İnsan Mezenkimal Kök Hücrelerinin İntraspinal Kavite Enjeksiyonu ve Sıçan Beynine Migrasyonlarının İzlenmesi

Özet

Mezenkimal kök hücreleri (MSC'ler) beyne iletmek için çeşitli uygulama yolları kullanılabilir. Bu çalışmada, MSC'ler intraspinal kavite enjeksiyonu yoluyla nöraksi ve beyin boyunca verildi. MSC'ler sıçanların omurga boşluklarına enjekte edildi ve kök hücre göçü izlendi ve ölçüldü.

Özet

Mezenkimal kök hücreler (MSC'ler) çeşitli hastalıkların tedavisi için incelenmiştir. Hem beyinde hem de omurilikte kusurları içeren nörodejeneratif hastalıklarda, uygulama yolu çok önemlidir, çünkü MSC'lerin hem beyne hem de omuriliğe göç etmesi gerekir. Bu makale, bir sıçan modelinde beyni ve omuriliği hedefleyebilen MSC'lerin omurilik kanalına (intraspinal kavite enjeksiyonu) uygulanması için bir yöntemi açıklamaktadır. Sıçanların omurilik kanallarına bel omurları 2-3 seviyesinde bir milyon MSC enjekte edildi. Uygulamadan sonra, sıçanlara enjeksiyondan 0, 6 ve 12 saat sonra ötenazi yapıldı. Enjekte edilen MSC'leri izlemek için optik görüntüleme ve kantitatif gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) kullanıldı. Bu çalışmanın sonuçları, omurilik boşluğu yoluyla uygulanan MSC'lerin daha sonra hem beyinde hem de omurilikte 12 saat sonra tespit edilebileceğini göstermiştir. Omurga içi kavite enjeksiyonu, genel anestezi gerektirmeme avantajına sahiptir ve çok az yan etkisi vardır. Bununla birlikte, MSC'lerin beyne düşük göç hızının dezavantajının üstesinden gelinmelidir.

Giriş

Mezenkimal kök hücreler
Hastalık koşulları altında, MSC'ler, bağışıklık tepkilerini düzenlediği, hasarlı dokuları restore ettiği ve^{toksik maddeleri uzaklaştırdığı bildirilen parakrin eylemler 1} yoluyla hastalığa özgü terapötik maddeler salgılar 2. Bu nedenle, MSC tedavisinin Alzheimer hastalığı ve sarkopeni gibi multifaktöriyel hastalıkların tedavisinde tek hedefli tedaviden daha etkili olduğu düşünülmektedir 3,4,5,6. Ek olarak, farmasötiklerin aksine, MSC'ler vücuttaki enflamatuar sitokinleri veya kemokinleri tanıyarak hasarlı doku bölgesine hareket eden bir hedef arama etkisine sahiptir ^7,8. Ne yazık ki, hücrelerin sadece bir alt kümesi hasarlı bölgeye ulaşır ve göç sırasında MSC'lerin canlılığı azalır ^9,10,11,12. Bu nedenle, MSC'lerin terapötik etkinliğini en üst düzeye çıkarmak için, canlı hücrelerin hedef bölgeye iletilmesi gerekir. Bu nedenle, MSC'leri uygularken, hedef hastalığın doğasına bağlı olarak uygun uygulama yolunu seçmek önemlidir.

Enjeksiyon yolu
Terapötik ajanların hastalara uygulandığı çok sayıda yol vardır. En yaygın yöntemler sistemik dolaşıma intravenöz enjeksiyon, oral uygulama ve deri altı veya kas içi enjeksiyondur. Nörodejeneratif hastalıklarda, terapötik ajanların beyne iletilmesindeki en büyük engel kan-beyin bariyeridir (BBB). BBB, kan damarları ve beyin parankimi arasındaki sıkı bağlantılar vasıtasıyla beyni dış patojenlerden korur^13,14. Bununla birlikte, BBB ayrıca paradoksal olarak terapötik ajanların beyin parankimine girmesini önler. Bu nedenle, BBB'den geçiş, beyin hastalığı tedavilerinin geliştirilmesindeki ana engeldir^15,16. İntraserebral enjeksiyon, bu dezavantajın üstesinden gelmek için hedef maddelerin cerrahi operasyonla doğrudan beyne enjekte edilmesiyle gerçekleştirilir 17,18,19. Ancak özellikle iğnenin işlem sırasında nöronal hücrelere zarar vermesi nedeniyle cerrahi müdahalelerin yan etkileri göz önünde bulundurulmalıdır.

İntraspinal kavite uygulaması
İntratekal uygulama - ilaçların omurilik kanalına veya subaraknoid boşluğa uygulanması - ilaçları beyin omurilik sıvısı (BOS) yoluyla beyne veya nöraksiye iletir ve intraserebral enjeksiyona uygun bir alternatiftir. İntratekal enjeksiyonlar, enjeksiyon bölgesine göre alt bölümlere ayrılabilir: lateral ventrikül, cisterna magna ve omurga boşluğu. Her üç yol da ilaçların veya hücrelerin BOS boyunca beyne ve omuriliğe dağılmasına izin verir. Beyne ilaç iletimi, intraserebroventriküler ve intra-cisterna magna enjeksiyonları durumunda, ajan beyne yakın enjekte edildiğinden daha verimli olabilir. Bununla birlikte, intraspinal kavite enjeksiyonu, intraventriküler rezervuar yerleştirmek için genel anestezi veya ameliyat gerektirmeme, genellikle güvenli²⁰ olma avantajlarına sahiptir ve gerekirse tekrar tekrar yapılabilir.

Bu çalışmanın amacı, MSC'leri hem beyne hem de omuriliğe iletmenin bir yolu olarak intraspinal kavite uygulamasını doğrulamaktı. İlk olarak, intraspinal boşluk bir sıçan modelinde kuruldu. Daha sonra, MSC'ler, omuriliğe ve beyne kök hücre göçünün etkinliğini değerlendirmek için lipofilik bir izleyici olan DiD (DiIC18 (5); 1,1-dioktadesil-3,3,3,3-tetrametilindodikarbosiyanin, 4-klorobenzensülfonat tuzu) ile etiketlendi. Hücre dispersiyonunu değerlendirmek için ex vivo optik görüntüleme yapıldı. Bu basit protokol cerrahi müdahale olmadan gerçekleştirilebilir ve sadece kök hücrelerin verilmesi amacıyla değil, aynı zamanda omuriliğe veya beyne iletilmesi amaçlanan ilaçlar, antikorlar, kontrast maddeler ve diğer maddeler için de kullanılabilir.

Protokol

NOT: Bu çalışma, Samsung Tıp Merkezi'ndeki Samsung Biyomedikal Araştırma Enstitüsü'nün (SBRI) Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanımı Komitesi (Onay numarası: 20170125001, Tarih: 25 Ocak 2017) tarafından onaylanmıştır. Uluslararası Laboratuvar Hayvanları Bakımı Değerlendirme ve Akreditasyon Derneği'nin akredite bir tesisi olan SBRI, Laboratuvar Hayvanları Kaynakları Enstitüsü tarafından belirlenen yönergelere uygun olarak hareket eder.

1. İnsan Wharton'un jöle türevi MSC'lerinin hazırlanması

1. İnsan Wharton'un jöle türevli mezenkimal kök hücrelerinin (WJ-MSC'ler) yetiştirilmesi
   1. Bir şişe insan WJ-MSC'yi 37 ° C'lik bir su banyosunda hızlı bir şekilde çözdürün. WJ-MSC'leri 50 mL'lik konik bir tüpe aktarın ve hücrelerin en az 10 katı (h / h) bir hacimde büyüme ortamı ekleyin. Hücreleri askıya almak için yukarı ve aşağı pipetleyin.
   2. 300 × g'da 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı dikkatlice atın ve hücreleri yeniden askıya alın.
      NOT: Hücre peletini atmamaya dikkat edin.
   3. T175'teki tohum WJ-MSC'ler 5.000-6.000 hücre /^cm2 yoğunlukta şişelenir. WJ-MSC'leri 37 °C CO₂ inkübatörde inkübe edin. WJ-MSC'ler %80-90 birleşmeye ulaşana kadar büyüme ortamını her 72 saatte bir değiştirin.
      NOT: Genel olarak, MSC'lerin %80-90 birleşmeye ulaşması 3-4 gün sürer.
2. İnsan WJ-MSC'lerinin alt yetiştiriciliği
   1. Büyüme ortamını atın ve hücreleri 10 mL fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın. PBS'yi çıkarın ve 5 mL %0.25 tripsin-disodyum etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakın). Hücreleri 37 ° C'de bir CO₂ inkübatöründe WJ-MSC'ler kültür şişesinden ayrılana kadar 3 dakika inkübe edin.
   2. % 0.25 tripsin-EDTA'yı nötralize etmek için% 10 fetal sığır serumu içeren 5 mL büyüme ortamı ekleyin. Hücre karışımını toplayın ve 50 mL'lik konik bir tüpe aktarın. Hücre kültürü şişesini 10 mL büyüme ortamı ile yıkayın ve hücreleri steril bir serolojik pipet kullanarak 50 mL'lik bir tüpte toplayın.
   3. Hücre karışımını 300 × g'da 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın, hücreleri 10 mL büyüme ortamında yeniden süspanse edin ve WJ-MSC'lerin sayısını sayın.
      DİKKAT: Hücre peletini atmamaya dikkat edin.
   4. Deneye bağlı olarak 4.000-6.000 hücre/^cm2 yoğunlukta WJ-MSC'leri tohumlayın.
3. WJ-MSC'lerin DiD boyası ile etiketlenmesi ve WJ-MSC'lerin intraspinal kavite enjeksiyonu için hazırlanması
   NOT: DiD boya etiketleme prosedürü, üreticinin talimatlarına göre gerçekleştirilmiştir.
   1. Yukarıda belirtilen prosedürü kullanarak WJ-MSC'leri %80 birleşmeye ulaştıklarında ayırın. WJ-MSC'leri fenol kırmızısı içermeyen minimum esansiyel ortamda (MEM) 1 ×^{10 6} / mL yoğunlukta α serum olmadan askıya alın.
   2. 1 mL hücre süspansiyonu başına 5 μL DiD etiketleme çözeltisi ekleyin; Pipetleme ile nazikçe karıştırın.
   3. 37 ° C'de 15 dakika inkübe edin; Hücre süspansiyonunu 300 × g'da 5 dakika santrifüjleyin.
   4. Süpernatanı çıkarın ve WJ-MSC'leri fenol kırmızısı içermeyen MEM α 1 × 10⁶ / 0.2 mL yoğunlukta yeniden süspanse edin.

2. WJ-MSC'lerin intraspinal boşluk enjeksiyonu

1. İntraspinal kavite enjeksiyonu için hazırlık
   1. 6 haftalık Sprague-Dawley sıçanlarını% 5 izofluran ile uyuşturun; Ardından, cerrahi prosedür boyunca% 2 izofluran ile anesteziyi koruyun.
      NOT: Deneye başlamadan önce anestezi koşullarını optimize edin.
   2. Küçük hayvanlar için elektrikli tıraş makinesi kullanarak cerrahi bölgeyi tıraş edin.
      NOT: Elektrikli tıraş makinesi, manuel tıraş makinesi ve tıraş jeli ile değiştirilebilir.
   3. Povidon-iyot kullanarak cerrahi alanı dezenfekte edin. Cerrahi bıçakla ciltte 3 cm'lik bir kesi oluşturun. Kalan deri ve kas dokusunu cerrahi bir bıçak ve makas kullanarak rezeke edin. Lomber 2-3'teki (L2-3) spinöz süreçleri ortaya çıkarın.
2. DiD işaretli WJ-MSC'lerin intraspinal boşluk yoluyla enjeksiyonu
   1. Fareyi yüzüstü pozisyona getirin. Yeterli miktarda kağıt mendil veya uygun pozisyonun korunmasına yardımcı olabilecek diğer malzemeleri kullanarak, bitişik dikenli süreçler arasındaki mesafeyi genişletmek için sıçanın omurgasını uygun şekilde esnetin.
   2. 1 mL'lik bir şırıngayı 0.2 mL DiD etiketli WJ-MSC'lerle doldurun. L2 ve L3'ün dikenli süreçleri arasına dikey olarak 23 G'lik bir şırınga-iğne kombinasyonu yerleştirin ve iğneyi omur gövdesine temas edene kadar sokun.
   3. İğne omur gövdesine temas ettiğinde, iğnenin ucunu omurilik kanalına yerleştirerek yaklaşık 0,5 cm geri çekin. Şırıngayı eğin ve iğnenin ucunu rostral yöne bakacak şekilde yerleştirin. WJ-MSC'leri 1 dakikalık bir süre boyunca omurga boşluğuna enjekte edin.
      NOT: Enjeksiyon hızı önceden optimize edilmelidir.
   4. Enjeksiyondan sonra, şırıngayı omurilik kanalından tamamen çıkarın. İnsizyonu dikin ve ardından povidon-iyot kullanarak cerrahi bölgeyi dezenfekte edin.
3. İşlem sonrası tedavi
   1. Herhangi bir hareketi önlemek için fareyi stabilize edin ve kısıtlayın, hala anestezi altındayken 15 dakika boyunca 45 ° 'lik bir açıyla baş aşağı yerleştirin. 15 dakika sonra anesteziyi bırakın ve farenin uyanmasını bekleyin.

3. İntraspinal kavite enjeksiyonunun değerlendirilmesi

1. Sıçanların ötenazisi ve enjeksiyondan 0, 6 ve 12 saat sonra beyin ve omuriliğin izolasyonu
   1. Deney hayvanlarını% 5 izofluran ile uyuşturun; PBS perfüzyonu sırasında% 2 izofluran ile anesteziyi koruyun.
   2. Cerrahi makas kullanarak diyaframın altında bir kesi yapın. Kesiği forseps ile açın ve kalbi ortaya çıkarmak için göğüs kafesini rostral olarak kesin.
   3. Sağ kulakçıkta küçük bir delik açın ve sol kulakçık içine bir kelebek iğne yerleştirin. Karaciğer kandan temizlenene kadar 100 mL soğuk PBS'yi 4-5 dakika boyunca sol ventriküle perfüze edin.
   4. Perfüzyondan sonra, uzunlamasına düzlem boyunca cerrahi bir bıçak kullanarak baştan kuyruğa kadar arka tarafta uzun bir kesi yapın. Cerrahi makas, forseps ve kemik kesici kullanarak kalan beyni ve tüm omurgayı izole edin. Kalan kaburgaları, bağlı kemikleri ve eti çıkarın.
2. Ex vivo DiD floresan optik görüntüleme
   1. İzole edilen dokuları optik görüntüleme cihazının haznesine yerleştirin.
   2. Parametreleri aşağıdaki gibi ayarlayın: emisyon, 700 nm; uyarma, 605 nm; ve maruz kalma süresi, 2 saniye, steradyan başına santimetre kare başına saniyede foton olarak (p/s/^cm2/sr). Optik görüntüleri yakalayın.
      NOT: Tüm görüntüler aynı aydınlatma ayarlarıyla (lamba voltajı, filtreler, f/stop, görüş alanı ve gruplama) elde edilmelidir.
   3. Çizim aracını kullanarak omurilik için eşdeğer boyutta üç dikdörtgen ilgi bölgesi (ROI) ve beyin için bir daire ROI çizin. ROI'lerin floresan yoğunluklarını ölçün.
3. Omurilik ve beyin dokusundan genomik DNA'nın (gDNA) çıkarılması
   1. Cerrahi forseps, makas ve rongeur kullanarak kafatasını ve omurgayı dikkatlice çıkarın.
   2. Beyni ve omuriliği kafatasından ve omurgadan alın. Omuriliği üç parçaya bölün (servikal, torasik ve lomber).
      NOT: Hasat edilen dokular hemen analiz edilmezlerse -80 °C'de saklanmalıdır.
   3. Dokuları önceden soğutulmuş bir havan, havan tokmağı ve sıvı nitrojen kullanarak öğütün. Üreticinin talimatlarını izleyerek ticari ürünler kullanarak gDNA'yı çıkarın.
4. Kantitatif gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR)
   1. Bir spektrofotometre kullanarak her numunedeki gDNA miktarını ölçün.
   2. Örnek başına 10 ng gDNA ve insan Arthrobacter luteus (ALU) primerleri^12,21 kullanarak qPCR gerçekleştirin.
   3. ΔΔC T yöntemini²² kullanarak numunelerdeki WJ-MSC'lerin tam sayısını hesaplayın.

Sonuçlar

Bu çalışmada MSC'lerin intraspinal kavite enjeksiyonunun etkinliğini değerlendirmek için DiD etiketli MSC'ler kullanıldı. MSC'leri omurga boşluğuna enjekte etmeden önce, etiketleme etkinliği in vitro olarak optik görüntüleme ve floresan mikroskobu kullanılarak değerlendirildi (Şekil 1). Protokol bölüm 3.1'de açıklanan prosedür kullanılarak MSC'lerin DiD etiketleme reaktifi ile boyanmasından sonra, DiD etiketli MSC'lerin tohumlandığ...

Tartışmalar

MSC'lerle tedavi için en uygun uygulama yolu, hedef hastalığa, hastanın durumuna ve verilecek ilacın türüne bağlı olarak seçilmelidir. MSC tedavisi de dahil olmak üzere hücre tedavilerinde, hücreler BBB^19'dan geçemeyeceği için kök hücrelerin beyne veya BOS yoluyla intratekal olarak doğrudan enjeksiyonu düşünülmelidir. İntraspinal kavite enjeksiyonu nispeten non-invazivdir ve intraserebroventriküler enjeksiyonların aksine beyinde nöronal ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin-EDTA	Gibco-invitrogen	25200114	Cell culture
Fetal bovine serum	biowest	S1520	Culture medium supplement
gentamicin	Gibco-invitrogen	15710-072	Culture medium supplement
Gentra Puregene Tissue Kit	QIAGEN	158689	gDNA isolation
MEM, no glutamine, no phenol red	Gibco	51200038	WJ-MSC fomulation for injection
Miminum Essential Medium alpha	Gibco-invitrogen	12571063	WJ-MSC culture medium
Power SYBR Green PCR Master Mix	Applied Biosystems	4368577	quantitative real time PCR reagent
QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System	Thermo fisher	4485694	quantitative real time PCR
trypan blue	Gibco	15250061	Injection
Vybrant DiD Cell-Labeling Solution	invitrogen	V22887	Stem cell labeling solution
Xenogen IVIS Spectrum system	Perkin Elmer	124262	Optical imaging device