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摘要

本文提出了一个小规模的等离子膜隔离协议，用于描述在糖浆中过度表达的念珠菌ABC（ATP结合盒式）蛋白质Cdr1。 蛋白酶可切割的 C 端 mGFPHis 双标签，Cdr1 和标签之间有 16 残留链接器，旨在促进 Cdr1 的净化和洗涤剂筛选。

摘要

ABC运输机的生化和生物物理特征的成功在很大程度上取决于异质表达系统的选择。在过去的二十年里，我们开发了一个酵母膜蛋白表达平台，用于研究许多重要的真菌膜蛋白。表达宿主 Saccharomyces cerevisiae AD+在七个主要的内源ABC转运器中被删除，它包含转录因子Pdr1-3与功能增益突变，使异质膜蛋白基因的构成过度表达稳定地整合为基因组 PDR5 位点的单拷贝。多功能质粒载体的创建和单步克隆策略的优化使异种ABC运输机能够快速准确地进行克隆、突变和表达。在这里，我们描述了一个新的蛋白酶可切割mGFPHis双标签（即单体酵母增强绿色荧光蛋白yEGFP3融合到六希丁亲和纯化标签）的发展和使用，旨在避免标签可能干扰感兴趣的蛋白质，并提高他的标签对镍亲和力树脂的结合效率。mGFPHis 与膜蛋白 ORF（开放读取框架）的融合，通过检测聚丙烯酰胺凝胶和检测保留 mGFPHis 标签的降解产品，可以轻松量化蛋白质。我们演示了此功能如何促进膜蛋白溶化的洗涤剂筛选。介绍了一个协议，高效，快速和可靠的隔离小规模等离子膜制剂的C终端标签 念珠菌 多药废水运输机Cdr1过度表达在 S.塞雷维西亚 AD+，提出了。这种小规模等离子膜隔离协议可在一个工作日内生成高质量的等离子膜。等离子膜制剂可用于确定Cdr1和Cdr1突变变异的酶活动。

引言

从原生脂质环境中提取整体膜蛋白会显著影响其结构和功能1、2、3、4。生物膜5的复杂脂质组成确保了至关重要的蛋白质-脂质相互作用可能发生6。脂质保持膜蛋白的结构完整性，从而使它们能够在膜室目标7，8正确运作。因此，膜蛋白纯化的关键第一步是从其原生环境中提取蛋白质，而不影响其结构和/或功能。

膜蛋白的结构存在许多障碍，其中大多数与膜蛋白的疏水性质有关，难以以X射线晶体学或低温电子显微镜（Cryo-EM）9、10、11、12所需的数量表达适当折叠和功能膜蛋白。膜蛋白表达系统有三种类型:同源性9、异质13、14、15和体外表达系统16、17。许多表达系统的表达水平往往很低，或成本过高，因此只有少数宿主成为生产膜蛋白的首选。它们包括细菌宿主，大肠杆菌，酵母S.塞雷维西亚和皮希亚面食，和更高的真核生物，如Sf9昆虫细胞或哺乳动物细胞系18。所有膜蛋白表达技术各有优缺点:然而，S.Cerevisiae也许是研究得最好的真核模型有机体，适合膜蛋白的生产。它具有高度多功能性，在基因工程、药物发现、合成生物学和真核膜蛋白14、19、20、21的表达方面具有很强的应用性。

在这项研究中，使用了一项获得专利的S.cerevisiae膜蛋白表达技术21，以S.Cerevisiae AD+14和AD+22为首选宿主（图1A），以过度表达和研究主要的C.藻类多药排泄泵Cdr1。S. cerevisiae菌株均为 AD1-8u-23的衍生物，具有ura3 （AD+） 或ura3及其1 （AD+） 基因，以消除任何通过URA3或HIS1基因组洛奇的不需要整合产生的假阳性尿素或组织丁原体转化剂。图1A中指出的7种主要多药排泄物泵23的删除，使得AD+对大多数异种生物非常敏感。功能增益突变转录因子Pdr1-3通过两个同源重组事件整合了基因组PDR5点的异质-ORF转化盒（图1A）后，导致Cdr1（图1A中的红色八角形）等异质膜蛋白的构成过度表达。C-终端mGFPHis标记蛋白的适当等离子膜定位可以通过共聚焦显微镜（图1A）确认，他的标签可用于标记蛋白质的镍亲和纯化。然而，将一些真菌ABC运输机（例如，坎迪达·克鲁塞ABC1）克隆成pABC3衍生质粒是不可能的，因为它们由于细胞毒性而无法在大肠杆菌中传播。这促使膜蛋白14、24的单步克隆的发展，这些蛋白在N-或C终点站被标记为具有各种亲和力、表位或记者标签，直接进入S.Cerevisiae AD+（图1C）。塞雷维西亚AD+菌株过度表达各种CDR1突变体也可以有效地创建这种方式，使用多达5个单独的PCR片段重叠25个基点（图1C）。利用此协议，许多感兴趣的ORF可以在很短的时间内以低成本和高效率进行克隆、表达和定性。每增加一个 PCR 片段，转化效率只会降低 ±2 倍。 

如果需要，表达水平也可以很容易地通过入门设计操纵，以可预测地将表达水平调低到通常高，构成表达水平25的0.1%-50%之间。优化的，多功能的， pABC314衍生克隆载体， pABC3 - XLmGFPHis26 （图 1B）包含一个 HRV - 3C 蛋白酶位点（ X :列夫夫克|GP），一种蛋白酶，在4°C下表现优于常用的烟草蚀刻病毒（TEV）蛋白酶27。L是一种五氨基酸（GSGGS）链接器，mGFP是一种单体突变体（A206K）28、29版酵母增强绿荧光蛋白变异yEGFP33 30，而他的是一个三氨基酸连结剂（GGS），其次是六异丁（HHHHH）镍亲和蛋白纯化标签。

这种表达技术已成功地应用于药物发现和膜蛋白的研究。真菌偶佐尔药物靶点的第一个结构，S.塞雷维西亚Erg1131，是利用这项技术解决的。它还使C.藻类Cdr132，33，34的详细特征和创建一个赛斯坦缺乏Cdr1分子35适合赛尔坦交叉链接研究，以验证任何未来的高分辨率结构。许多其他ABC运输机从主要的人类真菌病原体（即， C. 阿尔比肯斯，坎迪达格拉布拉塔，坎迪达奥里斯，坎迪达克鲁塞，坎迪达使用，隐球菌新福尔曼斯，阿斯珀吉卢斯富米加图斯，青霉素马内菲，和富萨里姆索拉尼物种复合体）也已使用这个表达平台24，36，37，38，39详细研究。这使得在高通量屏幕上使用的S.cerevisiae菌株的面板能够过度表达的污水泵，从而发现新型荧光浮流泵基材尼罗河红色40和特异性41和广谱14、33、42、43、44 efflux泵抑制剂。该系统的使用也使发现木糖线作为同类广谱真菌多药排泄泵抑制剂42。

膜蛋白的完全溶化和创建无内源脂质的同质膜蛋白-鼠类制剂，需要高洗涤剂浓度45。但不幸的是，这也经常灭活膜蛋白5，8，45，46。洗涤剂单体的特性和溶液中的聚合受疏水尾部的物理特性、烷基链的长度和分支、芳香核或氟烷基侧链的存在或聚氧乙烯单元的数量的影响。因此，洗涤剂筛选是确定最适合膜蛋白溶解和纯化的洗涤剂的重要第一步。

C.藻类是人体免疫功能低下的主要真菌病原体，可引起严重、危及生命的侵入性感染47种，可对偶祖抗真菌药物产生抗药性48、49。C.藻类耐多药性的主要机制之一是Cdr150的过度表达，这是位于等离子膜中的ABCG亚家庭II型ATP绑定盒式（ABC）运输机51。全尺寸真菌 ABCG 运输机（由两个核苷酸结合域 [NBD] 和两个跨膜域 [TMD] 组成） 更通常被称为全热带耐药性 （PDR） 运输机，其特点是其独特的倒置域拓扑 [NBD-TMD]2.PDR运输机只在植物52，53和真菌54发现。尽管PDR运输机的重要性，没有结构，虽然结构为人类半尺寸ABG运输机最近已经解决，这有助于创造Cdr133的第一个试探性模型。然而，我们最近的实验证据表明，这种模型存在缺陷，可能是因为真菌PDR运输机具有特有的不对称性NBD，很可能形成一种独特的运输机制。因此，Cdr1 的高分辨率结构既需要合理设计有助于克服以埃夫卢斯为媒介的耐药性的新颖的 efflux 泵抑制剂，又需要深入了解这一重要的 ABC 运输机系列的行动机制。

本研究的目的是为转基因 的S.Cerevisiae 表达宿主的Cdr1表达、溶解和纯化制定可靠的协议，最终目的是为Cdr1获得高分辨率结构。作为此过程的一部分，一个蛋白酶可切割的 mGFPHis 双标签 （图 1B）设计与 16 残渣链接器分离标签从 Cdr1 的 C 总站， 这改善了附加的 6x 他的亲和力标签与镍亲和树脂的结合， 并使监测 Cdr1 表达水平在活细胞和整个净化过程中.还开发了含有约 10%C.藻类 Cdr1（根据SDS-PAGE之后库马西染色估计）的小规模酵母血浆膜蛋白制剂的可重复协议，可用于Cdr1的生化表征。

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研究方案

1. 准备新鲜或冷冻的转化库存，使AD+和AD+细胞具有能力

  1. 接种 25 mL 的 2 倍 Ypcd [即 2 倍 Ypd; 2% （w/v） 酵母提取物， 2% （w/v） 丙酮， 4% （w/v） 德克斯特罗斯）， 0.079% （w/v） CSM （完全补充混合物）]35 介质与单个酵母菌落和孵育过夜 （o/n） 16 小时在 30 °C 与摇晃在 200 转每分钟 （rpm）.。
  2. 接种 225 mL 的 2x YPCD 介质与 25 mL o/n 培养，并检查细胞光学密度在 600 nm （OD600）:OD600 通常是 +0.5-1.0。
    注:在此阶段，请确保以下转换实验所需的所有材料都随时可用。
  3. 在 30 °C 下将培养体再生长 6-8 小时，在 200 rpm 时摇晃，直到细胞密度达到OD 600 +6-8。
    注:除非另有说明，否则以下步骤在室温 （RT） 下执行。
  4. 以 3，000 x g 的离心法收获这些对数相细胞，使用 3 分钟。
  5. 重新使用无菌双蒸馏水（ddH2O;即200 mL，然后是20ml）清洗细胞两次。
  6. 以 3，000 x g 的采收细胞 3 分钟。
  7. 慢慢地（即，每分钟添加30个等量的冷冻合格细胞（FCC）溶液，30分钟）将细胞颗粒重新用于FCC的X mL [5%（w/v）甘油， 10% （v/v） 二甲基硫氧化物 （DMSO）] 在冰上 （其中 X = OD600;例如， 如果 OD600 = 6 重吸在 6 毫升， 或者如果 OD600 = 3 重吸在 3 毫升） 。
    注:正确的 FCC 组合对于转型成功至关重要。
  8. 在转化前将细胞放在冰上 2 小时，或在 -80 °C 下储存阿利库特，直到需要为止。
    注意:AD+和AD+细胞对冷冻非常敏感。因此，细胞必须慢慢冷却到-80°C:将含有50-600微L细胞的冰冷微中心管放入塑料储物盒（RT）中。将盒子放在一个较大的聚苯乙烯容器 （RT） 中，并用合适的聚苯乙烯盖关闭容器。然后，将容器放入 -80 °C 冰柜中。
    警告:缓慢冷冻对细胞存活至关重要。

2. 与CACDR1-XLmGFPHis的AD+和AD+的转化，以及通过菌落PCR和DNA测序确认正确的转化剂

注:Plasmid pABC3-CDR1-mGFPHis 是使用传统克隆策略创建的，详细描述在 Lamping 等人，2010年 55，并图1B中说明。野生型C.藻类CDR1被分离为PacI/不是我碎片从质粒pABC3-CACDR1A-GFP14和克隆成pABC3-XLmGFPHis26。

  1. PCR 放大整个CDR1转换盒式磁带，使用高保真DNA聚合酶和底漆对 PDR5 亲/PDR5-ter35使用 1-10 ng pABC3-CACDR1-XLmGFPHis 作为 DNA 模板或， 或者，消化 2 μg 的 pABC3-CACDR1-XLmgFPHis 完成与 10 U 限制酶AscI 在 37 °C （图 1A，B）.
    注 :CDR1 转换盒式磁带（图1A）包括 PDR5 发起人 - CACDR1-mGFPHis - PGK1 终结者 - URA3 选择标记 - PDR5 下游区域。
  2. 执行玫瑰凝胶电泳和凝胶提取 +8 kb 转换盒式磁带。
    注:凝胶净化 +8 kb CaCDR1 转换盒式磁带可去除任何可能未消化的质粒 DNA，这可能导致具有整个质粒的不正确的变压器，而不是集成在基因组 PDR5 位置的线性转化盒式磁带。
  3. 在沸水中洗澡10分钟，在冰上保持10分钟，使所需的鲑鱼精子携带DNA（2毫克/毫升;10mM Tris，1mM EDTA;pH 7.5）变性。使用螺丝盖管煮鲑鱼精子DNA，以避免打开盖子。
  4. 将 50 μL 的变性鲑鱼精子 DNA 与 14 μL 的转化盒式磁带（500-2，000 ng）混合，并将 64 μL 的 DNA 混合物保留在冰上，直至进一步使用。
    注:使用10 ng大肠杆菌-酵母梭质粒（如pYES2）作为正变换控制（图2B）。
  5. 在 30 °C 的水浴中，重新使用新鲜或冷冻的合格细胞快速解冻 5 分钟，并将它们分成 1.5 mL 微中心管中的 50 微升小块。
  6. 以离心的方式在微富中以最大速度（18，000 x g）收获细胞1分钟。
  7. 取出超高纳特，将细胞颗粒保留在RT。
  8. 对于每次转换，通过重复管道将 296 μL 组合 （RT） 混合到 260 μL 的 50% （w/v） 聚乙烯乙二醇 （PEG 3350） 和 36 μL 的 1 M 醋酸锂 （LiAc） 中，并加入适当的 64 μL 冰冷 DNA 混合物。
  9. 立即将适当的混合物添加到 50 μL 称职的细胞颗粒阿利库特中。
  10. 通过彻底涡旋约 30s，在 PEG-LiAc-DNA 混合物的 360 μL 中重新吸收细胞颗粒。
  11. 将细胞混合物在 30 °C 的水浴中孵育 1 小时。
    注意:AD+和AD+细胞在30°C时比在42°C35时转换得更好。
  12. 以 18，000 x g 的 10s 收获细胞。丢弃超高分子，在 ddH2O 的 80 μL 中重新使用细胞颗粒。
  13. 将细胞扩散到CSM-URA琼脂板35[ 即0.67%（w/v）酵母氮碱，无氨基酸，0.077%（w/v）CSM减去尿素，2%（w/v）葡萄糖和2%（w/v）琼脂]。
  14. 在 30 °C 下孵育板 2-3 天，直到尿素原营养变异剂清晰可见。
    注:预计每 μg 线性 +8 kb CaCDR1 转换盒式磁带的 100 个变压器和每 μg pYES2 的 +4 x4 变压器。
  15. 挑选五种独立的变压剂，并将其铺在新鲜的CSM-URA板上，将尿素原体变压剂与未转化宿主细胞的残余物分离。
  16. 通过在 YPG-agar 板上种植变压剂 [1% （w/v） 酵母提取物、2% （w/v） peptone、2% （v/v） 甘油和 2% （w/v） agar] （图 2D）来去除任何可能娇小的突变体。
    注:小突变体有缺陷的线粒体，因此不能在不可发酵的碳源上生长。它们在 塞雷维西亚56中很常见。 塞雷维西亚 AD+ 和 AD+ 特别容易获得娇小的表型。
  17. 执行酵母菌落PCR，并确认至少三个独立的变压剂被正确集成到基因组 PDR5 蝗虫（图1C）通过放大整个+8 kb CaCDR1 转换盒与特定的DNA聚合酶，优化放大PCR产品从不纯的DNA模板来源。使用一组在集成站点外绑定的引物和从单个菌落中提取的 1 μL 细胞悬浮物（在 ddH2O 中）作为 DNA 模板。
    注:这种特殊的DNA聚合酶可靠地放大了从完整的酵母细胞中提取的+8kb PCR片段。但是，要进行可靠的放大，需要 45 个 PCR 周期，酵母细胞必须在 DDH2O 中的 OD600 1-10 中重用。
  18. 通过 PCR 反应 1 μL 部分的 DNA 阿加罗斯凝胶电泳确认正确的 +8 kb PCR 放大产品。
  19. 在使用经过处理的 DNA 样本的一部分使用适当的引物对整个 ORF 进行测序之前，根据制造商的说明，用单链 DNA 外阴道酶和磷酸酶的酶混合物从 PCR 反应的 10 μL 部分中取出多余的放大引物。

3. 小尺度酵母血浆膜分离协议

  1. 生长酵母细胞
    1. 在 30 °C 的 YPD 10 mL 中预先培养一个酵母菌群，在 7 -8 小时时，在 200 rpm 时摇晃。
    2. 用 10 mL 预培养接种 40 mL 的 YPD 介质，并在 30 °C o/n （+16 h） 下孵育细胞，在 200 rpm 时摇晃，直到细胞密度达到 OD600 的 1-3。
  2. 收获酵母细胞
    1. 在 4，200 x g的对数相单元（ODU; 例如，OD600的 1 × 1 ODU）中收获 1 mL，在 4 °C 下收获 5 分钟。
    2. 用冰冷无菌 ddH2O（即 40 mL，然后是 1 mL）两次重复和清洗细胞;在 4，200 x g 的台阶之间以 4，200 x g 在 4 °C 下以 5 分钟采集细胞。"
    3. 将颗粒重新沉积在 1 mL 的冰冷无菌 ddH2O 中，并将细胞悬浮液转移到预冷却（冰上）1.5 mL 微中心管中。
    4. 在 4 °C 下以 3，300 x g 为 3 分钟收获细胞。
    5. 吸气超人。
    6. 将细胞颗粒重新用于 0.5 mL 均质缓冲器 [HB;50 mM Tris， 0.5 m EDTA， 20% （v/v） 甘油; pH 7.5] 新鲜补充 1 mM 苯甲基硫化物 （PMSF）。
      注意:始终添加 PMSF 新鲜，因为 PMSF 在接触水中后会迅速失活。
      警告:PMSF是一种血清蛋白酶抑制剂，对组织具有极强的腐蚀性和破坏性。它可能会导致不可逆转的眼睛损伤。
    7. 将电池悬架存储在 -80 °C 或立即使用。
  3. 等离子膜的分离
    1. 如果冷冻，将冰上的细胞解冻1小时。
    2. 在 0.5 mL 电池悬架上加入直径为 0.5 mm 的冰冷硅珠，总体积达到 1 mL。
    3. 以最大震动强度打破6个漩涡周期的细胞，持续1分钟，在冰上穿插3分钟的冷却期。
    4. 用加热的手术刀刀片在管子底部打一个薄洞。
    5. 通过安装在另一个冰冷的 1.5 mL 微中心管中，通过 10 s 低速（+200 rpm）旋转将断裂的细胞同质化收集到管子底部。
      注:这确保了硅珠保留在原始管中。
    6. 在 4 °C 下将细胞同质化 5，156 x g， 以 5 分钟去除细胞碎片、未断裂的细胞和细胞核。
    7. 将 450 μL 超高分子转移到冰冷的 1.5 mL 微中心管中，并添加额外的 1 mL 冰冷 HB，并辅以新鲜 PMSF （1 mM）。
      注:此稀释步骤对于高质量等离子膜蛋白的恢复至关重要。
    8. 在 4 °C 下以 1 1 小时 1 美元收集等离子体膜，通过重复管道将等离子膜颗粒重新注入 100 μL 的 HB 中，新鲜补充 1 mM PMSF。在释放 100 μL 的 HB 和上下移液之前，用 100 μL 移液器尖端搅拌细胞颗粒，从而松开细胞颗粒，使适当的等离子膜均质化。
    9. 用与含有降压剂和洗涤剂的缓冲剂相容的蛋白质检测试剂盒测量等离子膜制剂的蛋白质浓度。
    10. 将等离子膜储存在 -80 °C 或保持在冰上立即使用。

4. 硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）

  1. 组装用于准备聚丙烯酰胺凝胶的仪器。
  2. 对于两个分离凝胶（7% 聚丙烯酰胺），混合 2.1 mL 的 40% 丙烯酰胺/双丙烯酰胺，3 mL 的 4 倍分离缓冲器 （1.5 M Tris， 0.4% 硫酸钠 [SDS] （w/v）; pH 8.8） 和 6.9 mL 的 ddH2O. 添加 8 μL 四甲基二胺 （TEMED） 和 60 μL 的 10% 渗透铵 （APS） 启动丙烯酰胺聚合。
    警告:丙烯酰胺/双丙烯酰胺毒性极强。它引起皮肤刺激，周围神经病变，是致癌物质。如果吞咽或吸入，TEMED 是有害的。如果吞咽，APS 是有害的。它会导致严重的眼部和皮肤刺激。
  3. 将这种混合物的 +4-5 mL 倒入组装的凝胶装置中，距离顶部高达 ±2 厘米。
  4. 小心地将 +1-2 mL 的 0.1% SDS 层叠加在上面，以创建平面半月板。
  5. 允许聚丙烯酰胺设置为 +60 分钟在 RT。
  6. 通过混合 0.5 mL 的 40% 丙烯酰胺/双丙烯酰胺，为两种凝胶准备堆叠凝胶混合物， 1 mL 的 4 倍堆叠缓冲器 （0.5 M Tris， 0.4% SDS （w/v）; pH 6.8） 和 6.9 mL 的 ddh2O. 添加 2 μL 的 TEMED 和 30 μL 的 10% APS，以启动丙烯酰胺的聚合。
  7. 从聚合分离凝胶中取出 0.1% SDS 层，用 ddH2O 冲洗以去除 SDS 的痕迹。
  8. 将堆叠凝胶混合到分离凝胶上。
  9. 将梳子放入堆叠凝胶中，并从梳子周围去除任何气泡。
  10. 允许堆叠凝胶设置为 +60 分钟在 RT。
  11. 取下梳子，用水冲洗凝胶槽。将凝胶放入凝胶罐中，用 1 倍运行缓冲器（24.8 m Tris、190 mglycine、0.1% SDS）将凝胶罐填充到顶部。
    注:从存储在 RT 的 10 倍缓冲库存（248 m M Tris、1.9 M 甘氨酸、1% SDS（w/v） ddH2O）中准备 1x 运行缓冲器。
  12. 混合 5-10 μL 等离子膜样品（即 10-20 μg 蛋白质），具有等量的 2 倍蛋白质加载染料 [120 mM Tris-HCl （pH 6.8）、20% 甘油、0.02% 溴酚蓝色、4% SDS、200 mM 二甲醚 （DTT）]，并立即加载到淹没在运行缓冲器中的单独凝胶槽中。
    警告: 如果吞咽， Dtt 是有害的。它会导致严重的眼部和皮肤刺激。
    注:制作 10 mL 库存 2 倍蛋白质加载染料，在 -20 °C 下储存。 不要加热混合样品，但立即将它们加载到单独的凝胶槽中，以便 GFP 标签不会变性，并且可以检测到凝胶内荧光信号。
  13. 将蛋白质分子量标记（10-245 kDa 范围）加载到单独的插槽中，以便对单个蛋白质片段进行大小估计。
  14. 在 200 V 下执行凝胶电泳，直到蓝色装载染料到达凝胶底部（通常为 45-55 分钟）。
  15. 使用凝胶成像系统检查凝胶内 GFP 荧光（激发和发射波长分别为 475-485 nm 和 520 nm）。
  16. 在凝胶内荧光成像后，在 RT 的 15 分钟内，通过在 +10-20 mL 蛋白凝胶固定溶液（40% 乙醇、10% 醋酸）中温和搅拌凝胶来修复蛋白质。
  17. 用 10 mL 的 ddH2O 冲洗凝胶两次 10 分钟，并将凝胶放入 10 mL 胶体库马西污渍溶液中，在 RT 轻轻摇晃 1 小时，可视化蛋白质带。
  18. 为了改善蛋白质带的可视化，在与凝胶成像系统记录图像之前，先用 ddH2O 的 ±20 mL 将凝胶除污一次或两次，然后再进行 +1 h 的记录。

5. Cdr1 ATPase 活动57 的确定

  1. 稀释血浆膜样品>2.2毫克/mL至1-2毫克/mL在HB。
  2. 均衡ATPase检测鸡尾酒（75mM MES-Tris，75mM硝酸钾， 0.3 mM 铵甲酸酯，7.5 mM 钠阿齐德;pH 7.5） 和 Mg-ATP（28.8 mM ATP 二恶英盐，28.8 mM MgCl2;pH7.0）至 30°C 在 30°C 孵化器中。
    警告:阿齐德钠是剧毒的。
    注:确保所有缓冲库存和瓶装无磷酸盐:即，用 1% （vol/vol） HCl 清洗玻璃器皿，然后用 ddH2O 冲洗几次。此外，将其与其他可能含有磷酸盐痕迹的玻璃器皿分开，这些玻璃器皿通常存在于用于洗涤玻璃器皿的洗涤剂中。
  3. 加入90微升的检测鸡尾酒，无论是否含有Cdr1-ATPase抑制剂（20 μM的寡霉素），加入96井微提亚板的单独井中。
    注:检测以三重执行。
  4. 将分离的等离子体膜（+5-10 μg 蛋白）或磷酸盐标准（0-100 nmoles Pi）加入微提亚板的适当井中。
    注:保留两组单独的磷酸盐标准的第一列和最后一列。
  5. 开始检测时，将预热 28.8 mM Mg-ATP（6 mM 最终浓度）的 25 μL 加入多通道移液器到单独的油井中，并在 30 °C 下孵育 30 分钟。
  6. 通过添加 130 μL 开发试剂（1.6% L-ascorbate 钠、1% SDS、12% 6M 硫酸中的铵聚氨酯）来停止反应。
    注意:浓缩硫酸与水发生剧烈反应。它是腐蚀性的，可能会导致皮肤和肺部损伤。
  7. 在 Rt 孵育 10 分钟。
  8. 用微提亚板读卡器阅读 750 nm 的微提亚板井的吸收量。
    注:坚持蓝色染料开发的10分钟潜伏时间（即减少磷-摩尔腺复合物）对检测精度至关重要，因为蓝色染料的开发会随着时间的而继续。
  9. 在没有寡霉素的情况下，将在存在寡霉素的情况下的 ATPase 活性从总 ATPase 活性中减去，从而获得 Cdr1 特定的 ATPase 活性（即对寡霉素敏感的 ATPase 活性）。

6. 小尺度洗涤剂屏幕

  1. 将细胞过度表达Cdr1-mGFPHis的血浆膜制剂（即2.5毫克血浆膜蛋白）与GTED-20缓冲器[10mM Tris] 0.5 m M EDTA， 20 % （w/v） 甘油; pH 7.5; 新鲜补充 1 mM PMSF] 含有 5 毫克的测试洗涤剂， 达到总体积 0.5 mL 补充 1% （w/v） 洗涤剂.
  2. 将混合物在 4-8 °C 下旋转 2 小时，并配有旋转装置。
  3. 将混合物在 141，000 x g 下离心，在 4 °C 下离心 1 小时。
  4. 将含有溶解材料的超高纳特转移到新鲜的微中心管中。
  5. 在不溶性颗粒分数中加入 0.5 mL GTED-20 缓冲器，辅以 2% （w/v） SDS，并在摇晃的培养器中以 30 °C o/n 孵育，以提取所有洗涤剂不溶膜蛋白。
  6. 通过 SDS-PAGE 分析和比较超高分子和溶化颗粒分数。
  7. 在库马西染色之前，拍摄含有 GFP 标记蛋白质的凝胶，用于凝胶内 GFP 荧光，并使用成像系统量化表达水平。
  8. 使用可溶膜蛋白分数用于下游应用，如荧光大小排除色谱 （FSEC）58 来识别合适的洗涤剂。

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结果

使用 pYES2（图 2B）实现了S. cerevisiae AD+的高频率转换 （+4 x10 4变压剂/μg）。不出所料，无DNA（即仅限ddH2O）控制没有给出变压剂，线性CDR1-mGFPHis转换盒式磁带（图1A）的1微克给+50变压器（图2C）与优化的AD+转换协议。CDR1-mGFPHis变压剂还测试了它们在不可发酵碳源上生长的能力，以?...

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讨论

尽管膜蛋白结构分析最近取得了进展，但目前尚无Cdr1或任何其他PDR运输机的3D结构。因此，了解Cdr1结构及其生化特征非常重要，因为这不仅能深入了解新药的合理设计，克服以流体为媒介的耐药性，而且能深入了解ABC蛋白重要亚系的功能机制。

膜蛋白结构特征的主要要求之一是正确折叠和完整膜蛋白的表达，其数量为X射线结晶或低温-EM所需。选择表达系统时的重要标准是易...

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披露声明

作者没有什么可透露的。

致谢

作者感激地感谢新西兰马斯登基金（Grant UOO1305）的资助，以及来自泰国曼谷朱拉隆功大学医学院的整笔赠款（ M. Niimi）。他们要感谢奥塔哥大学向马达尼大学提供博士学位奖学金。作者还感谢斯特凡·劳恩瑟教授及其同事阿米尔·阿佩尔鲍姆博士和迪瓦纳亚加巴拉蒂·维纳亚加姆博士在德国多特蒙德马克斯·普朗克分子生理学研究所（MPIMP）对G·马达尼进行为期6个月的访问期间给予的支持和监督。作者还感谢德国学术交流局（DAAD）向G.马达尼提供了一项研究补助金（57381332），以访问MPIMP。

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材料

NameCompanyCatalog NumberComments
2-(N-Morpholino)ethane-sulphonic acid (MES)Sigma-AldrichM3671
2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol (Tris base; ultra-pure)Merck77-86-1
2,2-Didecylpropane-1,3-bis-β-D-maltopyranosideAnatraceNG310SLMNG
2,2-Dihexylpropane-1,3-bis-β-D-glucopyranosideAnatraceNG311SOGNG (MNG-OG)
2,2-Dioctylpropane-1,3-bis-β-D-maltopyranosideAnatraceNG322SDMNG
4-Trans-(4-trans-propylcyclohexyl)-cyclohexyl α-D-maltopyranosideGlycon Biochemicals GmbHD99019-CPCC-α-M
40% Acrylamide/Bis-acrylamide (37.5:1)Bio-Rad1610148
Acetic acid (glacial)Merck64-19-7
AgarFormedium 009002-18-0
Ammonium molybdateSigma-Aldrich13106-76-8
Ammonium persulphate (APS)Bio-Rad1610700
ATP disodium saltsigma-AldrichA-6419
Bromophenol blueSERVA Electrophoresis GmbH34725-61-6
CHAPSAnatraceC316S
CHAPSOAnatraceC317S
CSMFormediumDCS0019
CSM minus uracilFormediumDCS0161
Cyclohexyl-1-butyl-β-D-maltopyranosideAnatraceC324SCYMAL-4
Cyclohexyl-1-heptyl-β-D-maltopyranosideAnatraceC327SCYMAL-7
Cyclohexyl-methyl-β-D-maltopyranosideAnatraceC321SCYMAL-1
DigitoninSigma-Aldrich11024-24-1
Dithiothreitol (DTT)Roche Diagnostics10197785103
DMSOMerck67-68-5
EthanolMerck459836
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA; Titriplex III)Merck6381-92-6
ExoSAP-IT PCR Product Cleanup ReagentApplied Biosystems78205A blend of exonuclease and phosphatase
GlucoseFormedium50-99-7
GlycerolMerck56-81-5
GlycineMerckG8898
HEPESFormedium7365-45-9
Hydrochloric acidMerck1003172510
KOD Fx NeoTOYOBO CoKFX-201Use for reliable colony PCR
lithium acetate (LiAc)Sigma-Aldrich546-89-4
Magnesium chloride hexa-hydratesigma-AldrichM2393
MESFormedium145224-94-8
n-Decanoyl-N-hydroxyethyl-glucamideAnatraceH110SHEGA-10
n-Decanoyl-N-methyl-glucamideAnatraceM320SMEGA-10
n-Decyl-phosphocholineAnatraceF304SFos-choline-10
n-Decyl-β-D-maltopyranosideAnatraceD322SDM
n-Dodecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulphonateAnatraceAZ312SAnzergent 3-12
n-Dodecyl-N,N-dimethylamine-N-oxideAnatraceD360SLDAO
n-Dodecyl-α-D-maltopyranosideAnatraceD310HAα-DDM
n-Dodecyl-β-D-maltopyranosideAnatraceD310Sβ-DDM
n-Nonyl-β-D-glucopyranosideAnatraceN324SNG
n-Nonyl-β-D-maltopyranosideAnatraceN330SNM
n-Octadecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulphonateAnatraceAZ318SAnzergent 3-18
n-Octyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulphonateAnatraceAZ308SAnzergent 3-8
n-Octyl-phosphocholineAnatraceF300SFos-choline-8
n-Octyl-β-D-glucopyranosideAnatraceO311SOG
n-Tetradecyl-phosphocholineAnatraceF312SFos-choline-14
n-Tetradecyl-β-D-maltopyranosideAnatraceT315STDM
n-Tridecyl-phosphocholineAnatraceF310SFos-choline-13
n-Tridecyl-β-D-maltopyranosideAnatraceT323S-
n-Undecyl-β-D-maltopyranosideAnatraceU300SUM (UDM)
N,N,N’,N’-tetramethyl-ethylenediamine (TEMED)Sigma-AldrichT9281
OctylphenoxypolyethoxyethanolSigma-Aldrich9002-93-1TRITON X-100
OligomycinSigma-Aldrich75351
PeptoneFormedium3049-73-7
phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)Roche Diagnostics329-98-6
Phusion Hot Start Flex DNA PolymeraseNew England BiolabsM0535SHigh-fidelity DNA polymerase
polyethylene glycol (PEG 3350)Sigma-Aldrich25322-68-3
polyoxyethylenesorbitan monooleateSigma-Aldrich9005-65-6TWEEN 80
Potassium nitrateSigma-AldrichP8394
Protein Assay KitBio-Rad5000122RC DC Protein Assay Kit II
QC Colloidal Coomassie StainBio-Rad1610803
Prism Ultra Protein Ladder (10-245 kDa)AbcamAB116028
Sodium azideSigma-Aldrich71289
Sodium dodecyl sulphateSigma-Aldrich151-21-3SDS
Sodium L-ascorbate BioXtraSigma-Aldrich11140
Sucrose MonododecanoateAnatraceS350SDDS
Sulphuric acidSigma-Aldrich339741
Yeast extractFormedium008013-01-2
Yeast nitrogen base without amino acidsFormediumCYN0402
 Equipment (type)
Centrifuge  (Eppendorf 5804)Eppendorf
Centrifuge (Beckman Ultra)Beckman
Centrifuge (Sorvall RC6)Sorvall
FSEC apparatus (NGC Chromatography Medium Pressure system equipped with a fluorescence detector, an autosampler, a fractionator)Bio-Rad
Gel imaging (GelDoc EZ Imager)Bio-Rad
Microplate reader (Synergy 2 Multi-Detection)BioTek Instruments
PCR thermal cycler (C1000 Touch)Bio-Rad
Power supply (PowerPac)Bio-Rad
SDS PAGE (Mini-PROTEAN Tetra)Bio-Rad
Shaking incubator (Multitron)Infors HT, Bottmingen
Superose 6 Increase 10/300 GLGE Healthcare Life SciencesGE17-5172-01
UV/Visible spectrophotometer (Ultraspec 6300 pro)Amersham BioSciences UK Ltd

参考文献

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