Modulazione molecolare da parte di shRNA specifici forniti da lentivirus in neuroni stressati dal reticolo endoplasmatico

Riepilogo

Nel presente studio, l'espressione viene abbattuta di due componenti di segnalazione a valle della via PERK, la calcineurina citoprotettiva e la CHOP pro-apoptotica, utilizzando specifici shRNA. In modi opposti, questi modulano la suscettibilità dei neuroni corticali primari all'atrofia dei neuriti dopo l'induzione dello stress del reticolo endoplasmatico.

Abstract

L'accumulo di proteine unfolded all'interno del reticolo endoplasmatico (ER), causato da qualsiasi condizione di stress, innesca la risposta proteica unfolded (UPR) attraverso l'attivazione di sensori specializzati. UPR tenta prima di ripristinare l'omeostasi; Ma se il danno persiste la segnalazione induce apoptosi.

Vi è una crescente evidenza che lo stress ER prolungato e irrisolto contribuisce a molte condizioni patologiche, comprese le malattie neurodegenerative. Poiché l'UPR controlla il destino cellulare passando da processi citoprotettivi a processi apoptotici, è essenziale comprendere gli eventi che definiscono questa transizione, nonché gli elementi coinvolti nella sua modulazione.

Recentemente, abbiamo dimostrato che l'accumulo anomalo di ganglioside GM2 causa l'esaurimento del contenuto di ER Ca²⁺ , che a sua volta attiva PERK (PKR-like-ER chinasi), uno dei sensori UPR. Inoltre, la segnalazione PERK partecipa all'atrofia dei neuriti e all'apoptosi indotta dall'accumulo di GM2. A questo proposito, abbiamo stabilito un sistema sperimentale che ci consente di modulare molecolarmente l'espressione dei componenti PERK a valle e quindi modificare la vulnerabilità dei neuroni a subire atrofia neuritica.

Abbiamo eseguito knockdown dell'espressione di calcineurina (citoprotettiva) e CHOP (pro-apoptotica) in colture neuronali corticali di ratto. Le cellule sono state infettate con shRNA specifico consegnato da lentivirus e poi trattate con GM2 in tempi diversi, fissate e immunocolorate con anticorpi anti-MAP2 (proteina 2 associata al microtubo). Successivamente, le immagini cellulari sono state registrate utilizzando un microscopio a fluorescenza e la crescita totale dei neuriti è stata valutata utilizzando il software di elaborazione delle immagini di dominio pubblico ImageJ. L'inibizione dell'espressione di tali componenti di segnalazione PERK ha chiaramente permesso di accelerare o ritardare l'atrofia neuritica indotta dallo stress ER.

Questo approccio potrebbe essere utilizzato in modelli di sistemi cellulari di stress ER per valutare la vulnerabilità dei neuroni all'atrofia dei neuriti.

Introduzione

Lo stress del reticolo endoplasmatico (ER) è definito come qualsiasi perturbazione che compromette la capacità di ripiegamento delle proteine nell'organello. L'accumulo di proteine non ripiegate all'interno del lume ER attiva un segnale a cascata di trasduzione chiamato risposta proteica ripiegata (UPR). Questa complessa via di segnalazione è orchestrata da tre sensori di stress: PERK (protein chinasi RNA [PKR]-like ER kinase), IRE1 (enzima 1 che richiede inositolo) e ATF6 (fattore di trascrizione attivato 6). Tutti insieme tentano di ripristinare l'omeostasi. Ma se lo stress persiste, l'UPR alla fine induce la morte cellulare per apoptosi¹.

PERK, una proteina transmembrana ER, dopo stress ER, guida la fosforilazione del fattore di iniziazione eucariotica-2 alfa (eIF2α), riducendo la sintesi proteica globale e quindi il carico proteico nell'ER². Abbiamo dimostrato che la calcineurina A/B (CNA/B), una fosfatasi Ca 2⁺ eterodimera, lega direttamente il dominio citosolico della PERK, aumentandone l'autofosforilazione e migliorando significativamente l'inibizione della traduzione proteica e della vitalità cellulare ^3,4. È interessante notare che CNA / B è abbondante nel cervello dei mammiferi, distinguendo due isoforme della subunità A di CN: α e β.

Sotto stress ER prolungato, la via di segnalazione PERK è l'unica branca UPR che rimane attivata, mediando così sia la risposta pro-sopravvivenza che quella apoptotica. Nella fase cronica, un importante evento a valle è l'induzione del fattore di trascrizione, CHOP (CCAAT/enhancer binding protein homologous protein)⁵. Lo stress cronico del pronto soccorso è anche sempre più riconosciuto come un contributo comune a una vasta gamma di disturbi patologici, comprese le malattie neurodegenerative⁶. È importante capire come l'UPR può facilitare la segnalazione citoprotettiva invece della morte cellulare ⁷. Tuttavia, al momento si sa poco sull'esatto meccanismo che controlla la transizione tra queste due fasi UPR.

Recentemente, abbiamo scoperto che, nei neuroni in coltura, il ganglioside GM2 si accumula nelle membrane ER e induce l'esaurimento del calcio luminale. Questo a sua volta attiva la segnalazione PERK, che media l'atrofia dei neuriti e l'apoptosi ⁸. In questo studio, l'accumulo di GM2 nei neuroni in coltura viene utilizzato come modello di sistema cellulare dell'atrofia neurite indotta dallo stress ER. In particolare, vengono manipolate due espressioni del fattore PERK, CN-Aα e CHOP, che commuta la transizione tra eventi precoci / protettivi e una fase cronica / apoptotica. Per raggiungere questo obiettivo, i rispettivi geni vengono silenziati; pertanto, le colture primarie di neuroni corticali sono infettate da shRNA specifico consegnato da lentivirus. L'analisi Western blot rivela una significativa riduzione dei livelli di espressione di CN-Aα e CHOP rispetto alle cellule di controllo, che sono infettate da lentivirus che trasportano uno shRNA criptato. Dopo questo trattamento, i neuroni sono sottoposti a diversi tempi di incubazione di GM2 esogeno, fissi e immunocolorati con anticorpo 2 (MAP2) anti-microtubulo associato alla proteina 2 (MAP2)⁹. Le immagini sono ottenute con un microscopio a epifluorescenza. La crescita totale dei neuriti viene valutata rispetto al numero totale di cellule.

Protocollo

Le procedure sugli animali vengono eseguite seguendo i protocolli approvati della Guida dell'Istituto Superiore di Sanità per la cura e l'uso degli animali da laboratorio. L'approvazione per condurre lo studio è concessa dal Comitato per la cura e l'etica degli animali (CICUAL) di INIMEC-CONICET-UNC (numeri di risoluzione 014/2017 B e 006/2017 A).

1. Colture primarie di neuroni corticali di ratto

1. Anestetizzare le ratte gravide E18 Wistar in una camera di CO 2 con una miscela di 80% CO 2/20% O₂ per 60 s di esposizione e quindi sacrificare quindi slogare le vertebre cervicali.
2. Eseguire i seguenti passaggi in una cappa a flusso laminare. Estrarre l'encefalo dagli embrioni con una pinza stile # 3 e piccole forbici a molla affilate dritte (Table of Materials) alla soluzione di Hanks in piatti di coltura cellulare.
3. Sezionare il tessuto sotto la lente d'ingrandimento 20x, usando due pinze a punta fine stile #5, separando la corteccia frontale dalle meningi. Trasferire la corteccia frontale in un tubo conico da 15 mL e incubare il tessuto con 3-4 mL di tripsina-EDTA (0,25%) per 15 minuti, a 37 °C per la digestione chimica.
4. Dopo la digestione, diluirlo con 3-4 ml di terreno di aquila modificato di Dulbecco (DMEM) più il 10% di siero fetale di vitello (FCS). Quindi lavarlo 3 volte con Ca 2+/Mg²⁺ free Hanks Balanced Salt solution e 0,1% di glucosio per centrifugazione (3000 g per 5 min).
5. Dissociare meccanicamente il tessuto 10 volte mediante pipettaggio su e giù utilizzando una punta da 1000 μL, in DMEM più il 10% di FCS (Table of Materials). Quindi centrifugare l'omogenato a 100 x g per 1 minuto, raccogliere il surnatante e completare il volume rimanente a 1000 μL.
6. Placcare la sospensione cellulare su piastre di coltura cellulare ad una densità di 520 cellule/mm 2 con² ml di DMEM contenente il 10% di FCS, l'1% di penicillina/streptomicina e l'1% di un additivo aminoacidico essenziale (vedere Tabella dei materiali). Quindi incubare a 37 °C in ambiente umidificato con 5% di CO 2 per₂ ore.
   1. Rimozione della materia organica e rivestimento di poli-L-lisina di piastre di coltura cellulare
      1. Rimuovere la materia organica mettendo il materiale di vetro in una camera di reazione e aggiungere alcol etilico al 96% per coprire quasi tutto il materiale. Quindi aggiungere il 68% (p / v) di acido nitrico goccia a goccia fino a quando iniziano a comparire bolle brunastre-verdastre. Una volta che ciò accade, coprire parzialmente il contenitore e lasciare che la reazione continui fino alla cessazione dell'esplosione.
         NOTA: Rimuovere la materia organica sotto una cabina di estrazione del gas per evitare l'esposizione a gas nocivi.
      2. Prima del rivestimento di poli-L-lisina, sciacquare i vetri con acqua sterile Mili-Q circa dieci volte. Quindi incubare i bicchieri e i piatti di coltura con 0,1 μg / μL di poli-L-lisina per 4 ore prima di usarli. Dopo l'incubazione, sciacquare gli occhiali con acqua sterile Mili-Q circa dieci volte.
7. Per consentire la differenziazione delle cellule neurali, cambiare il mezzo per un mezzo neurobasale privo di siero, con il supplemento senza siero (Tabella dei materiali). Mantenere le colture a 37 °C con il 5% di CO₂ fino al trattamento.

2. Produzione di lentivirus

NOTA: Gli oligonucleotidi contenenti le sequenze che hanno come bersaglio le 3'UTR dell'isoforma CN-Aα o CHOP e con le sequenze non bersaglio (scramble) sono elencati nella Tabella 1.

1. Per la ricottura, miscelare due oligonucleotidi a singolo filamento con sequenze complementari in quantità molari uguali, utilizzando Annealing Buffer (10 mM Tris-HCl, pH 7,5-8,0, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA).
2. Riscaldare a 95 °C per 2 minuti e poi raffreddare lentamente trasferendo i campioni dal blocco termico o dal bagno d'acqua a un banco a temperatura ambiente. Diluire il prodotto risultante [RNA a forcina corta, (shRNA) con estremità coesive] ad una concentrazione finale di 0,5 μM, aliquotarli e conservare a -20 °C.
3. Clonare l'inserto shRNA nel vettore lentivirale pLKO.3G, con GFP come marcatore fluorescente verde. Per questo, digerire 1 μg di vettore con enzimi di restrizione EcoRI e PacI mescolando quanto segue in una provetta sterile: 2 μL di tampone enzimatico di restrizione 10x (100 mM bis-Tris propano-HCl, pH 6,5, 100 mM MgCl₂, 1 mg/mL di albumina sierica bovina), 1 μL di 1 μg/μL pLKO.3G, 0,5 μL di 10 U/μL ECoRI, 0,5 μL di PacI (10 U/μL) e 16 μL di acqua ionizzata sterile.
   1. Mescolare delicatamente mediante pipettaggio. Incubare la reazione per 3-4 ore a 37 °C.
      NOTA: Le digestioni notturne sono generalmente non necessarie e possono causare la degradazione del DNA.
4. Per la legatura, mescolare il vettore digerito e inserirlo in un rapporto molare di 3:1 e incubarlo con la ligasi T4 e il tampone ligasi (fornito dal produttore) per una notte a 16 °C.
   NOTA: A questo punto la reazione di legatura può essere conservata a 4 °C fino a un ulteriore utilizzo.
5. Trasformare le cellule competenti DH5α (Table of Materials) o un altro ceppo E. coli adatto con la reazione di legatura come segue.
   1. Mescolare E. coli competente con il volume totale della reazione di legatura e raffreddarlo sul ghiaccio per 15 minuti, metterlo in un bagno a 42 ° C per 2 minuti e quindi raffreddarlo nuovamente sul ghiaccio per 15 minuti.
   2. Trasferire il volume totale sottoposto a shock termico in un tubo da 15 mL e completare il volume a 1000 μL con mezzo liquido Luria-Bertani (LB) precedentemente mantenuto a 37 °C. Agitare i batteri per 90 minuti a 37 °C in uno shaker orbitale a circa 330 giri/min.
   3. Centrifugarli a 5.000 x g per 5 minuti a 4 °C ed eliminare 900 μL di surnatante. Utilizzare il surnatante rimanente per risospendere il pellet. Distribuire uniformemente la sospensione batterica su una piastra solida di ampicillina (100 μg/mL) LB.
   4. Incubare a 37 °C durante la notte, quindi controllare la crescita batterica. A questo punto, i batteri possono essere conservati a 4 °C per 4-5 giorni.
   5. Scegliere una singola colonia da trasferire in un tubo da 50 ml con 10 ml di mezzo liquido LB e ampicillina (100 μg/ml). Agitare i batteri ON a 37 °C a circa 330 giri/min.
   6. Centrifugare la coltura per pellettare i batteri a 5.000 x g per 5 minuti a 4 °C, eliminare il surnatante e conservare il pellet batterico. Questo può essere conservato a -20 °C.
6. Purificare il plasmide con un kit di purificazione del DNA dal pellet di batteri seguendo le istruzioni del produttore (Tabella dei materiali). Calcolare la concentrazione di DNA misurando l'assorbanza a 260 nm e moltiplicando per il fattore di diluizione, utilizzando la seguente relazione: A₂₆₀ di 1,0 = 50 μg/mL di DNA puro a doppio filamento (ds).

3. Infezione da lentivirus

NOTA: Eseguire la procedura di generazione del lentivirus in una cappa a flusso laminare di Classe II.

1. 24 ore prima della trasfezione, seminare 1-5 × 10⁶ cellule HEK 293 in piatti di coltura di 100 mm di diametro in 8 ml di terreno di coltura e incubarli a 37 °C, 5% CO₂ durante la notte.
2. Mescolare 14 μg di vettore pKLO.3G con inserto specifico, 10,5 μg di plasmide psPAX e 3,5 μg di plasmide dell'involucro pMD2.G (Tabella dei materiali). Diluire 45 μL di reagente di trasfezione plasmidica (Tabella dei materiali) in 700 μL di siero ridotto (Tabella dei materiali) e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente. Quindi combinare la miscela di DNA con il reagente di trasfezione plasmidica diluito, mescolare delicatamente e incubare per 20 minuti a temperatura ambiente.
3. Nel frattempo, cambiare per DMEM fresco il mezzo del piatto di coltura di colture cellulari HEK 293 (70% confluente al momento della trasfezione). Quindi aggiungere l'intero volume della soluzione di DNA goccia a goccia. Scuotere delicatamente il piatto. Non è necessario aggiungere/cambiare il mezzo dopo la trasfezione.
4. Incubare le cellule a 37 °C, 5% CO₂ per 48 h- 72 h per consentire agli shRNA di raggiungere la loro trasduzione ottimale controllata dalla fluorescenza GFP utilizzando un microscopio a fluorescenza. Successivamente, raccogliere il terreno con lentivirus e conservare a 4 °C.
5. Supernatante virale filtrato con membrana di nylon da 0,45 μm. Aliquot il flusso in 1 ml. Quindi, centrifugare a 17.000 x g per 4 ore. Scartare il surnatante e conservare il pellet. Lasciare asciugare il pellet invisibile e, una volta essiccato, conservare a - 80 °C.
   1. Eseguire la titolazione virale mediante citometria a flusso. Seminare 4 x 10⁵ cellule HEK 293 in piastre da 24 pozzetti e incubare a 37 °C per 24 ore. Quindi risospendere le particelle virali in 200 μL di terreno di coltura DMEM (Table of Materials) e aggiungere 0,05, 0,02 e 0,005 μL a ciascun pozzetto.
   2. Incubare l'infezione virale per 72 ore, rimuovere il terreno e tripsinizzare (0,05% tripsina, 1 ml) per 3 min. Aggiungere 1 mL di DMEM in soluzione FCS al 10% e centrifugare a 500 x g per 5 minuti. Scartare il surnatante e lavare il pellet due volte con PBS.
   3. Risospendere il pellet con 100 μL di PBS e fissare le cellule con 100 μL di paraformaldeide (PFA) al 2% in PBS. Analizzare le cellule con un citometro a flusso e determinare la percentuale di cellule fluorescenti GFP. Raccogliere questi dati per calcolare la titolazione virale utilizzando la seguente formula:
      Titolazione virale
      

4. Colture di neuroni primari stressati con accumulo di ganglioside GM2 e immunocitochimica con anticorpi anti-MAP2

1. Infettare le colture primarie di neuroni corticali (15 giorni in vitro) con specifici oligonucleotidi shRNA mirati alle 3' UTR di CN-Aα o CHOP e incubarle a 37 °C con il 5% di CO₂ per 1 giorno.
   NOTA: Colture primarie di neuroni corticali di 7-8 giorni in vitro potrebbero anche essere utilizzate se le cellule mostrano un'elevata crescita dei neuriti.
   1. Preparare una soluzione madre da 500 μM di ganglioside GM2 in etanolo e sonicarla per 1 ora.
   2. Aggiungere la soluzione madre GM2 al terreno di coltura ad una concentrazione finale di 2 μM. Lasciare incubare a 37 °C con CO₂ al 5% per 16, 24 e 48 ore.
2. Utilizzare alcune colture per preparare l'omogenato cellulare per l'analisi western blot (per le specifiche degli anticorpi, vedere la Tabella dei materiali).
3. Seguire i passaggi 1.4. e 1.5. quindi fissare le cellule con PFA al 4% e 120 mM di saccarosio in PBS per 20 minuti a 37 °C, quindi lavarlo con PBS. Eseguire questa procedura su una membrana antiscivolo in una camera umida. Successivamente, aggiungere la soluzione di permeabilizzazione (0,2% Triton X-100 in PBS) per 5 minuti e lavare con PBS.
   1. Utilizzare BSA al 5% diluito in PBS per 45 minuti per consentire il blocco, quindi incubare con anticorpi anti-MAP2, diluito 1:800 in soluzione bloccante, a 4 °C durante la notte.
   2. Alla fine del tempo di incubazione, lavare due volte con PBS e incubare con anticorpi secondari (Table of Materials) per 1 ora. Quindi lavare le celle con PBS e montare gli occhiali su vetrini utilizzando un mezzo di montaggio acquoso (Table of Materials).

5. Analisi dell'atrofia della neurite

1. Ottenere immagini con una lente d'aria 20x (NA 0.8) utilizzando un microscopio a epifluorescenza invertita dotato di una telecamera CCD. Analizza le immagini con i plug-in ImageJ. Per questo, carica l'immagine su ImageJ e sottrai lo sfondo facendo clic su Elabora | Sottrai sfondo.
2. Clicca sull'immagine | Regola | Soglia o digitare i seguenti tasti: Ctrl (o Cmd) + Maiusc + T. Si apre una finestra per regolare i valori minimi, consentendo di distinguere i tracciati di percorso e soma. Clicca sull'immagine binaria (neuriti e somi sono di colore bianco). In questa immagine, usa la selezione a mano libera per eliminare i somas; L'area SOMA selezionata diventa nuovamente nera.
3. Selezionare le tracce e fare clic su Modifica | Selezione | Crea selezione. Ottieni il ROI facendo clic sui tasti Ctrl (o Cmd) e T della selezione e conservalo. Apri l'immagine originale, quindi clicca sul pannello del ROI manager e seleziona il ROI di appartenenza, precedentemente ottenuto. Quindi fare clic sull'immagine originale.
4. Una volta tracciato il ROI sull'immagine, digitare i tasti Ctrl (o Cmd) e M (Analizza | Misura). Si apre una finestra; copiare il valore medio (unità arbitrarie di u.a.) per elaborare l'analisi statistica.
   NOTA: Per ottenere valori come μm, fare clic su Analizza | Imposta scala. Si apre una finestra per impostare i valori. Assicurati di aggiungere la scala corretta (Analizza | Set Scale) a seconda delle caratteristiche del microscopio utilizzato.

Risultati

Qui, affrontiamo la questione se il silenziamento di due componenti a valle di PERK influenzi la fase di transizione dell'UPR in un modello di cella di stress ER. Per raggiungere questo obiettivo, silenziamo il gene CN-Aα e il gene CHOP con due sequenze specifiche di shRNA per ciascuna (Tabella 1) in coltura cellulare di neuroni primari per 1 giorno¹⁰. L'espressione viene analizzata mediante Western blotting (Figura 1 e

Discussione

Descriviamo un sistema sperimentale che consente la modulazione molecolare della transizione dalla sopravvivenza alle fasi UPR apoptotica in un modello di cellula neuronale.

Per una corretta analisi dell'atrofia dei neuriti, è essenziale ottenere colture neuronali primarie con numerosi, lunghi, processi altamente ramificati ^9,11. Ciò facilita l'esame dell'estensione del processo neuronale, consentendo di rilevare le chiare differenze...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 488 anti-Mouse	Thermo Fisher Scientific	#R37120
anti-CHOP	Thermo Fisher	# MA1 - 250
Anti-CN-Aα	Millipore	# 07-067
Anti-GM2	Matreya	#1961
anti-MAP2	Sigma Aldrich	# M2320
anti-β-actin	Thermo Fisher	# PA1 - 183
aprotinin	Santa Cruz Biotechnology	#3595
Axiovert 200 epifluorescence microscope	Zeiss
B27 supplement	Life Technologies	#17504944
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	Life Technologies	#11966025
EcoRI	Promega	#R6011
Fetal Calf Serum (FCS)	Life Technologies	#16000044
Fine-tippeds forceps  style #5	Dumont
Forcep style #3	Dumont
HEK 293	ATCC	#CRL-1573
IRDye 680 CW secondary antibody	LI-COR Biosciences	#92632221
IRDye 680 secondary antibody	LI-COR Biosciences	#92632220
IRDye 800 CW secondary antibody	LI-COR Biosciences	#92632210
IRDye 800 CW secondary antibody	LI-COR Biosciences	#92632211
lentiviral envelope plasmid pMD2.G	Addgene	#12259
lentiviral packing plasmid psPAX2	Addgene	#12260
lentiviral vector pLKO.3G	Addgene	#14748
Leupeptin hemisulfate	Santa Cruz Biotechnology	#295358
Lipofectamine LTX & Plus Reagent (plasmid transfection reagent)	Life Technologies	#A12621
MISSION shRNA	Sigma Aldrich
Monosialoganglioside GM2	Matreya	#1502
NanoDrop 2000	Thermo Scientific
Neurobasal Medium	Life Technologies	#21103049
Nitrocellulose membrane 0.45 µm	BIO-RAD	#1620115
Odyssey infrared imaging system	LI-COR Bioscience
OneShot Top 10	Life Technology	#C404010
Opti-MEM (Reduced serum media)	Life Technologies	#105802
PacI	BioLabs	#R0547S
penicillin-streptomycin	Life Technologies	#15140122
Pepstatin A	Santa Cruz Biotechnology	#45036
phenylmethylsulfonyl fluoride	Santa Cruz Biotechnology	#329-98-6
Poly-L-lysine	sigma aldrich	P#2636
Straight sharp small spring scissors	Fine Science Tools
T4 DNA Ligase	Promega	#M1801
Trypsin-EDTA 0.25 %	Life Technologies	#25200056
Vibra-Cell Ultrasonic Liquid Processor (VCX 130)	Sonics
Wizard plus SV Minipreps DNA purification system	Promega	#A1330