Injection dans la cavité intraspinale de cellules souches mésenchymateuses humaines et suivi de leur migration dans le cerveau du rat

Résumé

Plusieurs voies d’administration peuvent être utilisées pour délivrer des cellules souches mésenchymateuses (CSM) au cerveau. Dans la présente étude, les CSM ont été délivrées dans tout le neuraxisme et le cerveau par injection intra-cavité vertébrale. Des CSM ont été injectées dans les cavités vertébrales de rats, et la migration des cellules souches a été suivie et quantifiée.

Résumé

Les cellules souches mésenchymateuses (CSM) ont été étudiées pour le traitement de diverses maladies. Dans les maladies neurodégénératives impliquant des anomalies à la fois du cerveau et de la moelle épinière, la voie d’administration est très importante, car les CSM doivent migrer à la fois vers le cerveau et la moelle épinière. Cet article décrit une méthode d’administration de CSM dans le canal rachidien (injection intraspinale) qui peut cibler le cerveau et la moelle épinière dans un modèle de rat. Un million de CSM ont été injectées dans les canaux rachidiens de rats au niveau des vertèbres lombaires 2-3. Après l’administration, les rats ont été euthanasiés 0, 6 et 12 heures après l’injection. L’imagerie optique et la réaction en chaîne par polymérase quantitative en temps réel (qPCR) ont été utilisées pour suivre les CSM injectées. Les résultats de la présente étude ont démontré que les CSM administrées via la cavité vertébrale pouvaient être détectées ultérieurement dans le cerveau et la moelle épinière à 12 h. L’injection intraspinale dans la cavité a l’avantage de ne pas nécessiter d’anesthésie générale et a peu d’effets secondaires. Cependant, l’inconvénient du faible taux de migration des CSM vers le cerveau doit être surmonté.

Introduction

Cellules souches mésenchymateuses
Dans des conditions pathologiques, les CSM sécrètent des substances thérapeutiques spécifiques à la maladie par le biais d’actions paracrines¹ qui régulent les réponses immunitaires, restaurent les tissus endommagés et éliminent les substances toxiques². Par conséquent, la thérapie MSC est considérée comme plus efficace que la thérapie à cible unique dans le traitement des maladies multifactorielles telles que la maladie d’Alzheimer et la sarcopénie 3,4,5,6. De plus, contrairement aux produits pharmaceutiques, les CSM ont un effet de retour à la maison, se déplaçant vers la région du tissu endommagé en reconnaissant les cytokines inflammatoires ou les chimiokines dans le corps ^7,8. Malheureusement, seul un sous-ensemble des cellules atteint la zone endommagée, et la viabilité des CSM diminue pendant la migration 9,10,11,12. Ainsi, pour maximiser l’efficacité thérapeutique des CSM, il est nécessaire de délivrer des cellules viables au site cible. Par conséquent, lors de l’administration de CSM, il est important de choisir la voie d’administration appropriée, en fonction de la nature de la maladie cible.

Voie d’injection
Il existe de nombreuses voies par lesquelles les agents thérapeutiques sont administrés aux patients. Les méthodes les plus courantes sont l’injection intraveineuse dans la circulation systémique, l’administration orale et l’injection sous-cutanée ou intramusculaire. Dans les maladies neurodégénératives, le principal obstacle à l’administration d’agents thérapeutiques au cerveau est la barrière hémato-encéphalique (BHE). La BHE protège le cerveau des agents pathogènes externes au moyen de jonctions serrées entre les vaisseaux sanguins et le parenchyme cérébral^13,14. Cependant, la BHE empêche paradoxalement les agents thérapeutiques de pénétrer dans le parenchyme cérébral. Par conséquent, le passage par la BHE est le principal obstacle au développement de thérapies contre les maladies du cerveau^15,16. L’injection intracérébrale est réalisée pour surmonter cet inconvénient en injectant des substances cibles directement dans le cerveau par opération chirurgicale 17,18,19. Cependant, les effets secondaires des interventions chirurgicales doivent être pris en compte, d’autant plus que l’aiguille endommage les cellules neuronales pendant la procédure.

Administration de la cavité intraspinale
L’administration intrathécale - l’administration de médicaments dans le canal rachidien ou l’espace sous-arachnoïdien - délivre des médicaments au cerveau ou au neuraxie par le biais du liquide céphalo-rachidien (LCR) et constitue une alternative viable à l’injection intracérébrale. Les injections intrathécales peuvent être subdivisées en fonction du site d’injection : ventricule latéral, citerne magna et cavité vertébrale. Les trois voies permettent aux médicaments ou aux cellules de se disperser dans tout le LCR dans le cerveau et la moelle épinière. L’administration du médicament au cerveau peut être plus efficace dans le cas des injections intra-ventriculaires et intra-citerne magna, car l’agent est injecté près du cerveau. Cependant, l’injection dans la cavité intraspinale présente l’avantage de ne pas nécessiter d’anesthésie générale ou de chirurgie pour l’insertion d’un réservoir intraventriculaire, étant généralement sûre²⁰, et peut être effectuée à plusieurs reprises si nécessaire.

Le but de cette étude était de valider l’administration de CSM dans la cavité intraspinale comme moyen d’administrer des CSM au cerveau et à la moelle épinière. Tout d’abord, la cavité intraspinale a été établie dans un modèle de rat. Ensuite, les CSM ont été marquées à l’aide d’un traceur lipophile, DiD (DiIC18(5) ; sel de 1,1-dioctadécyl-3,3,3,3-tétraméthylindodicarbocyanine, 4-chlorobenzènesulfonate), afin d’évaluer l’efficacité de la migration des cellules souches vers la moelle épinière et le cerveau. Une imagerie optique ex vivo a été réalisée pour évaluer la dispersion cellulaire. Ce protocole simple peut être réalisé sans intervention chirurgicale et peut être utilisé dans le but non seulement d’administrer des cellules souches, mais également des produits pharmaceutiques, des anticorps, des produits de contraste et d’autres substances destinées à être administrées à la moelle épinière ou au cerveau.

Protocole

REMARQUE : Cette étude a été approuvée par le Comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux (numéro d’approbation : 20170125001, date : 25 janvier 2017) de l’Institut de recherche biomédicale Samsung (SBRI) du Samsung Medical Center. En tant qu’établissement accrédité par l’Association pour l’évaluation et l’accréditation de Laboratory Animal Care International, le SBRI agit conformément aux directives établies par l’Institute of Laboratory Animal Resources.

1. Préparation des CSM humaines dérivées de la gelée de Wharton

1. Culture de cellules souches mésenchymateuses dérivées de la gelée de Wharton (WJ-MSCs)
   1. Décongelez rapidement un flacon de WJ-MSCs humains dans un bain d’eau à 37 °C. Transvasez les WJ-MSC dans un tube conique de 50 mL et ajoutez un milieu de croissance à un volume au moins 10 fois supérieur à celui des cellules (v/v). Pipette de haut en bas pour suspendre les cellules.
   2. Centrifuger à 300 × g pendant 5 min. Jetez soigneusement le surnageant et remettez les cellules en suspension.
      REMARQUE : Veillez à ne pas jeter la pastille de cellule.
   3. Semez les WJ-MSC dans des flacons T175 à une densité de 5 000 à 6 000 cellules/cm². Incuber des WJ-MSC dans un incubateur à 37 °C de CO₂ . Changez le milieu de culture toutes les 72 h jusqu’à ce que les WJ-MSC atteignent 80-90 % de confluence.
      REMARQUE : En général, il faut 3 à 4 jours pour que les MSC atteignent 80 à 90 % de confluence.
2. Sous-culture de WJ-MSC humaines
   1. Jetez le milieu de croissance et lavez les cellules avec 10 ml de solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Retirer le PBS et ajouter 5 ml d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) trypsine-disodium à 0,25 % (voir le tableau des matières). Incuber les cellules à 37 °C dans un incubateur de CO₂ pendant 3 min jusqu’à ce que les WJ-MSC se détachent du ballon de culture.
   2. Ajouter 5 mL de milieu de croissance contenant 10 % de sérum fœtal bovin pour neutraliser la trypsine-EDTA à 0,25 %. Prélevez le mélange de cellules et transférez-le dans un tube conique de 50 ml. Laver le ballon de culture cellulaire avec 10 ml de milieu de croissance et prélever les cellules dans un tube de 50 ml à l’aide d’une pipette sérologique stérile.
   3. Centrifuger le mélange cellulaire à 300 × g pendant 5 min. Jetez le surnageant, remettez les cellules en suspension dans 10 mL de milieu de croissance et comptez le nombre de WJ-MSC.
      ATTENTION : Veillez à ne pas jeter la pastille de cellule.
   4. Semez des WJ-MSC à une densité de 4 000 à 6 000 cellules/cm², selon l’expérience.
3. Marquage des WJ-MSCs avec le colorant DiD et préparation des WJ-MSCs pour l’injection dans la cavité intraspinale
   REMARQUE : La procédure d’étiquetage par colorant DiD a été effectuée conformément aux instructions du fabricant.
   1. Détachez les WJ-MSC lorsqu’ils atteignent 80 % de confluence, en utilisant la procédure mentionnée ci-dessus. Suspendre les WJ-MSC à une densité de 1 × 10⁶/mL dans un milieu essentiel minimum (MEM) sans rouge de phénol α sans sérum.
   2. Ajouter 5 μL de solution de marquage DiD par 1 mL de suspension cellulaire ; Mélanger délicatement avec le pipetage.
   3. Incuber pendant 15 min à 37 °C ; Centrifuger la suspension cellulaire à 300 × g pendant 5 min.
   4. Retirer le surnageant et remettre en suspension les WJ-MSC dans des α MEM sans rouge de phénol à une densité de 1 × 10⁶/0,2 mL.

2. Injection dans la cavité intraspinale des WJ-MSCs

1. Préparation à l’injection dans la cavité intraspinale
   1. Anesthésier des rats Sprague-Dawley âgés de 6 semaines avec 5 % d’isoflurane ; Ensuite, maintenez l’anesthésie avec de l’isoflurane à 2 % tout au long de l’intervention chirurgicale.
      REMARQUE : Optimisez les conditions d’anesthésie avant de commencer l’expérience.
   2. Rasez la zone chirurgicale à l’aide d’un rasoir électrique pour petits animaux.
      REMARQUE : Le rasoir électrique peut être remplacé par un rasoir manuel et du gel à raser.
   3. Désinfectez la zone chirurgicale à l’aide de povidone iodée. Créez une incision de 3 cm dans la peau avec une lame chirurgicale. Réséquez la peau et les tissus musculaires restants à l’aide d’une lame chirurgicale et de ciseaux. Révéler les apophyses épineuses au niveau lombaire 2-3 (L2-3).
2. Injection de WJ-MSCs marquées au DiD via la cavité intraspinale
   1. Placez le rat en position couchée. Fléchissez la colonne vertébrale du rat de manière appropriée pour élargir la distance entre les apophyses épineuses adjacentes, en utilisant des quantités suffisantes de tissu en papier ou d’autres matériaux qui peuvent aider à maintenir la position appropriée.
   2. Remplissez une seringue de 1 ml avec 0,2 ml de WJ-MSCs marqués au DiD. Placez une combinaison seringue-aiguille de 23 g verticalement entre les apophyses épineuses de L2 et L3, et insérez l’aiguille jusqu’à ce qu’elle touche le corps vertébral.
   3. Lorsque l’aiguille touche le corps vertébral, rétractez-la d’environ 0,5 cm, en plaçant la pointe de l’aiguille dans le canal rachidien. Inclinez la seringue et placez la pointe de l’aiguille de manière à ce qu’elle pointe vers la direction rostrale. Injectez des WJ-MSC dans la cavité vertébrale sur une période de 1 min.
      REMARQUE : La vitesse d’injection doit être optimisée à l’avance.
   4. Après l’injection, retirez complètement la seringue du canal rachidien. Suturez l’incision, puis désinfectez le site chirurgical à l’aide de povidone iodée.
3. Traitement post-procédure
   1. Stabilisez et immobilisez le rat pour l’empêcher de bouger, en le plaçant à l’envers à un angle de 45° pendant 15 min, alors qu’il est encore sous anesthésie. Après 15 minutes, arrêtez l’anesthésie et attendez que le rat se réveille.

3. Évaluation de l’injection dans la cavité intraspinale

1. Euthanasie des rats et isolement de l’encéphale et de la moelle épinière 0, 6 et 12 h après l’injection
   1. Anesthésier les animaux de laboratoire avec 5 % d’isoflurane ; maintenir l’anesthésie avec 2 % d’isoflurane pendant la perfusion PBS.
   2. Faites une incision sous le diaphragme à l’aide de ciseaux chirurgicaux. Ouvrez l’incision avec une pince et coupez la cage thoracique en rostralement pour exposer le cœur.
   3. Faites un petit trou dans l’oreillette droite et insérez une aiguille papillon dans le ventricule gauche. Perfuser 100 mL de PBS froid dans le ventricule gauche pendant 4 à 5 minutes, jusqu’à ce que le foie soit débarrassé du sang.
   4. Après la perfusion, faites une longue incision sur le dos de la tête à la queue à l’aide d’une lame chirurgicale le long du plan longitudinal. Isolez le cerveau restant et toute la colonne vertébrale à l’aide de ciseaux chirurgicaux, de pinces et d’un coupe-os. Retirez les côtes restantes, les os connectés et la chair.
2. Imagerie optique fluorescente DiD ex vivo
   1. Placez les tissus isolés dans la chambre de l’appareil d’imagerie optique.
   2. Réglez les paramètres comme suit : émission, 700 nm ; excitation, 605 nm ; et le temps d’exposition, 2 secondes, en photons par seconde par centimètre carré par stéradian (p/s/cm²/sr). Capturez les images optiques.
      REMARQUE : Toutes les images doivent être acquises avec des paramètres d’éclairage identiques (tension de la lampe, filtres, f/stop, champ de vision et binning).
   3. Dessinez trois régions d’intérêt rectangulaires de taille équivalente pour la moelle épinière et un cercle ROI pour le cerveau à l’aide de l’outil de dessin. Mesurez les intensités fluorescentes des ROI.
3. Extraction de l’ADN génomique (ADNg) de la moelle épinière et du tissu cérébral
   1. Retirez soigneusement le crâne et la colonne vertébrale à l’aide d’une pince chirurgicale, de ciseaux et d’un rongeur.
   2. Prélever le cerveau et la moelle épinière du crâne et de la colonne vertébrale. Coupez la moelle épinière en trois morceaux (cervical, thoracique et lombaire).
      REMARQUE : Les tissus prélevés doivent être conservés à -80 °C s’ils ne sont pas analysés immédiatement.
   3. Broyez les mouchoirs à l’aide d’un mortier pré-refroidi, d’un pilon et d’azote liquide. Extrayez l’ADNg à l’aide de produits commerciaux, en suivant les instructions du fabricant.
4. Réaction en chaîne par polymérase quantitative en temps réel (qPCR)
   1. Quantifiez la quantité d’ADNg dans chaque échantillon à l’aide d’un spectrophotomètre.
   2. Effectuer une qPCR en utilisant 10 ng d’ADNg par échantillon et des amorces humaines d’Arthrobacter luteus (ALU) ^12,21.
   3. Calculer le nombre exact de WJ-MSC dans les échantillons à l’aide de la méthode ΔΔC_T ²².

Résultats

Pour évaluer l’efficacité de l’injection intraspinale de CSM, des CSM marquées au DiD ont été utilisées dans la présente étude. Avant d’injecter des CSM dans la cavité vertébrale, l’efficacité du marquage a été évaluée in vitro à l’aide de l’imagerie optique et de la microscopie à fluorescence (Figure 1). Après avoir coloré les CSM avec le réactif de marquage DiD à l’aide de la procédure décrite à la section 3.1 du proto...

Discussion

La voie d’administration optimale pour le traitement par CSM doit être choisie en fonction de la maladie cible, de l’état du patient et du type de médicament à administrer. Dans les thérapies cellulaires, y compris la thérapie MSC, l’injection directe de cellules souches dans le cerveau ou par voie intrathécale via le LCR doit être envisagée car les cellules ne peuvent pas passer à travers la BHE¹⁹. L’injection intra-cavitaire est relativement no...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin-EDTA	Gibco-invitrogen	25200114	Cell culture
Fetal bovine serum	biowest	S1520	Culture medium supplement
gentamicin	Gibco-invitrogen	15710-072	Culture medium supplement
Gentra Puregene Tissue Kit	QIAGEN	158689	gDNA isolation
MEM, no glutamine, no phenol red	Gibco	51200038	WJ-MSC fomulation for injection
Miminum Essential Medium alpha	Gibco-invitrogen	12571063	WJ-MSC culture medium
Power SYBR Green PCR Master Mix	Applied Biosystems	4368577	quantitative real time PCR reagent
QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System	Thermo fisher	4485694	quantitative real time PCR
trypan blue	Gibco	15250061	Injection
Vybrant DiD Cell-Labeling Solution	invitrogen	V22887	Stem cell labeling solution
Xenogen IVIS Spectrum system	Perkin Elmer	124262	Optical imaging device