小鼠膝盖外展肌肉功能的体内测量

摘要

量化膝盖扩展或最大强度是了解功能适应老化，疾病，受伤和康复的必要条件。我们提出了一种新方法，可以反复测量体内膝盖延伸等轴测峰值破伤风扭矩。

摘要

骨骼肌可塑性，以回应无数的条件和刺激调解并发功能适应，无论是消极的还是积极的。在临床和研究实验室中，人类纵向广泛测量最大肌肉力量，其中膝盖外显肌肉是报告最多的功能结果。膝关节拉除肌复合物的病理学在衰老、骨科损伤、疾病和不使用方面有充分的记载:膝关节拉长强度与功能能力和受伤风险密切相关，突出了可靠测量膝关节外力的重要性。临床前啮齿动物研究中膝关节增生强度的可重复、活体评估为探索骨关节炎或膝伤的研究提供了宝贵的功能终点。我们报告一个体内和非侵入性协议，以反复测量小鼠膝盖外显子的等轴测峰值破伤风扭矩。我们使用这种新方法在多个小鼠中反复评估，以测量膝盖扩展器强度，并证明其一致性，结果相似。

引言

骨骼肌是一种适应性很强的组织，对质量和结构进行补偿性改变，以应对无数的刺激，如运动、营养、损伤、疾病、衰老和不使用。许多研究研究骨骼肌适应在人类使用的方法来测量骨骼肌肉的大小和对功能的影响，因为黄金标准的强度评估很容易重复在人类受试者。

具体来说，在临床研究中，对膝关节扩展器和屈肌强度的评价最高。在人类对衰老、运动、骨科损伤、膝骨关节炎、慢性病和1、2、3、4、5、6、7的不使用的研究中，对膝关节增强剂强度的改变被广泛报道。然而，在机械啮齿动物研究中反复和非侵入性地分析膝盖外周肌肉（四头肌）力量的方法相对有限。一种在体内确定大鼠四头肌收缩的方法，以前曾开发过^8:然而，需要大量建造非商业性设备。鉴于为研究膝盖损伤/骨关节炎^{9、10、11、12、13}后肌肉骨骼结果而开发的啮齿动物模型的广度^，有必要对四头肌的强度进行非侵入性评估。

此外，研究支撑骨骼肌适应的分子机制的啮齿动物研究通常利用小鼠模型，由于基因改造的简单性，许多药理干预研究也使用小鼠模型，因为与大鼠相比，小鼠的药物基于重量的药物剂量较低，因此其财务费用有所降低。我们报告了一种非侵入性方法，使用商用设备对同一鼠标中的活体膝部扩展功能进行反复测量，并稍作修改，促进不同实验室之间的可重复性，并提供更直接的人类力量结果比较。

研究方案

所有实验程序都得到了肯塔基大学机构动物护理和使用委员会的批准。

1. 设备设置

1. 确认机器是按制造商规格连接的。
2. 如果尚未到位，将带膝部伸展装置的 300D-305C-FP 电机连接到 809C 动物平台。
3. 打开水泵至 37 °C，开始加热平台。
4. 如果计算机尚未打开，则打开计算机，然后打开大功率双相刺激器和 2 通道双模杆系统。
5. 将异黄素倒入蒸发器中，以达到最大填充线。

2. 软件设置

1. 打开软件（ 材料表中提供的详细信息）。
2. 要与实时数据监视器一起使用即时刺激功能来优化探头放置（步骤 4），请选择 准备实验 ，然后选择 配置即时刺激 （图 1）。将 脉冲频率 （Hz） 设置为 125， 脉冲宽度 （ms） 设置为 0.2， 脉冲数量 设置为 1， 将列车频率 （Hz） 设置为 0.5，将 运行时间 （s）设置为 120。
3. 选择 文件 并打开 实时数据监视器。
4. 要执行抽搐（第 5 步）和扭矩频率（第 6 步）实验，请选择以前编程的研究，其中包括适当的抽搐和膝关节延伸扭矩频率实验（详见下一步 5 和第 6 步）。
   1. 选择合适的实验鼠标或 添加新动物 ，并输入相应的鼠标信息，以存储扭矩数据。
   2. 选择 下一个实验 或 以前的实验 ，从抽搐协议过渡到扭矩频率序列。

3. 鼠标设置

1. 将单个鼠标放入麻醉室。
2. 释放氧气罐阀，将氧气流量设定为 1 L/min，含 2.5% 异黄素。
3. 确保鼠标保持在腔室中，盖子牢固地关闭，直到完全失去知觉。确认完全失去知觉缺乏脚反射与脚趾捏。
4. 将麻醉小鼠置于超音速位置，头部在加热平台的鼻锥中，氧气流动速率为 1 L/min，异黄素为 2.5%。
5. 使用电动剪子从右后肢剃头发。用酒精擦拭和小真空从剃须区取下头发。清洁去除的头发远离后肢和平台。
6. 牢牢地夹住上后肢，后肢夹在膝盖上（图2）。
   注意:确保膝盖的运动范围不受阻碍。
7. 将下肢放入膝盖延长装置中，前头骨轻轻触摸可调节塑料片（ 通道阅读力 应读取 0 至 -1.0 mN*m）。根据小鼠下肢的大小，手术胶带可能包裹在可调节塑料片的底部，使腿部能够安全地休息。
   注:定制塑料片的详细图像和尺寸显示在 补充图1中。
8. 调整平台上的旋钮，确保膝盖在 60°下弯曲。
9. 轻轻将一块胶带放在鼠标躯干上，以防止以最大膝盖伸展进行补偿性运动。

4. 电极放置

1. 将电极皮下皮2-4毫米近在膝盖正上方的四头肌/膝盖扩展肌肉（图2）。电极应相距约1-2毫米。
2. 要确定电极的最佳位置，使用实时数据监视器的即时刺激功能。将安培/电流设置为 50 mA，用于重复抽搐以确认膝盖延长（膝盖扩张器将产生负抽搐曲线）。在即时刺激期间调整探头，以实现实时数据监视器窗口中测量的最大膝盖延长抽搐扭矩。
   注: 图3 显示具有代表性的 即时刺激 输出，确认膝盖延长。 补充视频 1 和 补充视频 2 显示实时和慢动作膝盖扩张抽搐没有电机臂到位，允许对膝盖延伸的视觉确认。
3. 在反复抽搐与 即时刺激，味觉膝盖屈肌与食指确认没有激活拮抗性肌肉。为了最大限度地刺激膝盖外显子，根据小鼠的身体组成和股骨神经和膝盖扩展肌肉运动点的确切位置的细微解剖差异，可能需要重新定位探针。
   注:肌肉运动点是神经运动分支进入肌肉腹部的位置，是电导率抵抗力最低的点，随后对电刺激的反应最高^{。14，15。}在使用电刺激的临床应用中，通过用笔电极扫描来识别这一点，以找到肌肉抽搐发生位置，注射电流最低^{为 14，15。}肌肉运动点的识别对于促进最佳神经肌肉电刺激^至关重要。在人体临床试验中，在肌肉^的半部中发现了四头肌的肌肉运动点。为了在小鼠中实现最佳的膝部扩展刺激，该技术使用电极放置与即时刺激进行重新概括，以最接近的肌肉运动点位置，通常发现在膝盖扩展器的半部分。电极放置（从相对浅到深）存在一些变异性，从而产生最大扭矩，即时刺激功能可促进最佳电极放置。

5. 确定最佳电流

1. 确定最佳探头位置后，执行一系列渐进式抽搐，以确定用于扭矩频率实验的最佳放大器/电流，目标是确定最低电流，以实现最大抽搐扭矩输出。从 50 mA 的电流开始，选择 运行实验 以产生单个抽搐。选择 分析结果 以显示扭矩输出。记录 在最大力 下显示的抽搐扭矩，并减去基线。
   注:选择反转 力通道 的选项，将测量值从负扭矩转换为正转。
2. 将电流增加到 60-70 mA 并重复抽搐实验。记录 在最大力 下显示的抽搐扭矩，并减去基线。
3. 继续以这种方式进行一系列抽搐实验（每次进展增加约10-20mA），直到抽搐扭矩不再增加（或开始减少）。抽搐系列示例显示在表 1中。
4. 记录实现最高抽搐扭矩的最低电流。此电流将在即将到来的力频实验中使用并保持恒定。 图 4 显示一个具有代表性的峰值抽搐。

6. 扭矩频率实验，以确定峰值等轴破伤风扭矩

1. 在软件中（参见 材料表），选择预先编程的扭矩频率实验，以确保膝盖延伸，确保设置如下。刺激持续时间: 0.35 s， 频率序列: 10 Hz， 40 Hz， 120 Hz， 150 Hz， 180 Hz， 200 Hz， 脉冲/收缩之间的休息时间: 120 s
   注:采样速率为 10，000 Hz（默认设置）。
2. 运行实验， 分析结果，并手动记录在最大力下显示的扭矩，并减去基线（确保力通道倒置，因为膝盖扩展收缩将产生负扭矩）在每个频率。请注意，最高最大力值为峰值等轴测量破伤风扭矩。扭矩频率数据示例显示在 表 2 中， 图 5 显示了在 120 Hz 下实现的峰值等轴破伤风扭矩输出的代表性破伤风曲线。

7. 终止实验

1. 完成扭矩频率实验后，执行后续抽搐，并在同一电流下与初始峰值抽搐进行比较，以评估损伤/疲劳。
   注:在一些损伤和疾病模型中，骨骼肌的脂肪性有望增加，并且不构成实验设置或小鼠的问题。
2. 完成所有扭矩测量后，轻轻取下电极探头，解开膝盖。
3. 关闭异黄素，将鼠标从鼻锥中取出。
4. 将鼠标放回放置在加热垫顶部的适当笼子中。当鼠标恢复并恢复意识时，进行监视。
   注意:鼠标应有意识，并在 2-3 分钟内移动。

8. 数据分析

1. 从分析软件中提取实验后的数据（见 材料表）。
   1. 打开分析软件。
   2. 从软件中 选择获取数据 。
   3. 选择进行实验的日期和适当的鼠标代码。
   4. 选择兴趣频率（所有抽搐实验和扭矩频率实验的每个频率将列出）。
   5. 选择 肌肉分析。
   6. 确认 已检查使用基线校正 。
      注:基线扭矩由软件计算为从绝对最大扭矩值中取样和减去的前 100 点的平均值。
   7. 记录最大 值下列出的扭矩值。
      注:此处提供的数据未经过滤:但是，如果需要，可以在软件中选择筛选器。
2. 或者，如上文第 6.2 步所述，通过分析结果窗口，手动记录在 Max Force下实时显示的扭矩输出。"每个扭矩频率点/收缩"。
   1. 确认基线被减去，力通道倒置。
   2. 将数据输入电子表格，用于体重正常化计算（扭矩/体重（克）和感兴趣的图形和统计分析。统计软件用于绘制扭矩频率曲线和计算曲线下的面积。
      注:扭矩数据以 mN .m（毫新米）表示。
3. 要生成破伤风曲线，从分析软件中导出每个频率的完整数据。
   1. 重复步骤 8.1.1-8.1.4 以上。
   2. 选择 出口数据。
   3. 选择 原始过滤数据 ，并保存在选择的位置。MATLAB 可用于从导出的文本文件生成破伤风曲线和/或进行进一步分析。
      注:应要求，可使用 MATLAB 代码从文本文件生成破伤风曲线。

9. 双模杆系统校准

1. 在初始使用之前校准系统以确保准确可靠的数据，并定期使用数据收集软件和已知权重重复校准。
   1. 打开数据收集软件。
   2. 单击 "设置"选项卡 并选择 "通道设置"。
   3. 选择在我的仪器下列出的305C-FP。
   4. 单击 校准选择 以打开 校准编辑器 窗口。
   5. 要校准长度，输入一系列测试电压，包括负电压和正电压（例如 -3、-2、-1、0、1、2、3 V）。
      1. 单击 第 一行设置。
      2. 单击 "阅读"。
      3. 测量杠杆臂的确切长度毫米，并输入到相应的框中。
      4. 重复下一个电压。
      5. 记录所有电压后，单击 计算卡尔因子 （记录在毫米/伏特）。
   6. 要校准力，利用一组已知重量在线性进展中增加。
      1. 调整电机，使其位于长凳或桌子的边缘，将操纵臂平行于台面，并悬在边缘，使重量悬空。
      2. 使用橡皮筋将第一重量从操纵杆臂上悬挂。在 应用力下，输入已知重量的克占橡皮筋的质量。
      3. 选择 阅读。
      4. 重复至少 3 个已知重量。
      5. 选择 计算卡尔因子。
      6. 要验证计算，图标定数据和曲线适合通过选择 情节卡尔。
   7. 要校准力，请输入校准电压（最高 10 伏）
      1. 单击设置直接在校准电压旁边。
      2. 重复每个电压线。
      3. 用手指轻轻地向杠杆臂施加压力，直到 力出 停止改变，电机臂开始移动。
      4. 保持此位置。选择 阅读。
      5. 重复每个电压线。
      6. 选择 计算卡尔因子。

结果

扭矩频率曲线利用较低的频率产生多个相对较低的扭矩的分离等轴抽搐，并通过越来越高的频率前进，导致抽搐的融合，从而获得峰值破伤风扭矩的等轴破伤风收缩。膝盖延长峰值破伤风扭矩的呈呈协议力频曲线启动在 10 Hz，从而引起 3 个孤立的抽搐。抽搐的部分融合发生在40赫兹，峰值破伤风扭矩达到120-180赫兹（图5）之间。

图6说明了雌性C57BL/6小鼠具有代表性的膝部延伸扭矩频率曲线。在基线上测试了三只独立的小鼠，2周后在每只小鼠身上重复实验，以进行比较，以评估可重复性。扭矩频率曲线显示与原始扭矩值 （图 6A），以及原始扭矩值正常化到鼠标体重 （图 6B）.反复观察表明，所有3只小鼠在实验之间有2周的休息时间，结果相当。除了原始扭矩外，还应考虑体重正常化扭矩数据，因为重量的轻微波动可能会影响功能输出，而不单独考虑原始扭矩。此外，体重规范化扭矩数据有助于对大小不一的小鼠进行比较。扭矩也可以正常化到肌肉湿重或肌纤维横截面区域，因为我们以前已经显示^16。

图7A 使用来自完整扭矩频率实验的体重规范化等轴测扭矩数据（10 Hz， 40 Hz， 120 Hz， 150 Hz， 180 Hz， 200 Hz） 为 4 单独的 C57BL/6 小鼠， 突出类似的总扭矩输出和变异系数之间 5.6% 至 8.8% 与重复实验在同一小鼠体内.数据最简单地报告为峰值破伤风扭矩（图7B），这是从120-200赫兹重复破伤风等轴收缩的最大扭矩值。6-8个月大的雌性C57BL/6小鼠（图7B）的破伤风扭矩输出峰值可与同一小鼠的纵向评估相媲美，变异系数在4.8%至8.7%。峰值破伤风扭矩与人类研究中的金标准强度评估最为可比:最大等轴测扭矩。

此外，膝关节扩展器峰值破伤风扭矩协议是检测多个小鼠模型强度差异的有用工具。图8显示了在非受伤、健康的6个月大C57BL/6雌性小鼠（黑线）和超生理肥大的转基因小鼠模型（肌他汀/GDF8）中被击倒（蓝线）中膝盖扩张强度之间的鲜明对比。我们还显示，前十字韧带（ACL-T）（红线）手术后7天，C57BL/6小鼠的破伤风曲线峰值，表明受伤后峰值扭矩下降近50%，远远超出通过反复测试未受伤小鼠观察到的变异系数。与人类数据^17，18，强度明显减弱与ACL-T。所有小鼠均为雌性，年龄相近（6-8个月）。

抽搐实验	安培/电流 （mA）	扭矩 （mN=m）
1	50	1.279
2	70	1.341
3	90	1.36
4	110	1.362
5	*130	1.449
6	150	1.436
7	140	1.333

表1:抽搐系列示例。 * 表示最佳安培/电流。

频率 （Hz）	扭矩（mN=m）
10	1.385
40	1.869
120	*18.765
150	18.375
180	17.97
200	17.548

表2:扭矩频率曲线数据示例。 * 表示峰值破伤风扭矩。

图1:数据收集软件设置。 带实时数据监视器的数据收集软件设置说明。 请单击此处查看此图的较大版本。

图2:鼠标设置和电极放置。（A-B ）通过加热平台上的鼻锥接受麻醉的鼠标的苏平位置。上后肢被牢牢地夹住，后肢紧贴膝盖，使膝盖关节不受限制地移动。运动臂进行调整，使膝盖弯曲约 60°。股骨神经运动点受针电极刺激，激活膝盖扩展器收缩。鼠标设置显示从侧视图（A） 和头顶视图（B）。请单击此处查看此图的较大版本。

图3:确定最佳电极位置，实现等轴膝伸展。 使用即时刺激功能刺激的重复负抽搐的表示，并在实时数据监视器中查看。红色箭头表示前三个膝盖延长抽搐。 请单击此处查看此图的较大版本。

图4:代表抽搐，以确定最佳安培。 引起最高抽搐等轴测扭矩的最低放大器必须通过重复抽搐实验和逐步增加的放大器来确定力频实验。 请单击此处查看此图的较大版本。

图5:同一只小鼠的扭矩频率实验中具有代表性的破伤风扭矩曲线。 （A） 10 Hz 产生的亚轴测破伤风扭矩。 （B） 亚轴测定破伤风扭矩在 40 Hz .（C） 峰值等轴破伤风扭矩输出在 120 Hz.（D） 等轴破伤风扭矩在 150 Hz .（E） 等轴破伤风扭矩在 180 Hz .（F） 等轴破伤风扭矩在 200 Hz. 请单击此处查看此图的较大版本。

图6:代表扭矩频率曲线数据。 扭矩频率曲线在2个不同的时间点（第1周和第3周）在3个单独的小鼠，呈现为原始峰值扭矩（A）和原始峰值扭矩正常化为体重（B）。请单击此处查看此图的较大版本。

图7:曲线下代表区（AUC）和峰值破伤风扭矩数据。 （A） AUC为4只独立的小鼠，呈现为生扭矩正常化为体重。（B） 同一4只小鼠的峰值破伤风扭矩，呈现为生峰破伤风扭矩正常化为体重。 请单击此处查看此图的较大版本。

图8:多个鼠标模型中膝盖外周器的峰值破伤风扭矩。 代表性峰值扭矩破伤风曲线为明显肥大转基因小鼠模型 （GDF8 KO），未受伤的健康 C57BL/6 小鼠 （鼠标 2）， 和 C57BL/6 小鼠 7 天后前十字韧带转动 （ACL-T）.。 请单击此处查看此图的较大版本。

补充 图1:定制塑料的尺寸。 红色嵌中显示深度维度。请点击这里下载此文件。

补充视频1:实时膝盖伸展抽搐没有运动臂。 请点击这里下载此视频。

补充视频2:慢动作膝盖伸展抽搐没有运动臂。 请点击这里下载此视频。

讨论

测量和分析啮齿动物模型中的肌肉功能，对于通过运动、损伤、疾病和治疗观察到的组织学和分子骨骼肌肉适应进行转化和有意义的推论势在必行。我们演示了一种方法，使用商用设备可靠且反复地评估小鼠的膝盖扩展或最大强度，而可调节塑料片在前头骨处保持下肢是唯一可以复制的定制制造部分。

常见的功能评估工具已被广泛用于反复评估同一鼠标内的物理性能，如跑步机运行到意志疲劳、旋转性能测试、倒立粘性测试和抓力测试。然而，这些评估虽然信息丰富，但涉及心肺和行为成分，这会混淆与这些物理性能测量相关的神经肌肉功能的询问。此外，在许多不同程度的功能评估中，耐力、协调和平衡的要素也存在，这限制了相对于肌肉力量的清晰解释。啮齿动物肌肉的力生成能力可以在体外、原位或体内测量。每种方法都有相对的优势和局限性。具体来说，通过体外评估，肌肉被完全隔离，从动物体内去除，这样不会受到灌注或内化^的影响。这产生了一个控制良好的环境，以确定收缩能力，但限制肌肉的大小正在研究通过依赖被动扩散氧气和营养物质在测试期间。现场测试维持肌肉的内侧和血液供应，但仅限于单一的末期评估，如体外测试^20。最后，在体内测试是侵入性最小的肌肉留在其原生环境中，皮下电极插入运动神经附近，以电刺激肌肉。体内方法的一个优势是跨时间^21、22、23进行纵向测试的潜力。

在峰值肌肉收缩的体内评估中，最佳地测量了最大强度，因为小鼠的正常解剖和生理学保持不变，该方法可以在干预前后或整个寿命内在同一只小鼠上重复使用。具体来说，在小鼠膝盖扩张力的体内测量中，是与人类研究具有最大转化意义的骨髓强度评估，因为最大膝关节延伸扭矩通常被测量并被认为是人类与各种功能和健康结果相关的黄金标准强度测试 24、25、26、27.此外，随着年龄的增长，以及无数的伤病^{1，2，4，5，6}观察到膝盖外周病理学，但评估这些情况对小鼠膝盖外力纵向的影响并非易事。

虽然此方法具有以纵向方式确定膝部扩展器峰值扭矩的实用性，但应考虑协议的某些限制。扭矩频率协议中省略了 40 Hz 至 120 Hz 之间的较低频率，这可能会限制检测带损伤或疾病的扭矩频率曲线中左右向移动的能力。然而，使用这种扭矩频率协议，我们已经能够检测到在ACL损伤模型和C56BL/6野生类型小鼠和超生理肌肉质量的转基因小鼠模型之间的破伤风扭矩峰值的改变（图8）。我们注意到，它可能是有益的，以确保电极与帮助手或类似的设备，因为肌肉收缩可能会稍微移动电极。我们没有注意到任何明显的电极位移与渐进收缩:然而，不能排除电极轻微运动的可能性，这可能会影响肌肉刺激。此外，肌肉内肌电图（EMG）没有与刺激方案同时进行:然而，如果需要并适合感兴趣的实验模式，纳入EMG措施可能是可行的。

骨科损伤和疾病的穆林模型对膝关节增大强度的评估将促进临床前研究，与临床力量测量有有意义的转化相关性。我们的协议允许精确和反复评估在小鼠的最大膝盖增强剂强度与商业可用的设备可供任何实验室。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1300A: 3-in-1 Whole Animal System- Mouse	Aurora Scientific Incorporated	300D-305C-FP: dual-mode motor with custom knee extension apparatus, 605A: Dynamic Muscle Data Acquisition and Analysis System, 701C: Electrical Stimulator, 809C: in-situ Mouse Apparatus
6100 Dynamic Muscle Control LabBook software	Aurora Scientific Incorporated	DMC v6.000
611A Dynamic Muscle Analysis	Aurora Scientific Incorporated	DMA v5.501
BravMini hair clippers	Wahl Clipper Corporation	ASIN: B00IN24ILE
Eye Lube	Optixcare	Item Number: 142422
Isoflurane	Covetrus	NDC: 11695-6777-2
V-1 Tabletop Laboratory Animal Anesthesia System	VetEquip Inhalation Anesthesia Systems	Item Number: 901806
Prism 8	GraphPad Software, LLC	Version 8.3.0 (328)