Misurazione in vivo della funzione muscolare estensore del ginocchio nei topi

Riepilogo

La quantificazione della forza massima dell'estensore del ginocchio è indispensabile per comprendere gli adattamenti funzionali all'invecchiamento, alla malattia, alle lesioni e alla riabilitazione. Presentiamo un nuovo metodo per misurare ripetutamente la coppia tetanica di picco isometrica dell'estensione del ginocchio in vivo.

Abstract

La plasticità del muscolo scheletrico in risposta a innumerevoli condizioni e stimoli media l'adattamento funzionale simultaneo, sia negativo che positivo. Nella clinica e nel laboratorio di ricerca, la forza muscolare massima è ampiamente misurata longitudinalmente negli esseri umani, con la muscolatura estensore del ginocchio il risultato funzionale più riportato. La patologia del complesso muscolare estensore del ginocchio è ben documentata nell'invecchiamento, nelle lesioni ortopediche, nelle malattie e nel disuso; la forza dell'estensore del ginocchio è strettamente correlata alla capacità funzionale e al rischio di lesioni, sottolineando l'importanza di una misurazione affidabile della forza dell'estensore del ginocchio. La valutazione ripetibile e in vivo della forza dell'estensore del ginocchio negli studi pre-clinici sui roditori offre preziosi endpoint funzionali per gli studi che esplorano l'osteoartrite o la lesione del ginocchio. Riportiamo un protocollo in vivo e non invasivo per misurare ripetutamente la coppia tetanica di picco isometrica degli estensori del ginocchio nei topi nel tempo. Dimostriamo coerenza utilizzando questo nuovo metodo per misurare la forza dell'estensore del ginocchio con valutazioni ripetute in più topi che producono risultati simili.

Introduzione

Il muscolo scheletrico è un tessuto altamente adattabile con alterazioni compensatori della massa e della struttura in risposta a una miriade di stimoli, come esercizio fisico, nutrizione, lesioni, malattie, invecchiamento e disuso. Molti studi che studiano l'adattamento del muscolo scheletrico negli esseri umani impiegano metodi per misurare sia le dimensioni del muscolo scheletrico che l'impatto sulla funzione, poiché le valutazioni della forza gold standard sono facilmente ripetibili nei soggetti umani.

In particolare, la forza dell'estensore del ginocchio e del flessore è più valutata nella ricerca clinica. Alterazioni della forza estensore del ginocchio sono state ampiamente riportate in studi sull'uomo di invecchiamento, esercizio fisico, lesioni ortopediche, osteoartrosi del ginocchio, malattiecroniche e disuso^{1,2,3,4,5,6,7.} Tuttavia, i metodi per analizzare ripetutamente e in modo non invasivo la forza del muscolo estensore del ginocchio (quadricipite) negli studi sui roditori meccanicistici sono stati relativamente limitati. Un metodo per determinare in vivo la contrattilità muscolare del quadricipite nei ratti è stato precedentemente sviluppato⁸; tuttavia, è necessaria un'ampia costruzione di apparecchiature non disponibili in commercio. Data l'ampiezza dei modelli di roditori sviluppati per studiare gli esiti muscoloscheletrici a seguito di lesioni al ginocchio / osteoartrite^{9,10,11,12,13} esiste la necessità di una valutazione non invasiva della forza del quadricipite.

Inoltre, gli studi sui roditori che studiano i meccanismi molecolari alla base dell'adattamento del muscolo scheletrico spesso utilizzano modelli murini a causa della semplicità della modificazione genetica, così come molti studi di intervento farmacologico a causa della diminuzione delle spese finanziarie associate a un dosaggio basato sul peso inferiore di un farmaco nei topi rispetto ai ratti. Riportiamo un metodo non invasivo per misurare ripetutamente la funzione estensore del ginocchio in vivo nello stesso topo nel tempo utilizzando apparecchiature disponibili in commercio con piccole modifiche, facilitando la riproducibilità tra diversi laboratori e fornendo un confronto più diretto con i risultati della forza umana.

Protocollo

Tutte le procedure sperimentali sono state approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università del Kentucky.

1. Configurazione dell'apparecchiatura

1. Verificare che le macchine siano collegate in base alle specifiche del produttore.
2. Se non è già in posizione, collegare il motore 300D-305C-FP con l'apparato di estensione del ginocchio alla piattaforma animale 809C.
3. Accendere la pompa dell'acqua a 37 °C per iniziare a riscaldare la piattaforma.
4. Se il computer non è già acceso, accendetelo, seguito dallo stimolatore bifase ad alta potenza e dal sistema a leva a doppia modalità a 2 canali.
5. Versare l'isoflurano nel vaporizzatore fino alla massima linea di riempimento.

2. Configurazione del software

1. Aprire il software (dettagli forniti nella Tabella dei materiali).
2. Per utilizzare la funzione Stimolazione istantanea in combinazione con Live Data Monitor per ottimizzare il posizionamento della sonda (passaggio 4), selezionare Prepara esperimento seguito da Configura stimolo istantaneo (Figura 1). Impostare la frequenza di impulso (Hz) su 125, la larghezza di impulso (ms) come 0,2, il numero di impulsi come 1, la frequenza del treno (Hz) su 0,5 e il tempo di esecuzione (s) come 120.
3. Selezionare File e aprire Live Data Monitor.
4. Per eseguire esperimenti di contrazione (fase 5) e frequenza di coppia (fase 6), selezionare uno studio precedentemente programmato che includa esperimenti appropriati di contrazione e estensione del ginocchio coppia-frequenza (dettagliati di seguito nei passaggi 5 e 6).
   1. Selezionare il mouse sperimentale appropriato o Aggiungi nuovo animale e immettere le informazioni del mouse corrispondenti da inserire con i dati di coppia.
   2. Selezionare Esperimento successivo o Esperimento precedente per passare dal protocollo di contrazione alla sequenza coppia-frequenza.

3. Configurazione del mouse

1. Posizionare il singolo topo nella camera anestetica.
2. Rilasciare la valvola del serbatoio dell'ossigeno e impostare la portata dell'ossigeno a 1 L / min con isoflurano al 2,5%.
3. Assicurarsi che il mouse rimanga nella camera con il coperchio chiuso saldamente fino a completo incoscienza. Confermare la completa perdita di coscienza da riflesso del piede assente con pizzico della dita.
4. Posizionare il topo anestetizzato in posizione supina con la testa nel naso sulla piattaforma riscaldata con portata di ossigeno a 1 L/min con il 2,5% di isoflurano.
5. Rasare i capelli dall'arto posteriore destro usando tagliacapelli elettrici. Rimuovere i capelli dall'area rasata con una salvietta icool e un piccolo aspirapolvere. Pulire i peli rimossi lontano dall'arto posteriore e dalla piattaforma.
6. Bloccare saldamente l'arto posteriore superiore, posteriore al ginocchio (Figura 2).
   NOTA: assicurarsi che la gamma di movimento del ginocchio non sia ostacolata.
7. Posizionare l'arto posteriore inferiore nell'apparato di estensione del ginocchio con la tibia anteriore che tocca leggermente il pezzo di plastica regolabile (la lettura del canale Force In dovrebbe leggere tra 0 e -1,0 mN * m). A seconda delle dimensioni dell'arto posteriore inferiore del topo, il nastro chirurgico può essere avvolto attorno alla parte inferiore del pezzo di plastica regolabile per consentire alla gamba di riposare in modo sicuro.
   NOTA: le immagini dettagliate e le dimensioni del pezzo di plastica fabbricato su misura sono mostrate nella Figura supplementare 1.
8. Regola le manopole sulla piattaforma per assicurarti che il ginocchio sia piegato a 60°.
9. Posizionare leggermente un pezzo di nastro adesivo sul busto del mouse sulla piattaforma per evitare movimenti compensativi con estensione massima del ginocchio.

4. Posizionamento dell'elettrodo

1. Posizionare gli elettrodi per via sottocutanea di 2-4 mm prossimali al ginocchio direttamente sopra i muscoli quadricipiti/estensori del ginocchio (Figura 2). Gli elettrodi devono essere distanti circa 1-2 mm.
2. Per determinare il posizionamento ottimale degli elettrodi, utilizzare la funzione di stimolazione istantanea con Live Data Monitor. Impostare l'amperaggio/ corrente a 50 mA per contrazioni ripetute per confermare l'estensione del ginocchio (gli estensori del ginocchio produrranno una curva di contrazione negativa). Regolare le sonde durante la stimolazione istantanea per ottenere la massima coppia di contrazione dell'estensione del ginocchio misurata nella finestra Live Data Monitor.
   NOTA: la Figura 3 mostra un'uscita di stimolazione istantanea rappresentativa, che conferma l'estensione del ginocchio. Il video supplementare 1 e il video supplementare 2 mostrano contrazioni estensorie del ginocchio in tempo reale e al rallentatore senza il braccio motore in posizione, consentendo la conferma visiva dell'estensione del ginocchio.
3. Durante le contrazioni ripetute con stimolazione istantanea,palpare i muscoli flessori del ginocchio con l'indice per confermare l'ea attivazione dei muscoli antagonisti. Per stimolare al massimo gli estensori del ginocchio, può essere necessario il riposizionamento della sonda a seconda della composizione corporea del topo e di lievi differenze anatomiche nella posizione esatta del punto motorio del nervo femorale e dei muscoli estensori del ginocchio.
   NOTA: Un punto motore muscolare è la posizione in cui il ramo motorio di un nervo entra nella pancia muscolare ed è il punto con la minore resistenza alla conduttività elettrica e successivamente la massima reattività alla stimolazione elettrica^14,15. Nelle applicazioni cliniche che utilizzano la stimolazione elettrica, questo punto viene identificato dalla scansione con un elettrodo a penna per trovare la posizione sopra il muscolo in cui si verifica una contrazione muscolare con la corrente iniettata più bassa^14,15. L'identificazione del punto motore muscolare è essenziale per facilitare la stimolazione elettrica neuromuscolare ottimale¹⁵. Negli studi clinici sull'uomo, i punti motori muscolari per i muscoli quadricipite sono stati identificati nella metà distale del muscolo¹⁴. Per ottenere una stimolazione ottimale dell'estensore del ginocchio nei topi, questa tecnica è stata ricapitolata utilizzando il posizionamento dell'elettrodo con stimolazione istantanea per approssimare il più vicino possibile le posizioni del punto motorio muscolare che si trovano tipicamente nella metà distale degli estensori del ginocchio. Esiste una certa variabilità nel posizionamento degli elettrodi (da relativamente superficiale a profondo) che si traduce in una coppia massima e la funzione di stimolazione istantanea facilita il posizionamento ottimale dell'elettrodo.

5. Determinazione della corrente ottimale

1. Una volta determinato il posizionamento ottimale della sonda, eseguire una serie di contrazioni progressive per determinare l'amperaggio / corrente ottimale da utilizzare per l'esperimento coppia-frequenza, con l'obiettivo di determinare la corrente più bassa per ottenere la massima uscita di coppia di contrazione. Inizia con la corrente impostata su 50 mA e seleziona Esegui esperimento per produrre una singola contrazione. Selezionare Analizza risultati per visualizzare l'uscita della coppia. Registrate la coppia di contrazione visualizzata in Forza massima con la linea di base sottratta.
   NOTA: selezionare l'opzione per invertire il canale Forza per convertire le misurazioni da coppia negativa a positiva.
2. Aumentare la corrente a 60-70 mA e ripetere l'esperimento di contrazione. Registrate la coppia di contrazione visualizzata in Forza massima con la linea di base sottratta.
3. Continua con una serie di esperimenti di contrazione in questo modo (aumentando di circa 10-20 mA ad ogni progressione) fino a quando la coppia di contrazione non aumenta più (si stabilizzano o iniziano a diminuire). Esempio di serie di contrazioni è mostrato nella Tabella 1.
4. Registrare la corrente più bassa alla quale è stata raggiunta la coppia di contrazione più elevata. Questa corrente verrà utilizzata e rimarrà costante durante il prossimo esperimento forza-frequenza. La Figura 4 mostra una contrazione di picco rappresentativa.

6. Esperimento coppia-frequenza per determinare la coppia tetanica isometrica di picco

1. Nel software (vedi Tabella dei materiali),selezionare l'esperimento di coppia-frequenza pre-programmato per l'estensione del ginocchio assicurando la seguente impostazione. Durata dello stimolo: 0,35 s, Sequenza di frequenza: 10 Hz, 40 Hz, 120 Hz, 150 Hz, 180 Hz, 200 Hz, Periodo di riposo tra impulsi/contrazioni: 120 s
   NOTA: la frequenza di campionamento è 10.000 Hz (impostazione predefinita).
2. Esegui esperimento, analizza i risultatie registra manualmente la coppia visualizzata in Forza massima con la linea di base sottratta (assicurati che il canale di forza sia invertito, poiché la contrazione dell'estensore del ginocchio produrrà una coppia negativa) a ciascuna frequenza. Notate il valore di forza massima più alto come coppia tetanica isometrica di picco. Esempi di dati sulla frequenza di coppia sono mostrati nella Tabella 2 e la Figura 5 mostra una curva del tetano rappresentativa per la coppia teonica isometrica di picco raggiunta a 120 Hz.

7. Conclusione dell'esperimento

1. Al termine dell'esperimento di coppia-frequenza, eseguire una contrazione di follow-up e confrontarla con la contrazione di picco iniziale alla stessa corrente per valutare danni / affaticamento.
   NOTA: In alcuni modelli di lesioni e malattie, si prevede un aumento della fatigability del muscolo scheletrico e non costituisce un problema con la configurazione sperimentale o il topo.
2. Una volta completate tutte le misurazioni della coppia, rimuovere delicatamente le sonde degli elettrodi e scollecare il ginocchio.
3. Spegnere l'isoflurano e rimuovere il mouse dal cono del naso.
4. Riposita il mouse in una gabbia appropriata posizionata sopra un cuscinetto riscaldante. Monitora mentre il mouse si riprende e riprende conoscenza.
   NOTA: il mouse deve essere cosciente e muoversi entro 2-3 minuti.

8. Analisi dei dati

1. Estrarre i dati dopo l'esperimento dal software di analisi (vedi Tabella dei materiali).
   1. Software di analisi aperto.
   2. Seleziona Ottieni dati dal software.
   3. Selezionare Data in cui è stato eseguito l'esperimento e il codice del mouse appropriato.
   4. Seleziona la frequenza di interesse (verranno elencati tutti gli esperimenti di contrazione e ogni frequenza dell'esperimento coppia-frequenza).
   5. Selezionare Analisi muscolare.
   6. Verificare che l'opzione Usa correzione baseline sia selezionata.
      NOTA: la coppia di base viene calcolata dal software come media dei primi 100 punti campionati e sottratti dal valore di coppia massima assoluta.
   7. Registrare il valore di coppia elencato in Massimo.
      NOTA: i dati qui presentati non sono filtrati; tuttavia, è possibile selezionare un filtro nel software, se lo si desidera.
2. In alternativa, come descritto sopra al punto 6.2, registrare manualmente l'uscita di coppia visualizzata in Forza massima in tempo reale in ogni punto/contrazione di coppia-frequenza attraverso la finestra Analizza risultati.
   1. Verificare che la linea di base sia sottratta e che il canale di forza sia invertito.
   2. Inserire i dati in un foglio di calcolo per i calcoli di normalizzazione del peso corporeo (coppia / peso corporeo in grammi) e analisi grafiche e statistiche di interesse. Il software statistico è stato utilizzato allo scopo di rappresentare graficamente le curve coppia-frequenza e calcolare l'area sotto la curva.
      NOTA: i dati di coppia sono misurati in mN.m (milliNewton.meters).
3. Per generare curve di tetano, esporta i dati completi da ogni frequenza dal software di analisi.
   1. Ripetere i passaggi 8.1.1-8.1.4 precedenti.
   2. Seleziona Esporta dati.
   3. Selezionare Dati filtrati non elaborati e salvarli nella posizione scelta. MATLAB può essere utilizzato per generare curve di tetano dal file di testo esportato e/o per ulteriori analisi.
      NOTA: il codice MATLAB per generare la curva del tetano dal file di testo è disponibile su richiesta.

9. Calibrazione del sistema a leva a doppia modalità

1. Calibrare il sistema prima dell'uso iniziale per garantire dati accurati e affidabili e ripetere periodicamente la calibrazione utilizzando il software di raccolta dati e i pesi noti.
   1. Software di raccolta dati aperto.
   2. Fare clic sulla scheda Configurazione e selezionare Configurazione canale.
   3. Selezionare 305C-FP elencato in I miei strumenti.
   4. Fare clic su Calibra selezionati per aprire la finestra Editor calibrazione.
   5. Per calibrare la lunghezza, immettere una serie di tensioni di prova, comprese le tensioni sia negative che positive (ad esempio, -3, -2, -1, 0, 1, 2, 3 V).
      1. Fare clic su Imposta per la prima riga.
      2. Fare clic su Leggi.
      3. Misurare la lunghezza esatta del braccio della leva in millimetri e inserire nella scatola corrispondente.
      4. Ripetere l'operazione per la tensione successiva.
      5. Dopo aver registrato tutte le tensioni, fare clic su Calcola fattori Cal (registrati in mm/volt).
   6. Per calibrare la forza in entrata, utilizzare una serie di pesi noti che aumentano in una progressione lineare.
      1. Regolare il motore in modo che sia appoggiato sul bordo della panca o del tavolo con il braccio della leva parallelo al piano di lavoro e appeso sopra il bordo per consentire al peso di appendere.
      2. Appendere il primo peso al braccio della leva usando un elastico. In Forza applicata, inserisci il peso noto in grammi tenendo conto della massa dell'elastico.
      3. Seleziona Leggi.
      4. Ripetere per almeno 3 pesi noti.
      5. Selezionare Calcola fattore Cal.
      6. Per verificare il calcolo, tracciate i dati di calibrazione e l'adattamento della curva selezionando Plot Cal.
   7. Per calibrare la forza in uscita, immettere le tensioni di calibrazione (fino a 10 volt)
      1. Fare clic su Imposta direttamente accanto alla tensione di calibrazione.
      2. Ripetere l'operazione per ogni linea di tensione.
      3. Applicare delicatamente una pressione sul braccio della leva usando un dito fino a quando il Force Out cessa di cambiare e il braccio del motore inizia a muoversi.
      4. Mantieni questa posizione. Seleziona Leggi.
      5. Ripetere l'operazione per ogni linea di tensione.
      6. Selezionare Calcola fattore Cal.

Risultati

La curva coppia-frequenza utilizza frequenze più basse per produrre più contrazioni isometriche isolate di coppia relativamente bassa e progredisce attraverso frequenze sempre più alte, con conseguente fusione di contrazioni per una contrazione isometrica del tetano a cui si ottiene la coppia tetanica di picco. Il protocollo presentato per l'estensione del ginocchio picco di coppia tetanica la curva forza-frequenza inizia a 10 Hz che provoca 3 contrazioni isolate. La fusione parziale delle contrazioni avviene a 40 Hz e la coppia tetanica di picco viene raggiunta tra 120-180 Hz (Figura 5).

La Figura 6 illustra le curve rappresentative di coppia-frequenza di estensione del ginocchio da topi C57BL/6 femmina. Tre topi separati sono stati testati al basale e l'esperimento è stato ripetuto in ciascun topo 2 settimane dopo per il confronto per valutare la riproducibilità. Le curve coppia-frequenza sono mostrate con valori di coppia grezzi (Figura 6A), così come valori di coppia grezzi normalizzati al peso corporeo del mouse (Figura 6B). Osservazioni ripetute dimostrano risultati comparabili in tutti e 3 i topi con un periodo di riposo di 2 settimane tra gli esperimenti. I dati di coppia normalizzati del peso corporeo dovrebbero essere considerati in aggiunta alla coppia grezza, poiché una piccola fluttuazione del peso può influire sulla potenza funzionale e non è considerata con la sola coppia grezza. Inoltre, i dati di coppia normalizzati del peso corporeo facilitano il confronto di topi di varie dimensioni. La coppia può anche essere normalizzata al peso umido muscolare o all'area della sezione trasversale della miofibra, come abbiamo precedentemente mostrato¹⁶.

La Figura 7A mostra l'area sotto la curva utilizzando i dati di coppia isometrica normalizzati del peso corporeo da esperimenti completi di coppia-frequenza (10 Hz, 40 Hz, 120 Hz, 150 Hz, 180 Hz, 200 Hz) per 4 mouse C57BL/6 separati, evidenziando una coppia totale simile e coefficienti di variazione tra il 5,6% e l'8,8% con esperimenti ripetuti all'interno degli stessi topi. I dati sono riportati più semplicemente come coppia tetanica di picco (Figura 7B) che è il valore massimo di coppia dalle contrazioni isometriche ripetute del tetano da 120-200 Hz. La coppia tetanica di picco è comparabile nei topi C57BL/6 femmina di 6-8 mesi (Figura 7B) con coefficienti di variazione tra il 4,8% e l'8,7% con valutazione longitudinale all'interno degli stessi topi. La coppia tetanica di picco è più paragonabile alla valutazione della forza gold standard negli studi sull'uomo: massima toque isometrica.

Inoltre, il protocollo di coppia tetanica di picco dell'estensore del ginocchio è uno strumento utile per rilevare le differenze di forza in più modelli di mouse. La Figura 8 mostra il netto contrasto tra la forza estensore del ginocchio in un topo femmina C57BL/6 non ferito e sano di 6 mesi (linea nera) e un modello murino transgenico di ipertrofia soprafisiologica in cui la miostatina / GDF8 viene eliminata (linea blu). Mostriamo anche una curva del tetano di picco da un topo C57BL / 6 7 giorni dopo la trasezione chirurgica del legamento crociato anteriore (ACL-T) (linea rossa), dimostrando un calo di quasi il 50% della coppia di picco dopo l'infortunio che è ben al di fuori dei coefficienti di variazione osservati con test ripetuti di topi illesi. In concomitanza con i dati umani^17,18,la forza è marcatamente diminuita con ACL-T. Tutti i topi sono femmine e di età simile (6-8 mesi).

Esperimento Twitch	Amperaggio/Corrente (mA)	Coppia (mN•m)
1	50	1.279
2	70	1.341
3	90	1.36
4	110	1.362
5	*130	1.449
6	150	1.436
7	140	1.333

Tabella 1: Esempio di serie twitch. * denota amperaggio/corrente ottimale.

Frequenza (Hz)	Coppia (mN•m)
10	1.385
40	1.869
120	*18.765
150	18.375
180	17.97
200	17.548

Tabella 2: Esempio di dati della curva coppia-frequenza. * denota il picco di coppia tetanica.

Figura 1: Configurazione del software di raccolta dati. Illustrazione della configurazione per il software di raccolta dati con Live Data Monitor. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Configurazione del mouse e posizionamento dell'elettrodo. (A-B) Posizione supina del topo che riceve l'anestesia tramite un cono nasale sulla piattaforma riscaldata. L'arto posteriore superiore è saldamente bloccato, posteriormente al ginocchio per consentire un movimento illimitato nell'articolazione del ginocchio. Il braccio motore è regolato in modo che il ginocchio sia piegato a circa 60°. Il punto motorio del nervo femorale viene stimolato da elettrodi ad ago per attivare la contrazione degli estensori del ginocchio. La configurazione del mouse viene visualizzata da una vista laterale (A) e dalla vista dall'alto (B). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Determinazione del posizionamento ottimale dell'elettrodo per ottenere l'estensione isometrica del ginocchio. Rappresentazione di contrazioni negative ripetute stimolate con 50 mA utilizzando la funzione di stimolazione istantanea e visualizzate nel Live Data Monitor. Le frecce rosse indicano le prime tre contrazioni di estensione del ginocchio. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Contrazione rappresentativa per determinare l'amperaggio ottimale. L'amperaggio più basso per suscitare la coppia isometrica di contrazione più alta deve essere determinato per l'esperimento forza-frequenza mediante ripetuti esperimenti di contrazione con amperaggio progressivamente aumentato. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Curve di coppia tetanica rappresentative in un esperimento di coppia-frequenza per lo stesso mouse. (A) Coppia tetanica isometrica submassimale prodotta a 10 Hz. (B) Coppia tetaria isometrica submassimale a 40 Hz. (C) Coppia tetonica isometrica di picco a 120 Hz. (D) Coppia tetanica isometrica a 150 Hz. (E) Coppia tetanica isometrica a 180 Hz. (F) Coppia tetanica isometrica a 200 Hz. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: Dati rappresentativi della curva coppia-frequenza. (A-B). Curva coppia-frequenza in 2 diversi timepoint (settimana 1 e 3) in 3 mouse separati, presentati come coppia di picco grezza(A)e coppia di picco grezza normalizzata al peso corporeo(B). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 7: Area rappresentativa sotto la curva (AUC) e dati di coppia tetanica di picco. (A) AUC per 4 topi separati, presentati come coppia grezza normalizzata al peso corporeo. (B) Coppia tetanica di picco per gli stessi 4 topi, presentata come coppia tetanica di picco grezza normalizzata al peso corporeo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 8: Coppia tetanica di picco degli estensori del ginocchio in più modelli murini. Curve rappresentative del tetano di coppia di picco per un modello murino transgenico ipertrofia conclamato (GDF8 KO), un topo C57BL/6 sano illeso (topo 2) e un topo C57BL/6 7 giorni dopo la trasezione del legamento crociato anteriore (ACL-T). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura supplementare 1: Dimensioni della plastica fabbricata su misura. L'inserto in rosso mostra la dimensione della profondità. Fare clic qui per scaricare questo file.

Video supplementare 1: Contrazione dell'estensore del ginocchio in tempo reale senza braccio motore. Clicca qui per scaricare questo video. 

Video supplementare 2: Contrazione estensore del ginocchio al rallentatore senza braccio motore. Clicca qui per scaricare questo video. 

Discussione

La misurazione e l'analisi della funzione muscolare nei modelli di roditori è indispensabile per fare inferenze traslazionali e significative riguardanti gli adattamenti istologici e molecolari del muscolo scheletrico osservati con esercizio, lesioni, malattie e trattamenti terapeutici. Dimostriamo un metodo per valutare la forza massima dell'estensore del ginocchio in modo affidabile e ripetuto nei topi utilizzando attrezzature disponibili in commercio, con il pezzo di plastica regolabile per tenere l'arto posteriore inferiore sulla tibia anteriore che è l'unica parte fabbricata su misura che può essere replicata.

Strumenti di valutazione funzionale comuni sono stati ampiamente utilizzati per valutare ripetutamente le prestazioni fisiche all'interno dello stesso mouse, come il tapis roulant che corre verso l'affaticamento volontario, il test delle prestazioni del rotarod, il test di aderenza invertita e il test di resistenza della presa. Tuttavia, sebbene informative, queste valutazioni coinvolgono componenti cardiopolmonari e comportamentali, che possono offuscare l'interrogazione della funzione neuromuscolare associata a queste misure delle prestazioni fisiche. Inoltre, elementi di resistenza, coordinazione ed equilibrio sono presenti in molte di queste valutazioni funzionali a vari livelli, limitando una chiara interpretazione relativa alla forza muscolare. La capacità di produrre forza dei muscoli dei roditori può essere misurata in vitro, in situ o in vivo. Ogni approccio presenta vantaggi e limitazioni relativi. In particolare, con la valutazione in vitro, il muscolo viene completamente isolato e rimosso dal corpo dell'animale in modo che non vi sia alcuna influenza dalla perfusione o dall'innervazione¹⁹. Ciò produce un ambiente ben controllato per accertare la capacità contrattile, ma limita le dimensioni del muscolo studiato attraverso la dipendenza dalla diffusione passiva di ossigeno e sostanze nutritive durante il test. Il test in situ mantiene l'innervazione e l'afflusso di sangue del muscolo, ma è limitato a una valutazione terminale singolare, come con il test in vitro²⁰. Infine, il test in vivo è il meno invasivo con il muscolo che rimane nel suo ambiente nativo con elettrodi percutanei inseriti vicino al nervo motorio per stimolare elettricamente il muscolo. Un punto di forza dell'approccio in vivo è il potenziale per i test longitudinali nel tempo^21,22,23.

La valutazione in vivo della contrattilità muscolare di picco misura in modo ottimale la forza massima poiché la normale anatomia e fisiologia del topo rimane intatta e il metodo può essere ripetuto sullo stesso topo prima e dopo un intervento o per tutta la durata della vita. In particolare, la misurazione in vivo della forza estensore del ginocchio nei topi è la valutazione della forza murina con la maggiore rilevanza traslazionale per gli studi sull'uomo, poiché la coppia massima di estensione del ginocchio è comunemente misurata e considerata il test di forza gold standard negli esseri umani con correlazione a vari risultati funzionali e di salute^24,25,26,27 . Inoltre, la patologia estensore del ginocchio è osservata con l'invecchiamento e una miriade di lesioni e malattie^1,2,4,5,6, ma la valutazione dell'impatto di queste condizioni sulla forza estensore del ginocchio longitudinalmente nei topi non è stata facilmente raggiungibile.

Sebbene questo metodo offra utilità per determinare la coppia di picco dell'estensore del ginocchio in modo longitudinale, è necessario considerare alcune limitazioni del protocollo. Le frequenze più basse tra 40 Hz e 120 Hz sono state omesse dal protocollo coppia-frequenza, che può limitare la capacità di rilevare spostamenti a sinistra o a destra nella curva coppia-frequenza con lesioni o malattie. Tuttavia, utilizzando questo protocollo coppia-frequenza, siamo stati in grado di rilevare alterazioni della coppia tetanica di picco in un modello di lesione ACL e tra topi wild type C56BL/6 e un modello murino transgenico di massa muscolare soprafisiologica (Figura 8). Notiamo che può essere utile fissare gli elettrodi con mani che aiutano o apparecchi simili poiché le contrazioni muscolari possono spostare leggermente gli elettrodi. Non abbiamo notato alcun evidente spostamento di elettrodi con contrazioni progressive; tuttavia, non può essere esclusa la possibilità di un leggero movimento degli elettrodi, che può influire sulla stimolazione muscolare. Inoltre, l'elettromiografia intramuscolare (EMG) non è stata eseguita in combinazione con il protocollo di stimolo; tuttavia, l'inclusione di misure EMG può essere fattibile, se lo si desidera e appropriato per il modello sperimentale di interesse.

La valutazione della forza estensore del ginocchio in modelli murini di lesioni e malattie ortopediche faciliterà la ricerca pre-clinica con una significativa rilevanza traslazionale per le misure di forza clinica. Il nostro protocollo consente una valutazione precisa e ripetuta della massima resistenza estensore del ginocchio nei topi con apparecchiature disponibili in commercio accessibili a qualsiasi laboratorio.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1300A: 3-in-1 Whole Animal System- Mouse	Aurora Scientific Incorporated	300D-305C-FP: dual-mode motor with custom knee extension apparatus, 605A: Dynamic Muscle Data Acquisition and Analysis System, 701C: Electrical Stimulator, 809C: in-situ Mouse Apparatus
6100 Dynamic Muscle Control LabBook software	Aurora Scientific Incorporated	DMC v6.000
611A Dynamic Muscle Analysis	Aurora Scientific Incorporated	DMA v5.501
BravMini hair clippers	Wahl Clipper Corporation	ASIN: B00IN24ILE
Eye Lube	Optixcare	Item Number: 142422
Isoflurane	Covetrus	NDC: 11695-6777-2
V-1 Tabletop Laboratory Animal Anesthesia System	VetEquip Inhalation Anesthesia Systems	Item Number: 901806
Prism 8	GraphPad Software, LLC	Version 8.3.0 (328)