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  • 摘要
  • 摘要
  • 引言
  • 研究方案
  • 结果
  • 讨论
  • 披露声明
  • 致谢
  • 材料
  • 参考文献
  • 转载和许可

摘要

几种给药途径可用于将间充质干细胞 (MSC) 输送到大脑。在本研究中,MSC 通过椎腔内注射在整个神经轴和大脑中递送。将 MSCs 注射到大鼠的脊髓腔中,并跟踪和定量干细胞迁移。

摘要

间充质干细胞 (MSC) 已被研究用于治疗各种疾病。在涉及大脑和脊髓缺陷的神经退行性疾病中,给药途径非常重要,因为 MSC 必须迁移到大脑和脊髓。本文描述了一种将 MSC 注射到椎管(椎管内腔注射)的方法,该方法可以在大鼠模型中靶向大脑和脊髓。将 100 万个 MSCs 注射到腰椎 2-3 水平的大鼠椎管中。给药后,大鼠在注射后 0 、 6 和 12 小时实施安乐死。采用光学成像和定量实时聚合酶链反应 (qPCR) 追踪注射的 MSCs。本研究的结果表明,随后可以在 12 小时时在大脑和脊髓中检测到通过脊髓给药的 MSCs。椎管腔内注射的优点是不需要全身麻醉,副作用小。然而,必须克服 MSCs 向大脑迁移率低的缺点。

引言

间充质干细胞
在疾病条件下,MSC 通过旁分泌作用1 分泌疾病特异性治疗物质,据报道,这些物质可以调节免疫反应、恢复受损组织和去除有毒物质2。因此,MSC 疗法被认为在治疗阿尔茨海默病和肌肉减少症等多因素疾病方面比单靶点疗法更有效 3,4,5,6。此外,与药物相比,MSC 具有归巢作用,通过识别体内的炎性细胞因子或趋化因子移动到受损组织区域 7,8。不幸的是,只有一部分细胞到达受损区域,并且 MSC 的活力在迁移过程中会降低 9,10,11,12。因此,为了最大限度地提高 MSC 的治疗效果,有必要将活细胞输送到目标位点。因此,在施用 MSC 时,根据目标疾病的性质选择合适的给药途径非常重要。

注射路线
向患者施用治疗药物的途径有很多种。最常见的方法是静脉注射到体循环中、口服给药以及皮下或肌肉注射。在神经退行性疾病中,向大脑输送治疗剂的主要障碍是血脑屏障 (BBB)。BBB 通过血管和脑实质之间的紧密连接来保护大脑免受外部病原体的侵害13,14。然而,BBB 也自相矛盾地阻止了治疗剂进入脑实质。因此,通过 BBB 是脑部疾病疗法发展的主要障碍15,16。脑内注射是通过外科手术将目标物质直接注射到大脑中来克服这一缺点 17,18,19。然而,应考虑手术干预的副作用,特别是因为针头在手术过程中会损害神经元细胞。

椎管腔内给药
鞘内给药 - 将药物施入椎管或蛛网膜下腔 - 通过脑脊液 (CSF) 将药物输送到大脑或神经轴,是脑内注射的可行替代方案。鞘内注射可根据注射部位细分:侧脑室、大脑池和脊髓腔。这三种途径都允许药物或细胞在整个脑脊液中扩散到大脑和脊髓中。在脑室内和脑池内注射的情况下,药物输送到大脑可能更有效,因为药物是在靠近大脑的地方注射的。然而,椎管腔内注射的优点是不需要全身麻醉或手术插入脑室内储液器,一般安全20,必要时可以重复进行。

本研究的目的是验证椎管腔内给药作为将 MSC 输送到大脑和脊髓的一种手段。首先,在大鼠模型中建立椎管内腔。接下来,用亲脂性示踪剂 DiD (DiIC18(5);1,1-二十八烷基-3,3,3,3-四甲基吲哚二羰菜盐、4-氯苯磺酸盐)标记 MSCs,以评估干细胞迁移到脊髓和大脑的效率。进行离体光学成像以评估细胞分散。这种简单的方案可以在没有手术干预的情况下进行,不仅可以用于管理干细胞,还可以用于管理药物、抗体、造影剂和其他旨在输送到脊髓或大脑的物质。

研究方案

注意:这项研究已获得三星医疗中心三星生物医学研究所 (SBRI) 机构动物护理和使用委员会(批准号:20170125001,日期:2017 年 1 月 25 日)的批准。作为国际实验动物护理评估和认证协会的认可机构,SBRI 按照实验动物资源研究所制定的指导方针行事。

1. 人沃顿氏胶源 MSC 的制备

  1. 人沃顿氏胶源间充质干细胞 (WJ-MSC) 的培养
    1. 在 37 °C 水浴中快速解冻一小瓶人 WJ-MSC。将 WJ-MSC 转移到 50 mL 锥形管中,并添加体积至少为细胞体积 (v/v) 的生长培养基。上下吹打以悬浮细胞。
    2. 以 300 × g 离心 5 分钟。小心弃去上清液,并重悬细胞。
      注意:小心不要丢弃细胞沉淀。
    3. 在 T175 培养瓶中以 5,000-6,000 个细胞/cm2 的密度接种 WJ-MSC。在 37 °C CO2 培养箱中孵育 WJ-MSC。每 72 小时更换一次生长培养基,直到 WJ-MSC 达到 80-90% 汇合。
      注意:通常,MSC 需要 3-4 天才能达到 80-90% 的汇合度。
  2. 人 WJ-MSC 的传代培养
    1. 丢弃生长培养基,用 10 mL 磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 洗涤细胞。去除 PBS,加入 5 mL 0.25% 胰蛋白酶-乙二胺四乙酸二钠 (EDTA)(参见 材料表)。将细胞在 37 °C 下在 CO2 培养箱中孵育 3 分钟,直到 WJ-MSC 从培养瓶中分离。
    2. 加入 5 mL 含有 10% 胎牛血清的生长培养基,以中和 0.25% 胰蛋白酶-EDTA。收集细胞混合物并将其转移到 50 mL 锥形管中。用 10 mL 生长培养基洗涤细胞培养瓶,并使用无菌血清移液管将细胞收集在 50 mL 试管中。
    3. 将细胞混合物以 300 × g 离心 5 分钟。弃去上清液,将细胞重悬于 10 mL 生长培养基中,并计数 WJ-MSC 的数量。
      注意:小心不要丢弃细胞沉淀。
    4. 根据实验,以 4,000-6,000 个细胞/cm2 的密度接种 WJ-MSC。
  3. 用 DiD 染料标记 WJ-MSC 和制备用于椎管腔注射的 WJ-MSC
    注意:DiD 染料标记程序是按照制造商的说明进行的。
    1. 使用上述程序,当 WJ-MSC 达到 80% 汇合度时分离它们。将 WJ-MSC 以 1 ×10 6/mL 的密度悬浮在不含酚红的最低必需培养基 (MEM) 中,α不含血清。
    2. 每 1 mL 细胞悬液添加 5 μL DiD 标记溶液;用移液轻轻混合。
    3. 在 37 °C 下孵育 15 分钟;将细胞悬液以 300 × g 离心 5 分钟。
    4. 去除上清液,将 WJ-MSC 重悬于无酚红的 MEM α中,密度为 1 ×10 6/0.2 mL。

2. WJ-MSCs的椎管腔内注射

  1. 椎管腔内注射的准备工作
    1. 用 5% 异氟醚麻醉 6 周龄的 Sprague-Dawley 大鼠;然后,在整个手术过程中使用 2% 异氟醚保持麻醉。
      注意:在开始实验之前优化麻醉条件。
    2. 使用小动物电动剃须刀剃除手术区域。
      注意: 电动剃须刀可以用手动剃须刀和剃须凝胶代替。
    3. 使用聚维酮碘对手术区域进行消毒。用手术刀片在皮肤上做一个 3 厘米的切口。使用手术刀片和剪刀切除剩余的皮肤和肌肉组织。揭示腰椎 2-3 (L2-3) 的棘突。
  2. 通过椎管内腔注射 DiD 标记的 WJ-MSC
    1. 将大鼠置于俯卧位置。适当弯曲大鼠的脊柱以扩大相邻棘突之间的距离,使用足量的纸巾或其他有助于保持适当位置的材料。
    2. 用 1 mL DiD 标记的 WJ-MSC 填充 0.2 mL 注射器。将 23 G 注射器针头组合垂直放置在 L2 和 L3 的棘突之间,然后插入针头直至接触椎体。
    3. 当针头接触椎体时,将其缩回约 0.5 厘米,将针尖放入椎管中。倾斜注射器,并将针头尖端指向嘴部方向。在 1 分钟内将 WJ-MSC 注射到脊髓腔中。
      注意:应提前优化注射速度。
    4. 注射后,将注射器从椎管中完全取出。缝合切口,然后使用聚维酮碘对手术部位进行消毒。
  3. 术后治疗
    1. 稳定并抑制大鼠以防止任何移动,将其以 45° 角倒置 15 分钟,同时它仍处于麻醉状态。15 分钟后,停止麻醉,等待大鼠苏醒。

3. 椎管腔内注射的评价

  1. 注射后 0 、 6 和 12 小时对大鼠实施安乐死并分离大脑和脊髓
    1. 用 5% 异氟醚麻醉实验动物;在 PBS 灌注期间用 2% 异氟醚维持麻醉。
    2. 使用手术剪刀在隔膜下方切开一个切口。用镊子打开切口,向嘴部切开胸腔,露出心脏。
    3. 在右心房打一个小孔,将蝶针插入左心室。将 100 mL 冷 PBS 灌注到左心室中 4-5 分钟,直到肝脏清除血液。
    4. 灌注后,使用手术刀片沿纵向平面从头部到尾部的背面做一个长切口。使用手术剪刀、镊子和骨刀隔离剩余的大脑和整个脊柱。去除剩余的肋骨、连接的骨头和肉。
  2. 离体 DiD 荧光光学成像
    1. 将分离的组织放入光学成像设备的腔室中。
    2. 设置参数如下:发射,700 nm;激发,605 nm;曝光时间为 2 秒,以每平方厘米/球面度的每秒光子数 (p/s/cm2/sr) 表示。捕获光学图像。
      注意:所有图像都应使用相同的照明设置(灯电压、滤光片、光圈、视野和像素合并)进行采集。
    3. 使用绘图工具为脊髓绘制三个同等大小的矩形感兴趣区域 (ROI),为大脑绘制一个圆形 ROI。测量 ROI 的荧光强度 。
  3. 从脊髓和脑组织中提取基因组 DNA (gDNA)
    1. 使用手术钳、剪刀和咬合器小心地去除颅骨和脊柱。
    2. 从颅骨和脊柱中采集大脑和脊髓。将脊髓切成三块(宫颈、胸部和腰椎)。
      注意:如果不立即分析,收获的组织必须储存在 -80 °C 下。
    3. 使用预冷的研钵、研杵和液氮研磨组织。按照制造商的说明,使用市售产品提取 gDNA。
  4. 定量实时聚合酶链反应 (qPCR)
    1. 使用分光光度计定量每个样品中 gDNA 的量。
    2. 使用每个样品 10 ng gDNA 和人黄体节杆菌ALU) 引物12,21 进行 qPCR。
    3. 使用 ΔΔCT 方法22 计算样品中 WJ-MSC 的确切数量。

结果

为了评价椎管腔内注射 MSCs 的疗效,本研究中使用了 DiD 标记的 MSCs。在将 MSC 注射到脊髓腔之前,使用光学成像和荧光显微镜在体外评估标记效果(图 1)。使用方案第 3.1 节中描述的程序用 DiD 标记试剂对 MSC 进行染色后,拍摄接种 DiD 标记的 MSC 的培养板的光学图像(图 1A)。DiD 标记的 MSC (+DiD) 以红色显示;未用 DiD 染料标?...

讨论

应根据目标疾病、患者病情和要给药的药物类型来选择间充质干细胞治疗的最佳给药途径。在细胞疗法中,包括 MSC 疗法,必须考虑通过 CSF 将干细胞直接注射到大脑中或鞘内注射,因为细胞无法通过 BBB19。与脑室内注射不同,椎管腔内注射相对无创,不会在大脑中造成神经元损伤,并且副作用风险低20。通过腰椎穿刺进入 CSF 是一种可?...

披露声明

作者没有什么可披露的。

致谢

这项研究得到了韩国国家研究基金会(NRF)的基础研究计划的资助,由教育部资助(NRF-2017R1D1A1B03035940),以及韩国健康技术研发项目通过韩国健康产业发展研究所(KHIDI)资助的资助,由韩国卫生与福利部资助(资助编号: HI14C3484 和 HI18C0560)。感谢意得辑 (www.editage.co.kr) 的英文编辑。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
0.25% Trypsin-EDTAGibco-invitrogen25200114Cell culture
Fetal bovine serumbiowestS1520Culture medium supplement
gentamicinGibco-invitrogen15710-072Culture medium supplement
Gentra Puregene Tissue KitQIAGEN158689gDNA isolation
MEM, no glutamine, no phenol redGibco51200038WJ-MSC fomulation for injection
Miminum Essential Medium alphaGibco-invitrogen12571063WJ-MSC culture medium
Power SYBR Green PCR Master MixApplied Biosystems4368577quantitative real time PCR reagent
QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR SystemThermo fisher4485694quantitative real time PCR
trypan blueGibco15250061Injection
Vybrant DiD Cell-Labeling SolutioninvitrogenV22887Stem cell labeling solution
Xenogen IVIS Spectrum systemPerkin Elmer124262Optical imaging device

参考文献

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