Injeção intraespinhal de células-tronco mesenquimais humanas e rastreamento de sua migração para o cérebro de ratos

Resumo

Várias vias de administração podem ser usadas para fornecer células-tronco mesenquimais (MSCs) ao cérebro. No presente estudo, as CTMs foram administradas em todo o neuroeixo e cérebro por meio de injeção intra-cavitária espinhal. As CTMs foram injetadas nas cavidades espinhais de ratos e a migração de células-tronco foi rastreada e quantificada.

Resumo

As células-tronco mesenquimais (CTMs) têm sido estudadas para o tratamento de várias doenças. Em doenças neurodegenerativas envolvendo defeitos no cérebro e na medula espinhal, a via de administração é muito importante, porque as MSCs devem migrar para o cérebro e a medula espinhal. Este artigo descreve um método para administrar MSCs no canal espinhal (injeção intraespinhal cavidade) que pode atingir o cérebro e a medula espinhal em um modelo de rato. Um milhão de CTMs foram injetadas nos canais espinhais de ratos ao nível das vértebras lombares 2-3. Após a administração, os ratos foram eutanasiados 0, 6 e 12 h após a injeção. Imagens ópticas e reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real (qPCR) foram usadas para rastrear as MSCs injetadas. Os resultados do presente estudo demonstraram que as CTMs administradas através da cavidade espinhal podem ser detectadas posteriormente no cérebro e na medula espinhal em 12 h. A injeção intraespinhal tem a vantagem de não necessitar de anestesia geral e tem poucos efeitos colaterais. No entanto, a desvantagem da baixa taxa de migração de MSCs para o cérebro deve ser superada.

Introdução

Células-tronco mesenquimais
Em condições de doença, as MSCs secretam substâncias terapêuticas específicas da doença por meio de ações parácrinas¹ que foram relatadas para regular as respostas imunes, restaurar tecidos danificados e remover substâncias tóxicas². Portanto, a terapia com CTM é considerada mais eficaz do que a terapia de alvo único no tratamento de doenças multifatoriais, como doença de Alzheimer e sarcopenia 3,4,5,6. Além disso, em contraste com os produtos farmacêuticos, as MSCs têm um efeito homing, movendo-se para a região do tecido danificado, reconhecendo citocinas inflamatórias ou quimiocinas no corpo ^7,8. Infelizmente, apenas um subconjunto das células atinge a área danificada, e a viabilidade das MSCs diminui durante a migração 9,10,11,12. Assim, para maximizar a eficácia terapêutica das CTMs, é necessário entregar células viáveis ao local alvo. Portanto, ao administrar MSCs, é importante escolher a via de administração adequada, com base na natureza da doença-alvo.

Via de injeção
Existem inúmeras vias pelas quais os agentes terapêuticos são administrados aos pacientes. Os métodos mais comuns são injeção intravenosa na circulação sistêmica, administração oral e injeção subcutânea ou intramuscular. Nas doenças neurodegenerativas, o principal obstáculo na entrega de agentes terapêuticos ao cérebro é a barreira hematoencefálica (BHE). A BHE protege o cérebro de patógenos externos por meio de junções apertadas entre os vasos sanguíneos e o parênquima cerebral^13,14. No entanto, a BHE também impede paradoxalmente a entrada de agentes terapêuticos no parênquima cerebral. Portanto, a passagem pela BHE é o principal obstáculo no desenvolvimento de terapias para doenças cerebrais ^15,16. A injeção intracerebral é realizada para superar essa desvantagem, injetando substâncias-alvo diretamente no cérebro por meio de operação cirúrgica 17,18,19. No entanto, os efeitos colaterais das intervenções cirúrgicas devem ser considerados, especialmente porque a agulha danifica as células neuronais durante o procedimento.

Administração intraespinhal
A administração intratecal - a administração de medicamentos no canal espinhal ou no espaço subaracnóideo - fornece medicamentos ao cérebro ou ao neuroeixo através do líquido cefalorraquidiano (LCR) e é uma alternativa viável à injeção intracerebral. As injeções intratecais podem ser subdivididas de acordo com o local da injeção: ventrículo lateral, cisterna magna e cavidade espinhal. Todas as três rotas permitem que drogas ou células se dispersem por todo o LCR no cérebro e na medula espinhal. A administração do medicamento ao cérebro pode ser mais eficiente no caso de injeções intracerebroventriculares e intracisterna magna porque o agente é injetado próximo ao cérebro. No entanto, a injeção intraespinhal tem as vantagens de não necessitar de anestesia geral ou cirurgia para inserção de reservatório intraventricular, sendo geralmente segura²⁰, podendo ser realizada repetidamente, se necessário.

O objetivo deste estudo foi validar a administração da cavidade intraespinhal como meio de fornecer MSCs ao cérebro e à medula espinhal. Primeiro, a cavidade intraespinhal foi estabelecida em um modelo de rato. Em seguida, as CTMs foram marcadas com um marcador lipofílico, DiD (DiIC18(5); 1,1-dioctadecil-3,3,3,3-tetrametilindodicarbocianina, sal de 4-clorobenzenossulfonato), para avaliar a eficiência da migração de células-tronco para a medula espinhal e cérebro. Imagens ópticas ex vivo foram realizadas para avaliar a dispersão celular. Este protocolo simples pode ser realizado sem intervenção cirúrgica e pode ser usado não apenas para administrar células-tronco, mas também produtos farmacêuticos, anticorpos, meios de contraste e outras substâncias destinadas a serem entregues à medula espinhal ou ao cérebro.

Protocolo

NOTA: Este estudo foi aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (número de aprovação: 20170125001, data: 25 de janeiro de 2017) do Samsung Biomedical Research Institute (SBRI) no Samsung Medical Center. Como uma instalação credenciada pela Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International, o SBRI atua de acordo com as diretrizes estabelecidas pelo Institute of Laboratory Animal Resources.

1. Preparação de MSCs derivadas de geléia de Wharton humana

1. Cultivo de células-tronco mesenquimais derivadas de gelatina de Wharton humana (WJ-MSCs)
   1. Descongele rapidamente um frasco de WJ-MSCs humanas em banho-maria a 37 °C. Transfira as WJ-MSCs para um tubo cônico de 50 mL e adicione meio de crescimento a um volume de pelo menos 10 vezes o das células (v / v). Pipet para cima e para baixo para suspender as células.
   2. Centrifugue a 300 × g por 5 min. Descarte cuidadosamente o sobrenadante e ressuspenda as células.
      NOTA: Tenha cuidado para não descartar o pellet celular.
   3. Semear WJ-MSCs em frascos T175 a uma densidade de 5.000-6.000 células/cm². Incubar WJ-MSCs em uma incubadora de CO₃₇ °C 2. Troque o meio de crescimento a cada 72 h até que as WJ-MSCs atinjam 80-90% de confluência.
      NOTA: Geralmente, leva de 3 a 4 dias para que as MSCs atinjam 80-90% de confluência.
2. Subcultivo de WJ-MSCs humanas
   1. Descarte o meio de crescimento e lave as células com 10 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS). Remova o PBS e adicione 5 mL de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) dissódico a 0,25% (consulte a Tabela de Materiais). Incubar as células a 37 °C numa incubadora de CO₂ durante 3 minutos até que as WJ-MSC se desprendam do balão de cultura.
   2. Adicione 5 mL de meio de crescimento contendo 10% de soro fetal bovino para neutralizar a tripsina-EDTA a 0,25%. Recolha a mistura de células e transfira-a para um tubo cónico de 50 ml. Lavar o balão de cultura de células com 10 ml de meio de cultura e recolher as células num tubo de 50 ml utilizando uma pipeta serológica estéril.
   3. Centrifugue a mistura de células a 300 × g por 5 min. Descarte o sobrenadante, ressuspenda as células em 10 mL de meio de crescimento e conte o número de WJ-MSCs.
      CUIDADO: Tenha cuidado para não descartar o pellet celular.
   4. Semeie WJ-MSCs a uma densidade de 4.000-6.000 células/^cm2, dependendo do experimento.
3. Marcação de WJ-MSCs com corante DiD e a preparação de WJ-MSCs para injeção intraespinhal
   NOTA: O procedimento de rotulagem do corante DiD foi realizado seguindo as instruções do fabricante.
   1. Retire as WJ-MSCs quando atingirem 80% de confluência, usando o procedimento mencionado acima. Suspenda WJ-MSCs a uma densidade de 1 × 10⁶ / mL em meio essencial mínimo (MEM) sem vermelho de fenol α sem soro.
   2. Adicione 5 μL de solução de marcação DiD por 1 mL de suspensão celular; misture delicadamente com pipetagem.
   3. Incubar durante 15 min a 37 °C; Centrifugar a suspensão celular a 300 × g durante 5 min.
   4. Remova o sobrenadante e ressuspenda as WJ-MSCs em α MEM sem vermelho de fenol a uma densidade de 1 × 10⁶ / 0,2 mL.

2. Injeção intraespinhal de WJ-MSCs

1. Preparação para injeção intraespinhal
   1. Anestesiar ratos Sprague-Dawley de 6 semanas de idade com isoflurano a 5%; Em seguida, manter a anestesia com isoflurano a 2% durante todo o procedimento cirúrgico.
      NOTA: Otimize as condições anestésicas antes de iniciar o experimento.
   2. Depile a área cirúrgica usando um barbeador elétrico para pequenos animais.
      NOTA: O barbeador elétrico pode ser substituído por um barbeador manual e gel de barbear.
   3. Desinfetar a área cirúrgica com iodopovidona. Faça uma incisão de 3 cm na pele com uma lâmina cirúrgica. Ressecção a pele e o tecido muscular restantes usando uma lâmina cirúrgica e uma tesoura. Revele os processos espinhosos na lombar 2-3 (L2-3).
2. Injeção de WJ-MSCs marcadas com DiD através da cavidade intraespinhal
   1. Coloque o rato em decúbito ventral. Flexione a coluna do rato adequadamente para aumentar a distância entre os processos espinhosos adjacentes, usando quantidades suficientes de tecido de papel ou outros materiais que possam ajudar a manter a posição apropriada.
   2. Encha uma seringa de 1 mL com 0,2 mL de WJ-MSCs marcados com DiD. Coloque uma combinação de seringa-agulha de 23 G verticalmente entre os processos espinhosos de L2 e L3 e insira a agulha até que ela toque o corpo vertebral.
   3. Quando a agulha tocar o corpo vertebral, retraia-a em aproximadamente 0,5 cm, colocando a ponta da agulha no canal vertebral. Incline a seringa e coloque a ponta da agulha de forma que aponte para a direção rostral. Injete WJ-MSCs na cavidade espinhal durante um período de 1 minuto.
      NOTA: A velocidade de injeção deve ser otimizada com antecedência.
   4. Após a injeção, remova completamente a seringa do canal espinhal. Suturar a incisão e, em seguida, desinfetar o local cirúrgico com iodopovidona.
3. Tratamento pós-procedimento
   1. Estabilize e contenha o rato para evitar qualquer movimento, colocando-o de cabeça para baixo em um ângulo de 45° por 15 min, enquanto ainda estiver sob anestesia. Após 15 minutos, interrompa a anestesia e espere o rato acordar.

3. Avaliação da injeção intraespinhal

1. Eutanásia dos ratos e isolamento do cérebro e da medula espinhal 0, 6 e 12 h após a injeção
   1. Anestesiar os animais experimentais com isoflurano a 5%; manter a anestesia com isoflurano a 2% durante a perfusão da PBS.
   2. Faça uma incisão abaixo do diafragma usando uma tesoura cirúrgica. Abra a incisão com uma pinça e corte a caixa torácica rostralmente para expor o coração.
   3. Faça um pequeno orifício no átrio direito e insira uma agulha borboleta no ventrículo esquerdo. Perfunda 100 mL de PBS frio no ventrículo esquerdo por 4-5 min, até que o fígado esteja livre de sangue.
   4. Após a perfusão, faça uma longa incisão na parte de trás da cabeça à cauda usando uma lâmina cirúrgica ao longo do plano longitudinal. Isole o cérebro restante e toda a coluna usando uma tesoura cirúrgica, fórceps e um cortador de ossos. Remova as costelas restantes, os ossos conectados e a carne.
2. Imagem óptica fluorescente DiD ex vivo
   1. Coloque os tecidos isolados na câmara do dispositivo de imagem óptica.
   2. Defina os parâmetros da seguinte forma: emissão, 700 nm; excitação, 605 nm; e tempo de exposição, 2 segundos, como fótons por segundo por centímetro quadrado por esterradiano (p / s / cm² / sr). Capture as imagens ópticas.
      NOTA: Todas as imagens devem ser adquiridas com configurações de iluminação idênticas (lamp voltage, filtros, f/stop, campo de view e binning).
   3. Desenhe três regiões retangulares de interesse (ROIs) de tamanho equivalente para a medula espinhal e uma ROI circular para o cérebro usando a ferramenta de desenho. Meça as intensidades fluorescentes dos ROIs.
3. Extração de DNA genômico (gDNA) da medula espinhal e do tecido cerebral
   1. Remova o crânio e a coluna cuidadosamente usando pinças cirúrgicas, tesouras e um rongeur.
   2. Colha o cérebro e a medula espinhal do crânio e da coluna. Corte a medula espinhal em três partes (cervical, torácica e lombar).
      NOTA: Os tecidos colhidos devem ser armazenados a -80 °C se não forem analisados imediatamente.
   3. Triture os lenços usando um almofariz pré-resfriado, pilão e nitrogênio líquido. Extraia gDNA usando produtos comerciais, seguindo as instruções do fabricante.
4. Reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real (qPCR)
   1. Quantificar a quantidade de gDNA em cada amostra usando um espectrofotômetro.
   2. Realize qPCR usando 10 ng de gDNA por amostra e primers humanos para Arthrobacter luteus (ALU)^12,21.
   3. Calcular o número exacto de WJ-MSC nas amostras utilizando o método ΔΔC_T ²².

Resultados

Para avaliar a eficácia da injeção intraespinhal de MSCs, MSCs marcadas com DiD foram usadas no presente estudo. Antes de injetar MSCs na cavidade espinhal, a eficácia da marcação foi avaliada in vitro usando imagens ópticas e microscopia de fluorescência (Figura 1). Após a coloração das MSCs com o reagente de marcação DiD usando o procedimento descrito na seção 3.1 do protocolo, foram obtidas imagens ópticas das placas de cultura nas quais a...

Discussão

A via ideal de administração para o tratamento com MSCs deve ser escolhida dependendo da doença-alvo, da condição do paciente e do tipo de medicamento a ser administrado. Em terapias celulares, incluindo a terapia com MSC, a injeção direta de células-tronco no cérebro ou por via intratecal através do LCR deve ser considerada, pois as células não podem passar pela BHE¹⁹. A injeção intraespinhal é relativamente não invasiva e não causa danos neurona...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin-EDTA	Gibco-invitrogen	25200114	Cell culture
Fetal bovine serum	biowest	S1520	Culture medium supplement
gentamicin	Gibco-invitrogen	15710-072	Culture medium supplement
Gentra Puregene Tissue Kit	QIAGEN	158689	gDNA isolation
MEM, no glutamine, no phenol red	Gibco	51200038	WJ-MSC fomulation for injection
Miminum Essential Medium alpha	Gibco-invitrogen	12571063	WJ-MSC culture medium
Power SYBR Green PCR Master Mix	Applied Biosystems	4368577	quantitative real time PCR reagent
QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System	Thermo fisher	4485694	quantitative real time PCR
trypan blue	Gibco	15250061	Injection
Vybrant DiD Cell-Labeling Solution	invitrogen	V22887	Stem cell labeling solution
Xenogen IVIS Spectrum system	Perkin Elmer	124262	Optical imaging device