusst. Um dies zu erreichen, schalten wir sowohl das CN-Aα-Gen als auch das CHOP-Gen durch jeweils zwei spezifische shRNA-Sequenzen (Tabelle 1) in primärer Neuronenzellkultur für 1 Tag¹⁰ zum Schweigen. Die Expression wird mittels Western Blot analysiert (Abbildung 1 und

Diskussion

Wir beschreiben ein experimentelles System, das die molekulare Modulation des Übergangs von der Überlebens- zur apoptotischen UPR-Phase in einem neuronalen Zellmodell ermöglicht.

Für eine korrekte Analyse der Neuritenatrophie ist es wichtig, primäre Neuronenkulturen mit zahlreichen, langen, stark verzweigten Prozessen zu erhalten ^9,11. Dies erleichtert die Untersuchung der Erweiterung des Neuronenprozesses, so dass die deutlichen .......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 488 anti-Mouse	Thermo Fisher Scientific	#R37120
anti-CHOP	Thermo Fisher	# MA1 - 250
Anti-CN-Aα	Millipore	# 07-067
Anti-GM2	Matreya	#1961
anti-MAP2	Sigma Aldrich	# M2320
anti-β-actin	Thermo Fisher	# PA1 - 183
aprotinin	Santa Cruz Biotechnology	#3595
Axiovert 200 epifluorescence microscope	Zeiss
B27 supplement	Life Technologies	#17504944
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	Life Technologies	#11966025
EcoRI	Promega	#R6011
Fetal Calf Serum (FCS)	Life Technologies	#16000044
Fine-tippeds forceps  style #5	Dumont
Forcep style #3	Dumont
HEK 293	ATCC	#CRL-1573
IRDye 680 CW secondary antibody	LI-COR Biosciences	#92632221
IRDye 680 secondary antibody	LI-COR Biosciences	#92632220
IRDye 800 CW secondary antibody	LI-COR Biosciences	#92632210
IRDye 800 CW secondary antibody	LI-COR Biosciences	#92632211
lentiviral envelope plasmid pMD2.G	Addgene	#12259
lentiviral packing plasmid psPAX2	Addgene	#12260
lentiviral vector pLKO.3G	Addgene	#14748
Leupeptin hemisulfate	Santa Cruz Biotechnology	#295358
Lipofectamine LTX & Plus Reagent (plasmid transfection reagent)	Life Technologies	#A12621
MISSION shRNA	Sigma Aldrich
Monosialoganglioside GM2	Matreya	#1502
NanoDrop 2000	Thermo Scientific
Neurobasal Medium	Life Technologies	#21103049
Nitrocellulose membrane 0.45 µm	BIO-RAD	#1620115
Odyssey infrared imaging system	LI-COR Bioscience
OneShot Top 10	Life Technology	#C404010
Opti-MEM (Reduced serum media)	Life Technologies	#105802
PacI	BioLabs	#R0547S
penicillin-streptomycin	Life Technologies	#15140122
Pepstatin A	Santa Cruz Biotechnology	#45036
phenylmethylsulfonyl fluoride	Santa Cruz Biotechnology	#329-98-6
Poly-L-lysine	sigma aldrich	P#2636
Straight sharp small spring scissors	Fine Science Tools
T4 DNA Ligase	Promega	#M1801
Trypsin-EDTA 0.25 %	Life Technologies	#25200056
Vibra-Cell Ultrasonic Liquid Processor (VCX 130)	Sonics
Wizard plus SV Minipreps DNA purification system	Promega	#A1330