인간 중간엽 줄기 세포의 척추강 내 주입 및 쥐 뇌로의 이동 추적

요약

중간엽 줄기세포(MSC)를 뇌에 전달하기 위해 여러 투여 경로를 사용할 수 있습니다. 본 연구에서 MSC는 척추강 내 주사를 통해 신경축과 뇌 전체에 전달되었습니다. MSC를 쥐의 척추강에 주입하고 줄기세포 이동을 추적하고 정량화했습니다.

초록

중간엽 줄기세포(MSC)는 다양한 질병의 치료를 위해 연구되어 왔습니다. 뇌와 척수 모두에 결손이 있는 신경퇴행성 질환의 경우, MSC는 뇌와 척수 모두로 이동해야 하기 때문에 투여 경로가 매우 중요합니다. 이 논문은 쥐 모델에서 뇌와 척수를 표적으로 할 수 있는 MSC를 척추관에 투여하는 방법(척추강 내 주사)을 설명합니다. 100만 개의 MSC를 요추 2-3 수준에서 쥐의 척추관에 주입했습니다. 투여 후, 쥐는 주입 후 0, 6 및 12 시간에 안락사되었습니다. 주입된 MSC를 추적하기 위해 광학 이미징 및 정량적 실시간 중합효소 연쇄 반응(qPCR)을 사용했습니다. 본 연구의 결과는 척추강을 통해 투여된 MSC가 12시간에 뇌와 척수 모두에서 검출될 수 있음을 보여주었습니다. 척추강 내 주사는 전신 마취가 필요하지 않고 부작용이 거의 없다는 장점이 있습니다. 그러나 MSC가 뇌로 이동하는 속도가 낮다는 단점은 극복해야 합니다.

서문

중간엽 줄기세포
질병 상태에서 MSC는 부분비 작용¹을 통해 면역 반응을 조절하고 손상된 조직을 회복시키며 독성 물질을 제거하는 것으로 보고된 질병 특이적 치료 물질2을 분비^합니다. 따라서 MSC 요법은 알츠하이머병 및 근감소증과 같은 다인자성 질환을 치료하는 데 단일 표적 요법보다 더 효과적인 것으로 간주됩니다 3,4,5,6. 또한, 의약품과 달리 MSC는 체내 염증성 사이토카인 또는 케모카인을 인식하여 손상된 조직 부위로 이동하는 원점 복귀 효과가 있습니다 ^7,8. 불행히도, 세포의 하위 집합 만이 손상된 영역에 도달하고 마이그레이션 중에 MSC의 생존력이 감소합니다^{9 , 10 , 11 , 12}. 따라서 MSC의 치료 효능을 극대화하기 위해서는 생존 가능한 세포를 표적 부위에 전달해야 합니다. 따라서 MSC를 투여할 때 대상 질환의 특성에 따라 적절한 투여 경로를 선택하는 것이 중요합니다.

사출 경로
치료제가 환자에게 투여되는 경로는 다양합니다. 가장 일반적인 방법은 전신 순환계에 정맥 주사, 경구 투여, 피하 또는 근육 주사입니다. 신경퇴행성 질환에서 치료제를 뇌에 전달하는 데 있어 가장 큰 장애물은 혈액뇌장벽(BBB)입니다. BBB는 혈관과 뇌 실질 사이의 긴밀한 연접을 통해 외부 병원체로부터 뇌를 보호합니다^13,14. 그러나 BBB는 역설적으로 치료제가 뇌 실질로 들어가는 것을 막기도 합니다. 그러므로, BBB를 통과하는 것은 뇌 질환 치료제 개발의 주요 장애물이다^15,16. 이러한 단점을 극복하기 위해 뇌내주사는 외과적 수술을 통해 표적 물질을 뇌에 직접 주입함으로써 시행된다 17,18,19. 그러나 외과적 개입의 부작용은 특히 시술 중에 바늘이 신경 세포를 손상시키기 때문에 고려해야 합니다.

척추내강 투여
척추내 투여(척추관 또는 지주막하 공간으로 약물을 투여하는 것)는 뇌척수액(CSF)을 통해 뇌 또는 신경축으로 약물을 전달하며 뇌내 주사에 대한 실행 가능한 대안입니다. 척추내 주사는 주사 부위에 따라 세분될 수 있습니다: 외심실, 수조 마그나, 척추강. 세 가지 경로 모두 약물 또는 세포가 뇌척수액을 통해 뇌와 척수로 분산되도록 합니다. 뇌로의 약물 전달은 뇌내 방실 및 수체 내 마그나 주사의 경우 약제가 뇌 가까이에서 주입되기 때문에 더 효율적일 수 있습니다. 그러나, 척수강 내 주사는 뇌실내 저수지를 삽입하기 위해 전신 마취나 수술이 필요하지 않고, 일반적으로 안전하며^{, 20} 필요한 경우 반복적으로 시행할 수 있다는 장점이 있다.

이 연구의 목적은 MSC를 뇌와 척수 모두에 전달하는 수단으로 척추강 내 투여를 검증하는 것이었습니다. 첫째, 척추내강(intraspinal cavity)은 쥐 모델(rat model)에서 확립되었다. 다음으로, MSC를 친유성 추적자인 DiD(DiIC18(5), 1,1-dioctadecyl-3,3,3,3-tetramethylindodicarbocyanine, 4-chlorobenzenesulfonate salt)로 표지하여 척수와 뇌로의 줄기세포 이동 효율성을 평가했습니다. 세포 분산을 평가하기 위해 생체 외 광학 이미징을 수행했습니다. 이 간단한 프로토콜은 외과적 개입 없이 수행할 수 있으며 줄기세포뿐만 아니라 의약품, 항체, 조영제 및 척수 또는 뇌에 전달되는 기타 물질을 투여하는 목적으로 사용될 수 있습니다.

프로토콜

참고: 본 연구는 삼성서울병원 삼성바이오메디컬연구소(SBRI) 동물관리위원회(승인번호: 20170125001, 일자: 2017년 1월 25일)의 승인을 받았습니다. 국제 실험실 동물 관리 평가 및 인증 협회(Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International)의 공인 시설인 SBRI는 실험실 동물 자원 연구소(Institute of Laboratory Animal Resources)에서 정한 지침에 따라 행동합니다.

1. 인간 Wharton's jelly 유래 MSC의 제조

1. 인간 와튼 젤리 유래 중간엽 줄기세포(WJ-MSCs) 배양
   1. 인간 WJ-MSC 바이알을 37°C 수조에서 빠르게 해동합니다. WJ-MSC를 50mL 원뿔형 튜브로 옮기고 세포의 부피(v/v)의 10배 이상의 부피로 성장 배지를 추가합니다. 세포를 현탁시키기 위해 위아래로 피펫을 사용합니다.
   2. 300 × g 에서 5분 동안 원심분리기. 상층액을 조심스럽게 버리고 세포를 다시 현탁시킵니다.
      알림: 셀 펠릿을 버리지 않도록 주의하십시오.
   3. 5,000-6,000 cells/cm의 밀도로 T175 플라스크에 WJ-MSC를 파종합니다². WJ-MSC를 37°C CO₂ 인큐베이터에서 배양합니다. WJ-MSC가 80-90% 포화도에 도달할 때까지 72시간마다 성장 배지를 변경합니다.
      참고: 일반적으로 MSC가 80-90% 포화도에 도달하는 데 3-4일이 걸립니다.
2. 인간 WJ-MSC의 Subcultivation
   1. 성장 배지를 버리고 10mL의 인산염 완충 식염수(PBS)로 세포를 세척합니다. PBS를 제거하고 0.25% 트립신-디소듐 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 5mL를 추가합니다( 재료표 참조). WJ-MSC가 배양 플라스크에서 분리될 때까지 3분 동안 CO₂ 인큐베이터에서 37°C의 세포를 배양합니다.
   2. 0.25% 트립신-EDTA를 중화하기 위해 10% 소 태아 혈청을 함유한 성장 배지 5mL를 첨가합니다. 세포 혼합물을 모아 50mL 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 세포 배양 플라스크를 10mL의 성장 배지로 세척하고 멸균 혈청학적 피펫을 사용하여 50mL 튜브에 세포를 수집합니다.
   3. 세포 혼합물을 300 × g 에서 5분 동안 원심분리합니다. 상등액을 버리고 10mL의 성장 배지에 세포를 재현탁시킨 다음 WJ-MSC의 수를 계산합니다.
      주의 : 세포 펠릿을 버리지 않도록 주의하십시오.
   4. 실험에 따라 4,000-6,000 cells/cm²의 밀도에서 WJ-MSC를 파종합니다.
3. DiD 염료로 WJ-MSC 라벨링 및 척추강 내 주사를 위한 WJ-MSC 준비
   참고: DiD 염료 라벨링 절차는 제조업체의 지침에 따라 수행되었습니다.
   1. WJ-MSC가 80% 농도에 도달하면 위에서 언급한 절차를 사용하여 분리합니다. 혈청 없이 페놀-레드가 없는 최소 필수 배지(MEM) α에서 1 × 10⁶/mL의 밀도로 WJ-MSC를 현탁합니다.
   2. 세포 현탁액 1mL당 5μL의 DiD 라벨링 용액을 추가합니다. 피펫팅으로 부드럽게 섞습니다.
   3. 37 ° C에서 15 분 동안 배양하십시오. 300 × g 에서 5분 동안 세포 현탁액을 원심분리합니다.
   4. 상등액을 제거하고 WJ-MSC를 1 × 10⁶/0.2 mL의 밀도로 페놀-레드가 없는 MEM α에 재현탁합니다.

2. WJ-MSC의 척수강 내 주사

1. 척추강 내 주사 준비
   1. 6주 된 Sprague-Dawley 쥐를 5% 이소플루란으로 마취합니다. 그런 다음 수술 과정 내내 2% 이소플루란으로 마취를 유지하십시오.
      참고: 실험을 시작하기 전에 마취 상태를 최적화하십시오.
   2. 작은 동물의 경우 전기 면도기를 사용하여 수술 부위를 면도합니다.
      알림: 전기 면도기는 수동 면도기와 면도 젤로 교체할 수 있습니다.
   3. 포비돈 요오드를 사용하여 수술 부위를 소독합니다. 수술용 칼날로 피부를 3cm 절개합니다. 수술용 칼날과 가위를 사용하여 남은 피부와 근육 조직을 절제합니다. 요추 2-3(L2-3)의 가시돌기를 밝힌다.
2. 척수강내(intraspinal cavity)를 통한 DiD 표지 WJ-MSC 주입
   1. 쥐를 엎드린 자세로 눕히십시오. 적절한 위치를 유지하는 데 도움이 될 수 있는 충분한 양의 종이 티슈 또는 기타 재료를 사용하여 인접한 가시돌기 사이의 거리를 넓히기 위해 쥐의 척추를 적절하게 구부립니다.
   2. 1mL 주사기에 0.2mL의 DiD 표지 WJ-MSC를 채웁니다. L2와 L3의 가시돌기 사이에 23G 주사기-바늘 조합을 수직으로 놓고 바늘이 척추체에 닿을 때까지 삽입합니다.
   3. 바늘이 척추체에 닿을 때 바늘 끝을 척추관에 놓고 약 0.5cm 후퇴시킵니다. 주사기를 기울이고 바늘 끝을 방향을 가리키도록 놓습니다. 1분에 걸쳐 WJ-MSC를 척추강에 주입합니다.
      참고: 사출 속도는 사전에 최적화해야 합니다.
   4. 주사 후 척추관에서 주사기를 완전히 제거합니다. 절개 부위를 봉합한 후 포비돈 요오드를 사용하여 수술 부위를 소독합니다.
3. 시술 후 치료
   1. 쥐가 움직이지 않도록 안정시키고 제지하여 마취 상태에서 15분 동안 45° 각도로 거꾸로 놓습니다. 15분 후 마취를 중단하고 쥐가 깨어날 때까지 기다립니다.

3. 척추강 내 주사의 평가

1. 쥐의 안락사와 주사 후 0, 6, 12시간에 뇌와 척수의 격리
   1. 실험 동물을 5% 이소플루란으로 마취합니다. PBS 관류 중 2% 이소플루란으로 마취를 유지합니다.
   2. 수술용 가위를 사용하여 횡격막 아래를 절개합니다. 집게로 절개 부위를 열고 흉곽을 가로로 잘라 심장을 노출시킵니다.
   3. 우심방에 작은 구멍을 뚫고 좌심실에 나비 바늘을 삽입합니다. 간에서 혈액이 제거될 때까지 4-5분 동안 100mL의 차가운 PBS를 좌심실로 관류합니다.
   4. 관류 후 머리부터 꼬리까지 세로면을 따라 수술용 칼날을 사용하여 뒤쪽을 길게 절개합니다. 수술용 가위, 집게, 뼈 절단기를 사용하여 나머지 뇌와 척추 전체를 분리한다. 남은 갈비뼈, 연결된 뼈 및 살을 제거합니다.
2. Ex vivo DiD 형광 광학 이미징
   1. 분리된 조직을 광학 이미징 장치의 챔버에 놓습니다.
   2. 매개변수를 다음과 같이 설정하십시오: 방출, 700nm; 여기, 605 nm; 노출 시간, 2초, 스테라디안당 센티미터 제곱당 초당 광자(p/s/cm²/sr). 광학 이미지를 캡처합니다.
      참고: 모든 이미지는 동일한 조명 설정(램프 voltage, 필터, f/stop, field of view 및 binning).
   3. 그리기 도구를 사용하여 척수에 대해 동일한 크기의 직사각형 관심 영역(ROI) 3개와 뇌에 대한 원 ROI 1개를 그립니다. ROI의 형광 강도를 측정합니다.
3. 척수와 뇌 조직에서 게놈 DNA(gDNA) 추출
   1. 수술용 집게, 가위, 롱거를 사용하여 두개골과 척추를 조심스럽게 제거합니다.
   2. 두개골과 척추에서 뇌와 척수를 채취합니다. 척수를 세 조각(경추, 흉추, 요추)으로 자릅니다.
      참고: 수확된 조직은 즉시 분석하지 않는 경우 -80°C에서 보관해야 합니다.
   3. 미리 식힌 절구, 절굿공이 및 액체 질소를 사용하여 조직을 분쇄합니다. 제조업체의 지침에 따라 상용 제품을 사용하여 gDNA를 추출합니다.
4. 정량적 실시간 중합효소연쇄반응(qPCR)
   1. 분광 광도계를 사용하여 각 샘플의 gDNA의 양을 정량화합니다.
   2. 샘플당 10ng의 gDNA와 인간 Arthrobacter luteus(ALU) 프라이머^12,21을 사용하여 qPCR을 수행합니다.
   3. ΔΔC_T 방법²²를 사용하여 샘플의 정확한 WJ-MSC 수를 계산합니다.

결과

MSC의 척추강 내 주사의 효능을 평가하기 위해 본 연구에서는 DiD 표지 MSC를 사용했습니다. MSC를 척추강에 주입하기 전에 광학 이미징 및 형광 현미경을 사용하여 in vitro에서 라벨링 효능을 평가했습니다(그림 1). 프로토콜 섹션 3.1에 설명된 절차를 사용하여 DiD 라벨링 시약으로 MSC를 염색한 후, DiD 라벨링된 MSC가 파종된 배양 플레이트의 광학 이미지?...

토론

MSC를 치료하기 위한 최적의 투여 경로는 대상 질환, 환자의 상태 및 투여할 약물의 유형에 따라 선택해야 합니다. MSC 요법을 포함한 세포 치료에서는 줄기세포가 BBB를 통과할 수 없기 때문에 줄기세포를 뇌에 직접 주입하거나 뇌척수액을 통해 세포내 주입을 고려해야 합니다¹⁹. 척수강 내 주사는 상대적으로 비침습적이며, 뇌내 주사와 달리 뇌에 신경 손...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin-EDTA	Gibco-invitrogen	25200114	Cell culture
Fetal bovine serum	biowest	S1520	Culture medium supplement
gentamicin	Gibco-invitrogen	15710-072	Culture medium supplement
Gentra Puregene Tissue Kit	QIAGEN	158689	gDNA isolation
MEM, no glutamine, no phenol red	Gibco	51200038	WJ-MSC fomulation for injection
Miminum Essential Medium alpha	Gibco-invitrogen	12571063	WJ-MSC culture medium
Power SYBR Green PCR Master Mix	Applied Biosystems	4368577	quantitative real time PCR reagent
QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System	Thermo fisher	4485694	quantitative real time PCR
trypan blue	Gibco	15250061	Injection
Vybrant DiD Cell-Labeling Solution	invitrogen	V22887	Stem cell labeling solution
Xenogen IVIS Spectrum system	Perkin Elmer	124262	Optical imaging device