In vivo מדידה של שריר המתיר הברך תפקוד שריר בעכברים

Camille R. Brightwell; Ted G. Graber; Benjamin D. Brightwell; Matthew Borkowski; Brian Noehren; Christopher S. Fry

doi:10.3791/62211

Summary

כימות כוח מקסימלי של הרחבת הברך הוא הכרחי כדי להבין התאמות תפקודיות להזדקנות, מחלות, פציעה ושיקום. אנו מציגים שיטה חדשנית למדוד שוב ושוב מומנט איזומטרי שיא איזומטרי של הרחבת הברך vivo.

Abstract

פלסטיות שריר השלד בתגובה לאינספור תנאים וגירויים מתווכת הסתגלות תפקודית בו זמנית, הן שלילית והן חיובית. במרפאה ובמעבדת המחקר, כוח שרירים מקסימלי נמדד באופן נרחב לאורך בבני אדם, עם שרירים מתרחב הברך התוצאה התפקודית המדווחת ביותר. פתולוגיה של קומפלקס שרירים מרומם הברך מתועדת היטב בהזדקנות, פגיעה אורתופדית, מחלות, חוסר שימוש; עוצמת המרחיב בברך קשורה קשר הדוק ליכולת תפקודית ולסיכון לפציעה, ומדגיש את החשיבות של מדידה אמינה של כוח מתן לחץ הברך. ניתן לחזור על עצמו, בהערכת vivo של כוח מתרומם הברך במחקרים מכרסמים פרה קליניים מציע נקודות קצה פונקציונליות יקרות ערך למחקרים לחקור דלקת מפרקים ניוונית או פציעה בברך. אנו מדווחים על פרוטוקול in vivo ולא פולשני כדי למדוד שוב ושוב מומנט טטאני שיא איזומטרי של מקטיני הברך בעכברים לאורך זמן. אנו מפגינים עקביות באמצעות שיטה חדשנית זו כדי למדוד את כוח המגבר הברך עם הערכה חוזרת ונשנית בעכברים מרובים המפיקים תוצאות דומות.

Introduction

שריר השלד הוא רקמה מותאמת מאוד עם שינויים מפצים למסה ומבנה בתגובה לאינספור גירויים, כגון פעילות גופנית, תזונה, פציעה, מחלה, הזדקנות, חוסר שימוש. מחקרים רבים החוקרים הסתגלות שרירי השלד בבני אדם משתמשים בשיטות למדידת גודל שריר השלד וההשפעה על התפקוד, שכן הערכות כוח סטנדרטיות זהב ניתנות לחזרה בקלות בנושאים אנושיים.

באופן ספציפי, מגבר הברך וכוח flexor מוערכים ביותר במחקר קליני. שינויים בכוח הרחבת הברך דווחו בהרחבה במחקרים בבני אדם על הזדקנות, פעילות גופנית, פגיעה אורתופדית, דלקת מפרקים ניוונית בברך, מחלה כרונית, ושימוש¹^,^2,^3,^4,⁵^,⁶^,⁷. עם זאת, שיטות לנתח שוב ושוב ולא פולשני שריר מרומם הברך (שרירים מרובעים) כוח במחקרים מכרסמים מכניים היו מוגבלים יחסית. שיטה לקבוע ב vivo quadriceps התכווצות שריר בחולדות פותחה בעבר⁸; עם זאת, נדרשת בנייה נרחבת של ציוד שאינו זמין מסחרית. בהתחשב ברוחב של מודלים מכרסמים שפותחו כדי לחקור את התוצאות שרירים ושלד בעקבות פגיעה בברך/דלקת מפרקים ניוונית⁹^,¹⁰^,¹¹^,¹²^,¹³ קיים צורך בהערכה לא פולשנית של כוח שריר הארבע ראשי.

יתר על כן, מחקרי מכרסמים החוקרים מנגנונים מולקולריים העומדים בבסיס הסתגלות שרירי השלד משתמשים לעתים קרובות במודלים של עכברים בשל הפשטות של שינוי גנטי, כמו גם מחקרי התערבות פרמקולוגיים רבים בגלל הירידה בהוצאה הכספית הקשורה למינון מבוסס משקל נמוך יותר של תרופה בעכברים בהשוואה לחולדות. אנו מדווחים על שיטה לא פולשנית למדוד שוב ושוב את תפקוד מרחב הברך של vivo באותו עכבר לאורך זמן באמצעות ציוד זמין מסחרית עם שינוי קל, להקל על רבייה בין מעבדות שונות, ומספק השוואה ישירה יותר לתוצאות כוח האדם.

Protocol

כל ההליכים הניסיוניים אושרו על ידי אוניברסיטת קנטאקי מוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש בוועדה.

1. התקנת ציוד

ודא שהמכונות מחוברות לפי מפרטי היצרן.
אם עדיין לא במקום, חבר את מנוע 300D-305C-FP עם מנגנון הארכת הברך לפלטפורמת בעלי החיים 809C.
הפעל את משאבת המים ל 37 °C (50 °F) כדי להתחיל לחמם את הרציף.
אם המחשב עדיין לא מופעל, הפעל את המחשב ולאחריו ממריץ דו-פאזי בעל הספק גבוה ומערכת מנוף דו-פאזית בעלת עוצמה גבוהה ומערכת מנוף דו-מצבית דו-ערוצית של 2 ערוצים.
יוצקים איזופלוראן לתוך מאדה לקו מילוי מקסימלי.

2. הגדרת תוכנה

פתח את התוכנה (פרטים שסופקו בטבלת החומרים).
כדי להשתמש בתכונה 'גירוי מיידי' בשילוב עם Live Data Monitor כדי למטב את מיקום הבדיקה (שלב 4), בחר 'הכן ניסוי' ואחריו 'קביעת תצורה של סטיים מידיים' (איור 1). הגדר את תדר הדופק (Hz) כ- 125, רוחב דופק (ms) כ- 0.2, מספר הפולסים כ- 1, תדירות הרכבת (הרץ) כ- 0.5 וזמן ריצה (ים) כ- 120.
בחר קובץ ופתח את Live Data Monitor.
לביצוע ניסויים של עוויתות (שלב 5) ותדר מומנט (שלב 6), בחר מחקר מתוכנת בעבר הכולל ניסויים מתאימים בתדר המומנט של עווית והרחבת הברך (המפורטים להלן בשלב 5 ודרג 6).
1. בחר את העכבר הניסיוני המתאים או הוסף חיה חדשה והזן מידע עכבר מתאים לאחסון עם נתוני מומנט.
2. בחר את הניסוי הבא או את הניסוי הקודם כדי לעבור מפרוטוקול עווית לרצף תדירות מומנט.

3. הגדרת עכבר

הנח עכבר בודד בתא ההרדמה.
שחרר שסתום מיכל חמצן וקבע קצב זרימת חמצן ב 1 L / min עם 2.5% איזופלוראן.
ודא כי העכבר נשאר בתא עם המכסה סגור היטב עד מחוסר הכרה לחלוטין. אשר אובדן הכרה מוחלט על ידי רפלקס כף הרגל חסר עם צביטת בוהן.
מניחים עכבר מרדים בתנוחת סופין עם הראש באף על הפלטפורמה המחוממת עם קצב זרימת חמצן ב 1 L / min עם 2.5% איזופלוראן.
גילחו שיער מהגפה האחורית הימנית באמצעות קוצץ חשמלי. מוציאים את השיער מהאזור המגולח עם מגבון אלכוהול ואקום קטן. יש לנקות את השיער שהוסר הרחק מהגפה האחורית ומהפלטפורמה.
יש להדק בבטחה את הגפה האחורית העליונה, האחורית לברך(איור 2).
הערה: ודא כי טווח התנועה של הברך אינו עכב.
מניחים את הגפה האחורית התחתונה לתוך מנגנון הארכת הברך עם השוקה האחורית נוגעת קלות בחתיכת הפלסטיק המתכווננים (קריאת הכוח בערוץ צריכה לקרוא בין 0 ל -1.0 mN * m). בהתאם לגודל הגפה האחורית התחתונה של העכבר, סרט ניתוחי עשוי להיות עטוף סביב החלק התחתון של חתיכת הפלסטיק מתכוונן כדי לאפשר את הרגל לנוח בבטחה.
הערה: תמונות וממדים מפורטים של פיסת הפלסטיק בהתאמה אישית מוצגים באיור 1 המשלים.
כוונן את הידיות על הפלטפורמה כדי להבטיח שהברך כפופה ב-60 מעלות.
הניחו קלות פיסת סרט על פלג פלג עליון של העכבר על הפלטפורמה כדי למנוע תנועה מפצה עם הארכת ברך מקסימלית.

4. מיקום אלקטרודה

מניחים אלקטרודות תת עוריות 2-4 מ"מ פרוקסימלי לברך ישירות מעל שרירי הארבע ראשי /הרחבת הברך(איור 2). אלקטרודות צריך להיות בערך 1-2 מ"מ זה מזה.
כדי לקבוע מיקום אופטימלי של אלקטרודות, השתמש בפונקציית גירוי מיידי עם צג נתונים חיים. הגדר אמפראז '/זרם ב 50 mA עבור עוויתות חוזרות ונשנות כדי לאשר את הארכת הברך (מגזים הברך יפיק עקומת עווית שלילית). התאם את הבדיקות במהלך גירוי מיידי כדי להשיג מומנט עוויתות מרביות בהארכת הברך כפי שנמדד בחלון Live Data Monitor.
הערה: איור 3 מציג פלט גירוי מיידי מייצג, המאשר הארכת הברך. וידאו משלים 1 וסרטון משלים 2 מראים עוויתות מתרחבות בזמן אמת ובהילוך איטי בברך ללא הזרוע המוטורית במקום, ומאפשרות אישור חזותי של הארכת הברך.
במהלך עוויתות חוזרות ונשנות עם גירוי מיידי, למשש את שרירי מכופף הברך עם האצבע המורה כדי לאשר שום הפעלה של שרירים אנטגוניסטיים. כדי לעורר באופן מקסימלי את מגני הברך, מיקום מחדש של בדיקה עשוי להיות נחוץ בהתאם להרכב הגוף של העכבר והבדלים אנטומיים קלים במיקום המדויק של הנקודה המוטורית של עצב הירך ושרירי המגדילים את הברך.
הערה: נקודת מנוע שריר היא המיקום שבו הענף המוטורי של עצב נכנס לבטן השריר והוא הנקודה עם ההתנגדות הנמוכה ביותר למוליכות חשמלית ולאחר מכן התגובה הגבוהה ביותר לגירוי חשמלי¹⁴^,¹⁵. ביישומים קליניים באמצעות גירוי חשמלי, נקודה זו מזוהה על ידי סריקה עם אלקטרודה עט כדי למצוא את המיקום מעל השריר שבו עווית שריר מתרחשת עם הזרם המוזרק הנמוך ביותר¹⁴^,¹⁵. זיהוי של נקודת מנוע השריר חיוני כדי להקל על גירוי חשמלי נוירו-שרירי אופטימלי¹⁵. בניסויים קליניים בבני אדם, נקודות מנוע שריר לשרירי הארבע ראשי זוהו במחצית הדיסטלית של השריר¹⁴. כדי להשיג גירוי מרומם הברך אופטימלי בעכברים, טכניקה זו היה recapitulated באמצעות מיקום אלקטרודה עם גירוי מיידי לרוב קרוב כמיקומי נקודת שרירים נמצא בדרך כלל במחצית דיסטלית של מנטרלי הברך. קיימת שונות מסוימת במיקום אלקטרודה (משטחי יחסית לעומק) המביאה מומנט מקסימלי, ותפקוד הגירוי המיידי מאפשר מיקום אלקטרודה אופטימלי.

5. קביעת זרם אופטימלי

לאחר קביעת מיקום בדיקה אופטימלי, בצע סדרה של עוויתות מתקדמות כדי לקבוע אמפראז אופטימלי / זרם לשמש לניסוי מומנט תדר, במטרה לקבוע את הזרם הנמוך ביותר כדי להשיג את פלט מומנט עווית מקסימלית. התחל בערכה הנוכחית ב- 50 mA ובחר הפעל ניסוי כדי להפיק עווית אחת. בחר ניתוח תוצאות כדי להציג פלט מומנט. הקלט את מומנט העווית המוצג תחת כוח מרבי עם חיסור בסיסי.
הערה: בחר באפשרות להפוך את ערוץ Force כדי להמיר מדידות ממומנט שלילי לחיובי.
הגדל את הזרם ל 60-70 mA וניסוי עווית חוזר. הקלט את מומנט העווית המוצג תחת כוח מרבי עם חיסור בסיסי.
המשך עם סדרה של ניסויי עווית באופן זה (הגדלת כ 10-20 mA עם כל התקדמות) עד מומנט עווית כבר לא עולה (או מישורים או מתחיל לרדת). דוגמה לסדרת עווית מוצגת בטבלה 1.
תעד את הזרם הנמוך ביותר שבו הושג מומנט העווית הגבוה ביותר. זרם זה ישמש ויישאר קבוע במהלך הניסוי הקרוב בתדר הכוח. איור 4 מראה עווית שיא מייצגת.

6. ניסוי בתדר כמומנט לקביעת שיאו של טון טטאני איזומטרי

בתוכנה (ראה טבלת חומרים), בחר את הניסוי מתוכנת מראש בתדר מומנט להארכת הברך המבטיח את ההגדרה הבאה. משך הגירוי: 0.35 שניות, רצף תדרים: 10 הרץ, 40 הרץ, 120 הרץ, 150 הרץ, 180 הרץ, 200 הרץ, תקופת מנוחה בין פולסים/התכווצויות: 120 s
הערה: קצב הדגימה הוא 10,000 הרץ (הגדרת ברירת מחדל).
הפעל ניסוי, לנתח תוצאות, ולתעד באופן ידני את המומנט המוצג תחת כוח מרבי עם חיסור בסיסי (ודא ערוץ הכוח הוא הפוך, כמו התכווצות הרחבת הברך תפיק מומנט שלילי) בכל תדר. שים לב לערך המרבי הגבוה ביותר כמומנט טטאני איזומטרי שיא. דוגמה לנתוני תדירות מומנט מוצגת בטבלה 2 ובאיור 5 מוצגת עקומת טטנוס מייצגת עבור פלט המומנט האיזומטרי האיזומטרי שהושג ב- 120 הרץ.

7. סיום הניסוי

עם השלמת הניסוי בתדר המומנט, בצע עווית מעקב והשווה עם עווית השיא הראשונית באותו זרם כדי להעריך נזק / עייפות.
הערה: במודלים מסוימים של פגיעה ומחלות, השמנה מוגברת של שריר השלד צפויה ואינה מהווה בעיה עם ההתקנה הניסיונית או העכבר.
כאשר כל מדידות מומנט הושלמו, בעדינות להסיר בדיקות אלקטרודה, ולבטל את כריתת הברך.
כבה איזופלוראן והסר את העכבר מחרוט האף.
מניחים את העכבר בחזרה לכלוב מתאים המונח על משטח התחממות. צג כמו העכבר מתאושש וחזר להכרה.
הערה: העכבר צריך להיות מודע ונע בתוך 2-3 דקות.

8. ניתוח נתונים

חלץ נתונים לאחר הניסוי מתוכנת ניתוח (ראה טבלת חומרים).
1. תוכנת ניתוח פתוחה.
2. בחר קבל נתונים מהתוכנה.
3. בחר תאריך שבו בוצע הניסוי וקוד העכבר המתאים.
4. בחר את תדירות העניין (כל ניסויי העווית וכל תדר של ניסוי תדרי ומומנט יפורטו).
5. בחר ניתוח שרירים.
6. ודא ש'השתמש בתיקון בסיסי' נבדק.
  הערה: מומנט בסיסי מחושב על-ידי התוכנה כממוצע של 100 הנקודות הראשונות שנדגמו והוחמרו מערך המומנט המרבי המוחלט.
7. רשום את ערך מומנט המפורט תחת מרבי.
  הערה: הנתונים המוצגים כאן אינם מסוננים; עם זאת, ניתן לבחור מסנן בתוכנה, אם תרצה בכך.
לחלופין, כמתואר לעיל בשלב 6.2, הקלט באופן ידני את פלט המומנט המוצג תחת כוח מרבי בזמן אמת בכל נקודת/התכווצות של תדר מומנט דרך החלון ניתוח תוצאות.
1. ודא שקווי הבסיס מופחתים, ותעל הכוח הפוך.
2. הזן נתונים לתוך גיליון אלקטרוני עבור חישובי נורמליזציה משקל הגוף (מקטור / משקל גוף בגרמים) ותנוחי גרף סטטיסטיים של עניין. תוכנה סטטיסטית שימשה לצורך גרף עקומות תדירות מומנט וחישוב שטח מתחת לעקומה.
  הערה: נתוני מומנט נמדדים ב- mN.m (milliNewton.meters).
כדי ליצור עקומות טטנוס, יצא נתונים מלאים מכל תדר מתוכנת הניתוח.
1. חזור על שלבים 8.1.1-8.1.4 לעיל.
2. בחר יצא נתונים.
3. בחר נתונים מסוננים גולמיים ושמור במיקום המועדף. ניתן להשתמש ב- MATLAB ליצירת עקומות טטנוס מקובץ הטקסט המיוצא ו/או לניתוח נוסף.
  הערה: קוד MATLAB ליצירת עקומת טטנוס מקובץ טקסט זמין על פי בקשה.

9. כיול מערכת ידית דו-מצבית

כייל את המערכת לפני השימוש הראשוני כדי להבטיח נתונים מדויקים ואמינים, וחזור על כיול מעת לעת באמצעות תוכנת איסוף הנתונים ומשקולות ידועות.
1. פתח תוכנה לאיסוף נתונים.
2. לחץ על הכרטיסיה התקנה ובחר הגדרת ערוץ.
3. בחר 305C-FP המפורטיםתחת המכשירים שלי .
4. לחץ על כייל נבחר כדי לפתוח את החלון עורך הכיול.
5. כדי לכייל אורך, הזן סדרה של מתחי בדיקה כולל מתחים שליליים וחיוביים (למשל, -3, -2, -1, 0, 1, 2, 3 V).
  1. לחץ על קבע עבור השורה הראשונה.
  2. לחץ על קרא.
  3. מדוד את האורך המדויק של זרוע הידית במילימטרים והכניס לתיבה המתאימה.
  4. חזור על הפעולה למתח הבא.
  5. בעת הקלטת כל המתחים, לחץ על חשב גורמי קאל (מוקלטים ב- mm/volt).
6. כדי לכייל כוח ב, השתמש קבוצה של משקולות ידועות גדל בהתקדמות ליניארית.
  1. התאימו את המנוע כך שהוא נח על קצה הספסל או השולחן עם זרוע הידית במקביל לספסל ותלויים על הקצה כדי לאפשר למשקל להיתלות.
  2. לתלות את המשקל הראשון מזרוע הידית באמצעות גומייה. תחת כוח מיושם, הזן את המשקל הידוע בגרמים חשבונאות המסה של הגומייה.
  3. בחר קרא.
  4. חזור על הפעולה עבור לפחות 3 משקולות ידועות.
  5. בחר חשב גורם קאל.
  6. כדי לאמת חישוב, התווה נתוני כיול והתאמת עקומה על-ידי בחירה באפשרות Plot Cal.
7. לכיול כוח החוצה, הזן מתחי כיול (עד 10 וולט)
  1. לחץ על הגדר ישירות ליד מתח הכיול.
  2. חזור על הפעולה עבור כל קו מתח.
  3. יש להפעיל בעדינות לחץ על זרוע הידית באמצעות אצבע עד שהכוח החוצה מפסיק להשתנות וזרוע המנוע מתחילה לזוז.
  4. שמור על עמדה זו. בחר קרא.
  5. חזור על הפעולה עבור כל קו מתח.
  6. בחר חשב גורם קאל.

תוצאות

עקומת תדר המומנט משתמשת בתדרים נמוכים יותר כדי לייצר עוויתות איזומטריות מבודדות מרובות של מומנט נמוך יחסית ומתקדמת באמצעות תדרים גבוהים יותר ויותר, וכתוצאה מכך היתוך של עוויתות להתכווצות טטנוס איזומטרית שבה מומנט טטאני שיא מתקבל. הפרוטוקול שהוצג להארכת הברך שיא מומנט טטאני עקומת תדר הכוח יוזם ב 10 הרץ אשר מעורר 3 עוויתות מבודדות. היתוך חלקי של עוויתות מתרחש ב-40 הרץ, ומומנט טטאני שיא מגיע בין 120-180 הרץ (איור 5).

איור 6 ממחיש עקומות מייצגות של תדירות מומנט מאריך הברך מעכברי C57BL/6 נשיים. שלושה עכברים נפרדים נבדקו בבסיס, והניסוי חזר על עצמו בכל עכבר שבועיים לאחר מכן לשם השוואה כדי להעריך את יכולת הרבייה. עקומות בתדר מומנט מוצגות עם ערכי מומנט גולמיים(איור 6A),כמו גם ערכי מומנט גולמיים מנורמלים למשקל גוף העכבר(איור 6B). תצפיות חוזרות מדגימים תוצאות דומות בכל 3 העכברים עם תקופת מנוחה של שבועיים בין ניסויים. יש לשקול נתוני מומנט מנורמלים במשקל הגוף בנוסף מומנט גלם, כמו תנודה קלה במשקל עשוי להשפיע על הפלט התפקודי ואינו נחשב עם מומנט גלם בלבד. יתר על כן, נתוני מומנט מנורמלים במשקל הגוף מאפשרים השוואה של עכברים בגדלים שונים. מומנט יכול להיות מנורמל גם למשקל רטוב שריר או אזור חתך מיופיבר, כפי שהראינו בעבר¹⁶.

איור 7A מציג את האזור שמתחת לעקומה באמצעות נתוני מומנט איזומטרי מנורמלים במשקל הגוף מניסויים מלאים בתדר מומנט (10 הרץ, 40 הרץ, 120 הרץ, 150 הרץ, 180 הרץ, 200 הרץ) עבור 4 עכברי C57BL/6 נפרדים, המדגישים פלט מומנט כולל דומה ומקדםי וריאציה בין 5.6% ל-8.8% עם ניסויים חוזרים ונשנים בתוך אותם עכברים. הנתונים מדווחים בפשטות כמומנט טטאני שיא (איור 7B) שהוא ערך מומנט מקסימלי מההתכווצויות האיזומטריות החוזרות ונשנות של טטנוס בין 120-200 הרץ. תפוקת מומנט טטאני שיא דומה 6-8 חודשים נקבה C57BL/6 עכברים(איור 7B)עם מקדמי וריאציה בין 4.8% ו 8.7% עם הערכה אורך בתוך אותם עכברים. מומנט שיא טטאני דומה ביותר להערכת כוח תקן הזהב במחקרים בבני אדם: מומנט איזומטרי מקסימלי.

יתר על כן, מרווח מומנט טטאני שיא הרחבת הברך הוא כלי שימושי כדי לזהות הבדלי כוח בדגמי עכבר מרובים. איור 8 מדגים את הניגוד החד בין כוח המתיחה בברך בעכברה נקבה C57BL/6 לא פצועה בת 6 חודשים (קו שחור) לבין מודל עכבר מהונדס של היפרטרופיה על-פיזיולוגית שבה מיוסטטין/GDF8 מובסים (קו כחול). אנו גם מראים עקומת שיא טטנוס מעכבר C57BL/6 7 ימים לאחר טרנספר כירורגי של הרצועה הצולבת הזעירה (ACL-T) (קו אדום), המדגימה ירידה של כמעט 50% במומנט שיא לאחר פציעה שהיא הרבה מחוץ לקדם של וריאציה שנצפו בבדיקות חוזרות של עכברים לא נפגעו. במקביל לנתונים אנושיים^17,^18,כוח הוא פחת באופן משמעותי עם ACL-T. כל העכברים הם נקבות ובגיל דומה (6-8 חודשים).

ניסוי עווית	אמפראז'/זרם (mA)	מומנט (mN•m)
1	50	1.279
2	70	1.341
3	90	1.36
4	110	1.362
5	*130	1.449
6	150	1.436
7	140	1.333

טבלה 1: דוגמה לסדרת עוויתות. * מציין אמפראז'/זרם אופטימליים.

תדר (הרץ)	מומנט(mN•m)
10	1.385
40	1.869
120	*18.765
150	18.375
180	17.97
200	17.548

טבלה 2: דוגמה לנתוני עקומה בתדר מומנט. * מציין את שיאו של המניה הטטנית.

figure-results-4310
איור 1: הגדרת תוכנה לאיסוף נתונים. איור של תוכנית ההתקנה עבור תוכנה לאיסוף נתונים באמצעות Live Data Monitor. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-4757
איור 2: הגדרת עכבר ומיקום אלקטרודה. (A-B) מיקום עלה של העכבר המקבל הרדמה דרך חרוט אף על הפלטפורמה המחוממת. הגפה האחורית העליונה מהודקת בבטחה, אחורית לברך כדי לאפשר תנועה בלתי מוגבלת במפרק הברך. הזרוע המוטורית מותאמת כך שהברך כפופה בכ-60 מעלות. נקודת המנוע של עצב הירך מגורה על ידי אלקטרודות מחט כדי להפעיל התכווצות של מגדילי הברך. הגדרת העכבר מוצגת מתצוגה צדדית (A) ומתצוגת תקורה (B). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-5533
איור 3: קביעת מיקום אלקטרודה אופטימלי להשגת הארכת ברך איזומטרית. ייצוג של עוויתות שליליות חוזרות ונשנות מגורה עם 50 mA באמצעות הפונקציה גירוי מיידי וצפה בצג הנתונים החי. החצים האדומים מצביעים על שלוש העוויתות הראשונות של הארכת הברך. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-6104
איור 4: עווית ייצוגית כדי לקבוע אמפראז' אופטימלי. האמפראז' הנמוך ביותר כדי לעורר את המומנט האיזומטרי העווית הגבוה ביותר חייב להיקבע לניסוי בתדר הכוח על ידי ניסויי עוויתות חוזרים ונשנים עם אמפראז 'מוגבר בהדרגה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-6652
איור 5: עקומות מומנט טטאניות מייצגות לאורך ניסוי בתדר מומנט עבור אותו עכבר. (A)מומנט איזומטרי איזומטרי תת-מימי המיוצר ב- 10 הרץ. (B)מומנט איזומטרי תת-מקסימלי ב- 40 הרץ. (C) פלט מומנט טטאני איזומטרי שיא ב 120 הרץ. (D) מומנט טטאני איזומטרי ב 150 הרץ. (E)מומנט טטאני איזומטרי ב 180 הרץ. (F) מומנט טטאני איזומטרי ב 200 הרץ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-7413
איור 6:נתוני עקומת מומנט מייצגים. (A-B). עקומת תדירות מומנט בשתי נקודות זמן שונות (שבוע 1 ו -3) ב -3 עכברים נפרדים, המוצגים כמומנט שיא גולמי (A) ומומנט שיא גולמי מנורמל למשקל הגוף (B). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-7987
איור 7: שטח מייצג מתחת לעקומה (AUC) ונתוני מומנט טטאניים שיא. (A)AUC עבור 4 עכברים נפרדים, המוצגים כמומנט גולמי מנורמל למשקל הגוף. (B)מומנט טטאני שיא עבור אותם 4 עכברים, המוצג כמומנט שיא טטאני גלם מנורמל למשקל הגוף. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-8575
איור 8: מומנט טטאני שיא של מגברי ברכיים בדגמי עכבר מרובים. עקומות מומנט שיא מייצגות עבור דגם עכבר מהונדס היפרטרופיה גלויה (GDF8 KO), עכבר C57BL/6 בריא ללא פגע (עכבר 2), ועכבר C57BL/6 7 ימים לאחר טרנספרציה ברצועה הצולבת הזעירה (ACL-T). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור משלים 1: מידות של פלסטיק מפוברק מותאם אישית. ההטתעפות באדום מראה ממד של עומק. נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

וידאו משלים 1: עוויתות מתן הברך בזמן אמת ללא זרוע מוטורית. אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה.

וידאו משלים 2: התרוות מגבר הברך בהילוך איטי ללא זרוע מוטורית. אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה.

Discussion

מדידה וניתוח של תפקוד השריר במודלים מכרסמים הוא הכרחי כדי להפוך מסקנות תרגומיות ומשמעותיות לגבי הסתגלויות שרירי השלד היסתולוגיים והמולקולריים שנצפו עם פעילות גופנית, פציעה, מחלות וטיפול טיפולי. אנו מדגימים שיטה להערכת כוח מרבי של מסלסל הברך באופן אמין ושוב ושוב בעכברים המשתמשים בציוד זמין מסחרית, כאשר חתיכת הפלסטיק המתכווננת מחזיקה את הגפה האחורית התחתונה בשוקה האחורית האחורית היא החלק המפוברק המותאם אישית היחיד שניתן לשכפל.

כלי הערכה פונקציונליים נפוצים שימשו באופן נרחב להערכה חוזרת ונשנית של הביצועים הגופניים בתוך אותו עכבר, כגון הליכון רץ לעייפות רצונית, בדיקת ביצועים של רוטרוד, מבחן היצמדות הפוך ומבחן כוח אחיזה. עם זאת, בעוד אינפורמטיבי, הערכות אלה כרוכות מרכיבים קרדיו-ריאותיים והתנהגותיים, אשר יכול לטשטש את החקירה של תפקוד עצבי-שרירי הקשורים אלה מדדי ביצועים פיזיים. יתר על כן, אלמנטים של סיבולת, קואורדינציה ואיזון נמצאים ברבות מהערכות תפקודיות אלה לרמות שונות, ומגבילים פרשנות ברורה ביחס לכוח השריר. הכוח המייצר את היכולת של שרירי מכרסמים ניתן למדוד במבחנה, במקום, או ב vivo. לכל גישה יתרונות ומגבלות יחסיים. באופן ספציפי, עם הערכה במבחנה, השריר מבודד לחלוטין ומוסר מגופו של החיה, כך שאין השפעה על זלוף או פנימיות¹⁹. זה מניב סביבה מבוקרת היטב כדי לברר את יכולת התכווצות אבל מגביל את גודל השריר הנחקר באמצעות תלות על דיפוזיה פסיבית של חמצן וחומרים מזינים במהלך הבדיקה. בבדיקת situ שומרת על הפנימיות ואספקת הדם של השריר, אך מוגבלת להערכת מסוף ייחודית, כמו בבדיקת מבחנה²⁰. לבסוף, בבדיקת vivo היא הפחות פולשנית עם השריר שנותר בסביבתו הטבעית עם אלקטרודות עוריות המוחדרות ליד עצב המנוע כדי לעורר את השריר חשמלית. כוחה של גישת in vivo הוא הפוטנציאל לבדיקות אורך לאורך זמן^21,²²^,²³.

בהערכת vivo של התכווצות שריר שיא מודד באופן אופטימלי כוח מקסימלי כמו האנטומיה והפיזיולוגיה הרגילה של העכבר נשאר שלם ואת השיטה עשויה לחזור על אותו עכבר לפני ואחרי התערבות או לאורך תוחלת החיים. באופן ספציפי, במדידת vivo של כוח הרחבת הברך בעכברים היא הערכת כוח מורין עם הרלוונטיות התרגומית הגדולה ביותר למחקרים בבני אדם, כמו מומנט הרחבת הברך המרבי נמדד בדרך כלל ונחשב מבחן כוח תקן זהב בבני אדם עם מתאם לתוצאות תפקודיות ובריאותיות שונות²⁴^,²⁵^,²⁶^,²⁷ . יתר על כן, פתולוגיה מתן לחץ הברך הוא ציין עם הזדקנות, כמו גם מספר עצום של פציעות ומחלות¹^,^2,⁴^,⁵^,⁶, אבל הערכת ההשפעה של תנאים אלה על כוח המגדיל הברך אורך בעכברים לא היה בר השגה.

למרות שיטה זו מציעה שירות כדי לקבוע מומנט שיא הרחבת הברך באופן אורך, מגבלות מסוימות של הפרוטוקול צריך להיחשב. תדרים נמוכים יותר בין 40 הרץ ל-120 הרץ הושמטו מפרוטוקול תדר המומנט, מה שעשוי להגביל את היכולת לזהות תזוזות שמאלה או ימינה בעקומת תדר המומנט עם פציעה או מחלה. עם זאת, באמצעות פרוטוקול תדר מומנט זה, הצלחנו לזהות שינויים לשיא מומנט טטאני במודל פגיעה ACL ובין עכברי סוג בר C56BL / 6 ומודל עכבר מהונדס של מסת שריר על-פיזיולוגית (איור 8). אנו מציינים כי זה עשוי להיות מועיל כדי לאבטח את האלקטרודות עם ידיים עוזרות או מכשיר דומה כמו התכווצויות שרירים עשוי להזיז אלקטרודות מעט. לא שמנו לב לעקירה ברורה של אלקטרודות עם התכווצויות מתקדמות; עם זאת, לא ניתן לשלול את האפשרות של תנועה קלה של האלקטרודות, אשר עשוי להשפיע על גירוי שרירים. בנוסף, אלקטרומיוגרפיה תוך שרירית (EMG) לא בוצעה בשילוב עם פרוטוקול הגירוי; עם זאת, הכללת אמצעי EMG עשויה להיות ריאלית, אם תרצה ומתאימה למודל הניסיוני של עניין.

הערכת כוח מגבר הברך במודלים מוריניים של פגיעה אורתופדית ומחלות תקל על מחקר פרה-קליני עם רלוונטיות תרגומית משמעותית לאמצעי חוזק קליניים. הפרוטוקול שלנו מאפשר הערכה מדויקת וחזרנית של עוצמת המגדילים המקסימלית של הברך בעכברים עם ציוד זמין מסחרית הנגיש לכל מעבדה.

Disclosures

מתיו בורקובסקי מועסק על ידי אורורה סיינטיפיק בע"מ, חברה שעשויה ליהנות מתוצאות המחקר והיא גם מנהלת של החברה.

Acknowledgements

ברצוננו להודות לרוסאריו מארוטו על הסיוע הטכני. מחקר שדווח בפרסום זה נתמך על ידי המכון הלאומי לדלקת פרקים ומחלות שרירים ושלד ועור של המכונים הלאומיים לבריאות תחת פרס מספר R01 AR072061 (CSF). התוכן הוא באחריות המחברים בלבד ואינו מייצג בהכרח את הדעות הרשמיות של המכונים הלאומיים לבריאות.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1300A: 3-in-1 Whole Animal System- Mouse	Aurora Scientific Incorporated	300D-305C-FP: dual-mode motor with custom knee extension apparatus, 605A: Dynamic Muscle Data Acquisition and Analysis System, 701C: Electrical Stimulator, 809C: in-situ Mouse Apparatus
6100 Dynamic Muscle Control LabBook software	Aurora Scientific Incorporated	DMC v6.000
611A Dynamic Muscle Analysis	Aurora Scientific Incorporated	DMA v5.501
BravMini hair clippers	Wahl Clipper Corporation	ASIN: B00IN24ILE
Eye Lube	Optixcare	Item Number: 142422
Isoflurane	Covetrus	NDC: 11695-6777-2
V-1 Tabletop Laboratory Animal Anesthesia System	VetEquip Inhalation Anesthesia Systems	Item Number: 901806
Prism 8	GraphPad Software, LLC	Version 8.3.0 (328)

References

Brightwell, C. R., et al. Moderate-intensity aerobic exercise improves skeletal muscle quality in older adults. Translational Sports Medicine. 2 (3), 109-119 (2019).
Moro, T., et al. Muscle protein anabolic resistance to essential amino acids does not occur in healthy older adults before or after resistance exercise training. Journal of Nutrition. 148 (6), 900-909 (2018).
Angelozzi, M., et al. Rate of force development as an adjunctive outcome measure for return-to-sport decisions after anterior cruciate ligament reconstruction. Journal of Orthopedic Sports Physical Therapy. 42 (9), 772-780 (2012).
Kalyani, R. R., et al. Quadriceps strength, quadriceps power, and gait speed in older U.S. adults with diabetes mellitus: results from the National Health and Nutrition Examination Survey, 1999-2002. Journal of American Geriatric Society. 61 (5), 769-775 (2013).
Culvenor, A. G., Ruhdorfer, A., Juhl, C., Eckstein, F., Øiestad, B. E. Knee extensor strength and risk of structural, symptomatic, and functional decline in knee osteoarthritis: A systematic review and meta-analysis. Arthritis Care Res (Hoboken). 69 (5), 649-658 (2017).
Abramowitz, M. K., et al. Skeletal muscle fibrosis is associated with decreased muscle inflammation and weakness in patients with chronic kidney disease. American Journal of Physiology and Renal Physiology. 315 (6), 1658-1669 (2018).
Arentson-Lantz, E. J., English, K. L., Paddon-Jones, D., Fry, C. S. Fourteen days of bed rest induces a decline in satellite cell content and robust atrophy of skeletal muscle fibers in middle-aged adults. Journal of Applied Physiology. 120 (1985), 965-975 (2016).
Pratt, S. J. P., Lovering, R. M. A stepwise procedure to test contractility and susceptibility to injury for the rodent quadriceps muscle. Journal of Biological Methods. 1 (2), (2014).
Kamekura, S., et al. Osteoarthritis development in novel experimental mouse models induced by knee joint instability. Osteoarthritis Cartilage. 13 (7), 632-641 (2005).
Kwok, J., et al. Histopathological analyses of murine menisci: implications for joint aging and osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage. 24 (4), 709-718 (2016).
Glasson, S. S., Blanchet, T. J., Morris, E. A. The surgical destabilization of the medial meniscus (DMM) model of osteoarthritis in the 129/SvEv mouse. Osteoarthritis Cartilage. 15 (9), 1061-1069 (2007).
Christiansen, B. A., et al. Musculoskeletal changes following non-invasive knee injury using a novel mouse model of post-traumatic osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage. 20 (7), 773-782 (2012).
Wurtzel, C. N., et al. Pharmacological inhibition of myostatin protects against skeletal muscle atrophy and weakness after anterior cruciate ligament tear. Journal of Orthopedic Research. 35 (11), 2499-2505 (2017).
Botter, A., et al. Atlas of the muscle motor points for the lower limb: implications for electrical stimulation procedures and electrode positioning. European Journal of Applied Physiology. 111 (10), 2461-2471 (2011).
Gobbo, M., Maffiuletti, N. A., Orizio, C., Minetto, M. A. Muscle moter point identification is essential for optimizing neuromuscular electrical stimulation use. Journal of Neuroengineering and Rehabililitation. 11, 17(2014).
Neelakantan, H., et al. Small molecule nicotinamide N-methyltransferase inhibitor activates senescent muscle stem cells and improves regenerative capacity of aged skeletal muscle. Biochemical Pharmacology. 163, 481-492 (2019).
Kline, P. W., Morgan, K. D., Johnson, D. L., Ireland, M. L., Noehren, B. Impaired quadriceps rate of torque development and knee mechanics after anterior cruciate ligament reconstruction with patellar tendon autograft. American Journal of Sports Medicine. 43 (10), 2553-2558 (2015).
Hiemstra, L. A., Webber, S., MacDonald, P. B., Kriellaars, D. J. Knee strength deficits after hamstring tendon and patellar tendon anterior cruciate ligament reconstruction. Medicine and Science in Sports and Exercise. 32 (8), 1472-1479 (2000).
Park, K. H., et al. Ex vivo assessment of contractility, fatigability and alternans in isolated skeletal muscles. Journal of Visualized Experiments. (69), e4198(2012).
MacIntosh, B. R., Esau, S. P., Holash, R. J., Fletcher, J. R. Procedures for rat in situ skeletal muscle contractile properties. Journal of Visualized Experiments. (56), e3167(2011).
Chiu, C. S., et al. Non-invasive muscle contraction assay to study rodent models of sarcopenia. BMC Musculoskeletal Disorder. 12, 246(2011).
Mintz, E. L., Passipieri, J. A., Lovell, D. Y., Christ, G. J. Applications of in vivo functional testing of the rat tibialis anterior for evaluating tissue engineered skeletal muscle repair. Journal of Visualized Experiments. (116), e54487(2016).
Gerlinger-Romero, F., et al. Non-invasive assessment of dorsiflexor muscle function in mice. Journal of Visualized Experiments. (143), e58696(2019).
Davis, C. C., Ellis, T. J., Amesur, A. K., Hewett, T. E., Di Stasi, S. Improvements in knee extension strength are associated with improvements in self-reported hip function following arthroscopy for femoroacetabular impingement syndrome. International Journal of Sports Physical Therapy. 11 (7), 1065-1075 (2016).
Omori, G., et al. Quadriceps muscle strength and its relationship to radiographic knee osteoarthritis in Japanese elderly. Journal of Orthopedic Science. 18 (4), 536-542 (2013).
Wilk, K. E., Romaniello, W. T., Soscia, S. M., Arrigo, C. A., Andrews, J. R. The relationship between subjective knee scores, isokinetic testing, and functional testing in the ACL-reconstructed knee. Journal of Orthopedic Sports and Physical Therapy. 20 (2), 60-73 (1994).
Bobowik, P., Wiszomirska, I. Diagnostic dependence of muscle strength measurements and the risk of falls in the elderly. Internation Journal of Rehabilitation Research. 43 (4), 330-336 (2020).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

169

This article has been published

Video Coming Soon

Keep me updated: