单细胞阵列的活细胞成像 （LISCA） - 量化细胞动力学的多功能技术

摘要

我们提出了一种利用微模式阵列从单个细胞获取荧光记者时间课程的方法。该协议描述了单细胞阵列的准备、活细胞扫描延时显微镜的设置和操作，以及用于自动预选、可视控制和跟踪每个粘附站点的细胞集成荧光时间课程的开源图像分析工具。

摘要

单细胞阵列的活细胞成像 （LISCA） 是一种多功能方法，可收集来自高吞吐量单个细胞的荧光信号的时间过程。一般来说，从培养细胞获得单细胞时间课程受到细胞移动性和细胞形状多样性的阻碍。粘合微阵列标准化单细胞条件，便于图像分析。LISCA 将单细胞微阵列与扫描延时显微镜和自动图像处理相结合。在这里，我们描述了以 LISCA 格式参加单细胞荧光时间课程的实验步骤。我们通过 mRNA 编码对增强型绿色荧光蛋白 （eGFP） 进行微模式阵列的传输，并通过扫描延时显微镜同步监测数百个细胞的 eGFP 表达动力学。图像数据堆栈由新开发的软件自动处理，该软件集成了选定细胞轮廓上的荧光强度，以生成单细胞荧光时间过程。我们演示了 mRNA 转染后的 eGFP 表达时间过程，通过一个简单的动能转换模型很好地描述了 mRNA 的表达和退化率。讨论了 LISCA 在信号凋亡背景下多个标记事件时间相关性进一步应用。

引言

近年来，单细胞实验的重要性日益显现。来自单个细胞的数据允许研究细胞对细胞的变异性，细胞内参数相关性的分辨率和细胞动力学的检测，这些都隐藏在合奏测量^1、2、3中。为了同时研究数千个单个细胞的细胞动力学，需要采用新的方法，在长达数小时、持续数天的标准化条件下对细胞进行监测，然后进行定量数据分析^4。在这里，我们介绍单细胞阵列的活细胞成像 （LISCA），它结合了微结构阵列的使用与延时显微镜和自动图像分析。

在^文献5、6中，已经建立并出版了几种产生微结构单细胞阵列的方法。在这里，我们简要地描述了微尺度等离子启动蛋白模式 （μPIPP）。参考^文献7中还发现了使用μPIPP制造的单细胞阵列制造的详细协议。单细胞阵列的使用使数千个细胞对齐标准化粘附点，为每个细胞呈现定义的微环境，从而减少实验变异性来源（图1A）。单细胞阵列用于监控荧光标记的时间过程，这些标记旨在指示各种蜂窝过程。扫描延时模式的长期显微镜允许监测大面积的单细胞阵列，从而在....

研究方案

图2：将单细胞微阵拉 （A） 与扫描延时显微镜 （B） 相结合的数据采集。作为延时实验的准备，准备了带有 2D 微模式粘附方块的单细胞阵列 （1），然后是细胞播种和微模式 （2） 上细胞的对齐，以及灌注系统与六通道滑梯的连接，从而在延时测量 （3） 期间实现液体处理。在延时实验 （5） 期间，通过灌注系统注入 mRNA 脂质溶液，在显微镜上对细胞进行微镜传输扫描延时实验 （4）。比例栏： 200μm.请单击此处查看此图的更大版本。

1. 微结构单细胞阵列制造 （图2A）

1. 准备 μPIPP 阵列制造所需的材料。
   1. 在 pH 7.4 中准备无菌磷酸盐缓冲盐水 （PBS）。
   2. 在 25 °C 下准备电阻度至少为 18 MΩcm 的无菌超纯水。
   ....

结果

LISCA 方法能够有效地从单个细胞中收集荧光时间课程。作为一个具有代表性的例子，我们概述了如何应用 LISCA 方法测量转染后的单细胞 eGFP 表达。LISCA实验的数据用于评估mRNA输送动力学，这对高效mRNA药物的开发非常重要。

我们特别展示了两个基于脂质的 mRNA 递送系统对单细胞水平的翻译发病时间点和表达速率的不同影响。我们培养细胞，并将该批次分成两个群体。一个亚人.......

讨论

在这里，我们描述 LISCA 是一种多功能技术，在单细胞水平上遵循细胞内荧光标签的细胞动力学。为了执行成功的 LISCA 实验，协议部分的每个描述步骤必须单独确定，然后必须合并所有步骤。LISCA 的三个主要方面都具有关键步骤。

单细胞微阵拉制造
微传讯的质量至关重要，因为微传管上的细胞对齐不仅对所有进一步的实验步骤都很重要，而且对数据质量也有影响。?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adtech Polymer Engineering PTFE Microtubing	Fisher Scientific	10178071
baking oven	Binder	9010-0190
CFI Plan Fluor DL 10x	Nikon	MRH20100
Desiccator	Roth	NX07.1
Eclipse Ti-E	Nikon
eGFP mRNA	Trilink	L-7601
Female Luer to Tube Connector	MEDNET	FTL210-6005
Fetal bovine serum	Thermo Fisher	10270106
Fibronectin	Yo Proteins	663
Filter set eGFP	AHF	F46-002
Fisherbrand Translucent Platinum-Cured Silicone Tubing	Fisher Scientific	11768088
HEPES (1 M)	Thermo Fisher	15630080
Incubation Box	Okolab	OKO-H201
incubator	Binder	9040-0012
L-15 without phenol red	Thermo Fisher	21083027
Lipofectamine 2000	Thermo Fisher	11668027
Male Luer			in-house fabricated consisting of teflon
Male Luer to Tube Connector	MEDNET	MTLS210-6005	alternative to in-house fabricated male luers
NaCl (5 M)	Thermo Fisher	AM9760G
Needleless Valve to Male Luer Connector	MEDNET	NVFMLLPC
NIS Elements	Nikon		Imaging software Version 5.02.00
NOA81	Thorlabs	NOA81	Fast Curing Optical Adhesive for tube system assembly
Opti-MEM	Thermo Fisher	31985062
PCO edge 4.2 M-USB-HQ-PCO	pco
Phosphate buffered saline (PBS)			in-house prepared
Plasma Cleaner	Diener Femto	Pico-BRS
PLL(20 kDa)-g[3.5]-PEG(2 kDa)	SuSoS AG
silicon wafer mit mircorstructures			in-house fabricated
Sola Light Engine	Lumencor
sticky slide VI 0.4	ibidi	80608
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Dow Corning	1673921
Tango 2	Märzhäuser	00-24-626-0000
Ultrapure water			in-house prepared
uncoated coverslips	ibidi	10813
Injekt-F Solo, 1 mL	Omilab	9166017V	with replacement sporn