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Resumo

Este artigo apresenta um protocolo de isolamento de membrana plasmática de pequena escala para a caracterização da proteína Cdr1 (cassete de ligação ATP) da Candida ABC (fita adesão a ATP), superexpressa em Saccharomyces cerevisiae. Uma mGFPC terminal de protease com um linker de 16 resíduos entre o Cdr1 e a tag foi projetada para facilitar a purificação e o detergente-triagem do Cdr1.

Resumo

A caracterização bioquímica e biofísica bem sucedida dos transportadores abc depende fortemente da escolha do sistema de expressão heteróloga. Nas últimas duas décadas, desenvolvemos uma plataforma de expressão de proteína de membrana de levedura que tem sido usada para estudar muitas proteínas importantes da membrana fúngica. A expressão host Saccharomyces cerevisiae ADΔΔ é excluída em sete grandes transportadores endógenos ABC e contém o fator de transcrição Pdr1-3 com uma mutação de ganho de função que permite a superexpressão constitutiva de genes heterologos de proteína de membrana stably integrados como cópias únicas no lócus PDR5 genômico. A criação de vetores plasmídeos versáteis e a otimização de estratégias de clonagem de uma etapa permite a clonagem rápida e precisa, mutagênese e expressão de transportadores heterologos do ABC. Aqui, descrevemos o desenvolvimento e o uso de uma nova tag dupla mGFPHIs de protease-cleavable (ou seja, a levedura monomérica aprimida proteína fluorescente verde yEGFP3 fundida a uma etiqueta de purificação de afinidade de seis histidinas) que foi projetada para evitar possíveis interferências da tag com a proteína de interesse e aumentar a eficiência vinculante da Sua tag para resinas de afinidade de níquel. A fusão de mGFPHis à proteína de membrana ORF (quadro de leitura aberta) permite a fácil quantificação da proteína por meio da inspeção de géis de poliacrilamida e detecção de produtos de degradação que retêm a tag mGFPHis. Demonstramos como essa característica facilita o rastreamento de detergente para solubilização de proteínas de membrana. Um protocolo para o isolamento eficiente, rápido e confiável das preparações de membrana plasmática em pequena escala do C-terminal marcado Candida albicans multirug efflux transporter Cdr1 superexpresso em S. cerevisiae ADΔ Δ, é apresentado. Este protocolo de isolamento da membrana plasmática de pequena escala gera membranas plasmáticas de alta qualidade dentro de um único dia útil. As preparações da membrana plasmática podem ser usadas para determinar as atividades enzimáticas das variantes mutantes Cdr1 e Cdr1.

Introdução

A extração de proteínas de membrana integral de seu ambiente lipídico nativo pode afetar drasticamente sua estrutura e função1,2,3,4. A complexa composição lipídica das membranas biológicas5 garante que interações proteína-lipídicas criticamente importantes possam ocorrer6. Os lipídios mantêm a integridade estrutural das proteínas da membrana, permitindo que funcionem corretamente em seu destino de compartimento de membrana7,8. Portanto, um primeiro passo crítico na purificação da proteína da membrana é a extração da proteína de seu ambiente nativo sem afetar sua estrutura e/ou função.

Existem muitos obstáculos para caracterizar a estrutura das proteínas da membrana, a maioria das quais estão relacionadas à sua natureza hidrofóbica, e às dificuldades de expressar proteínas de membrana devidamente dobradas e funcionais nas quantidades necessárias para cristalografia de raios-X ou microscopia crio-elétron (crio-EM)9,10,11,12. Existem três tipos de sistemas de expressão proteica de membrana: homólogo9,heterologos13,14,15, e sistemas de expressão in vitro 16,17. Os níveis de expressão muitas vezes baixos, ou os custos proibitivos, de muitos sistemas de expressão deixam apenas alguns hospedeiros como a opção preferida para produzir proteínas de membrana. Eles incluem o hospedeiro bacteriano, Escherichia coli,as leveduras S. cerevisiae e Pichia pastoris,e maiores eucariotes, como células de insetos Sf9 ou linhas de células mamíferas18. Todas as tecnologias de expressão de proteína de membrana têm vantagens e desvantagens; no entanto, s. cerevisiae é talvez o organismo modelo eucariótico mais bem estudado adequado para a produção de proteínas de membrana. É altamente versátil com aplicações em engenharia genética, descoberta de medicamentos, biologia sintética e expressão de proteínas de membrana eucariótica14,19,20,21.

Neste estudo, foi utilizada uma tecnologia patenteada de expressão de proteína de membrana S. cerevisiae 21, com S. cerevisiae ADΔ14 e ADΔΔ22 como os hosts preferidos (Figura 1A),para superexpressar e estudar a principal bomba C. albicans multidrug efflux Cdr1. Ambas as cepas de S. cerevisiae são derivados de AD1-8u- 23 que têm os genes ura3 (ADΔ) ou ambos os genes ura3 e his1 (ADΔΔ) excluídos para eliminar quaisquer falsos transformadores de uracil positivo ou prototrótroes de histidina surgidos através da integração indesejada no URA3 ou no loci genômico HIS1. A exclusão das 7 principais bombas de efflux multidroug23, indicada na Figura 1A, torna ADΔΔ requintadamente sensível à maioria dos xenobióticos. O fator de transcrição mutante de ganho de função Pdr1-3 causa a superexpressão constitutiva de proteínas de membrana heterologos, como o Cdr1 (octógonos vermelhos na Figura 1A) após a integração do de transformação heterologous-ORF(Figura 1A) no lócus PDR5 genômico (retângulo azul na Figura 1A)através de dois eventos de recombação homologous. A localização adequada da membrana plasmática de proteínas etiquetadas C-terminally mGFPHis podem ser confirmadas por microscopia confocal(Figura 1A),e a sua tag pode ser usada para purificação de afinidade de níquel da proteína marcada. A clonagem de alguns transportadores fúngicos do ABC (por exemplo, Candida krusei ABC1) em plasmídeos derivados do pABC3, no entanto, não foi possível porque eles não poderiam ser propagados em Escherichia coli devido à toxicidade celular. Isso levou ao desenvolvimento da clonagem de uma etapa das proteínas de membrana14,24 marcadas em seu N ou C-terminus com várias etiquetas de afinidade, epítope ou repórter diretamente em S. cerevisiae ADΔΔ(Figura 1C). S. cerevisiae As cepas ADΔ Δ que expressam demais vários mutantes CDR1 também podem ser criadas de forma eficiente, usando até cinco fragmentos de PCR individuais que se sobrepõem a 25 bp(Figura 1C). Empregando este protocolo, muitos ORFs de interesse podem ser clonados, expressos e caracterizados a baixo custo e com alta eficiência em um período de tempo muito curto. A eficiência de transformação reduz apenas ~2 vezes a cada fragmento adicional de PCR.

Se desejar, os níveis de expressão também podem ser facilmente manipulados pelo design primer para ajustar previsivelmente os níveis de expressão para qualquer lugar entre 0,1%-50% dos níveis de expressão geralmente altos e constitutivos25. O vetor de clonagem de derivativo otimizado, multifuncional, pABC314, pABC3-XLmGFPHis26 (Figura 1B) contém um site de decote protease HRV-3C (X; LEVLFQ| GP), um protease que tem melhor desempenho a 4 °C do que o vírus da trava de tabaco (TEV)27. L é um linker de proteína de aminoácido (GSGGS), mGFP é um mutante monomédico (A206K)28,29 versão da variante de proteína de fluorescência verde-fluorescência aprimorada yEGFP330, e Seu é um linker de três aminoácidos (GGS) seguido pela tag de purificação de proteína de níquel-afinidade de seis histidinas (HHHHHHHHH).

Esta tecnologia de expressão tem sido usada com sucesso na descoberta de medicamentos e no estudo de proteínas de membrana. A primeira estrutura para um alvo fúngico de azole, S. cerevisiae Erg1131,foi resolvida usando essa tecnologia. Também possibilitou a caracterização detalhada de C. albicans Cdr132,33,34 e a criação de uma molécula Cdr1 deficiente de cisteína35 adequada para estudos de cisteína-transligação para verificar qualquer futura estrutura de alta resolução. Muitos outros transportadores abc de grandes patógenos fúngicos humanos (ou seja, C. albicans, Candida glabrata, Candida auris, Candida krusei, Candida utilis, Cryptococcus neoformans, Aspergillus fumigatus, Penicillium marneffei, e o complexo de espécies Fusarium solani) também foram estudados em detalhes usando esta plataforma de expressão24,36,37,38,39. Isso permitiu a geração de um painel de cepas de S. cerevisiae superexpressando bombas efflux que tem sido usada em telas de alto rendimento para descobrir o novo substrato de bomba efflux fluorescente Nilo vermelho40 e específico41 e de amplo espectro14,33,42,43,44 inibidores da bomba efflux. O uso deste sistema também possibilitou a descoberta da clorgyline como o primeiro de seu tipo inibidor de bomba de efflux de amplo espectro de amplo espectro42.

A solubilização completa das proteínas da membrana e a criação de uma preparação homogênea de proteína-micelle de membrana homogênea desprovida de lipídios endógenos, requer altas concentrações de detergente45. Mas, infelizmente, isso também muitas vezes inativa a proteína da membrana5,8,45,46. As propriedades dos monômeros detergentes e sua agregação em solução são afetadas pelas propriedades físicas da cauda hidrofóbica, pelo comprimento e ramificação da cadeia de alquila, pela presença de um núcleo aromático ou cadeia lateral fluoroalquila, ou pelo número de unidades de polioxileno. Assim, a triagem de detergentes é um importante primeiro passo para determinar o detergente mais adequado para solubilização e purificação de proteínas de membrana.

C. albicans é um grande patógeno fúngico humano de indivíduos imunocomprometidos que podem causar infecções invasivas graves e fatais47, e pode se tornar resistente a drogas antifúngicasazole 48,49. Um dos principais mecanismos da resistência multidrogas c. albicans é a superexpressão do Cdr150, que é um carregador de ligação ATP tipo II (ABC)51 da subfamília ABCG localizada na membrana plasmática. Os transportadores de FUNG em tamanho real (consistindo em dois domínios de ligação nucleotídeos [NBDs] e dois domínios transmembranos [TMDs]) são mais conhecidos como transportadores de resistência a medicamentos pleiotrópicos (PDR) e são caracterizados por sua topologia de domínio invertida única [NBD-TMD]2. Os transportadores de PDR só são encontrados nas plantas52,53 e fungos54. Apesar de sua importância, não há estruturas para transportadores de PDR, embora as estruturas para transportadores humanos de médio porte ABCG tenham sido recentemente resolvidas, o que ajudou a criar o primeiro modelo provisório para o Cdr133. Nossas recentes evidências experimentais sugerem, no entanto, que este modelo é falho possivelmente porque os transportadores Fúngicos de PDR têm NBDs assimétricos característicos resultando muito possivelmente em um mecanismo de transporte único. Uma estrutura de alta resolução do Cdr1 é, portanto, necessária tanto para o desenho racional de novos inibidores da bomba efflux que podem ajudar a superar a resistência a medicamentos mediados pela Efflux, quanto para fornecer insights sobre o mecanismo de ação desta importante família de transportes ABC.

O objetivo deste estudo foi desenvolver protocolos confiáveis para a expressão, solubilização e purificação do Cdr1 no hospedeiro de expressão S. cerevisiae geneticamente modificado, com o objetivo final de obter uma estrutura de alta resolução para o Cdr1. Como parte desse processo, uma tag dupla mGFPHis(Figura 1B)foi projetada com um linker de 16 resíduos separando a tag do C-terminus do Cdr1, que melhorou a ligação do 6x anexado Sua etiqueta de afinidade com a resina de afinidade de níquel e permitiu o monitoramento dos níveis de expressão cdr1 em células vivas e durante todo o processo de purificação. Também foi desenvolvido um protocolo reprodutível para preparações de proteína de membrana plasmática de levedura de pequena escala contendo cerca de 10% de C. albicans Cdr1 (como estimado pela coloração de Coomassie após a SDS-PAGE), que poderia ser usado para a caracterização bioquímica do Cdr1.

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Protocolo

1. Preparação de estoques frescos ou congelados de células ADΔ e ADΔΔ competentes

  1. Inoculação de 25 mL de 2x YPCD [i.e., 2x YPD; 2% (p/v) extrato de levedura, 2% (w/v) peptone, 4% (w/v) dextrose), 0,079 % (w/v) CSM (mistura completa de suplementos)]35 médios com uma única colônia de levedura e incubam durante a noite (o/n) por 16 h a 30 °C com agitação a 200 revoluções por minuto (rpm).
  2. Inocular 225 mL de 2x YPCD médio com a cultura de 25 mL o/n e verificar a densidade óptica celular a 600 nm (OD600); o OD600 é geralmente ~0,5-1.0.
    NOTA: Nesta fase, certifique-se de que todos os materiais necessários para o seguinte experimento de transformação estejam prontamente disponíveis.
  3. Cresça a cultura a 30 °C por mais ~6-8 h com agitação a 200 rpm até que a densidade celular atinja um OD600 de ~6-8.
    NOTA: As seguintes etapas são realizadas à temperatura ambiente (RT) a menos que seja indicado de outra forma.
  4. Colher essas células de fase logarítmica por centrifugação a 3.000 x g por 3 min.
  5. Resuspenque as células e lave-as duas vezes com água estéril dupla destilada (ddH2O; ou seja, 200 mL e depois 20 mL).
  6. Colher as células a 3.000 x g por 3 min.
  7. Lentamente (ou seja, adicione 30 alíquotas iguais de solução de células competentes congeladas (FCC) a cada minuto por 30 minutos) resuspenque a pelota celular em X mL de FCC [5% (w/v) glicerol, 10% (v/v) sulfóxido de dimetil (DMSO)] no gelo (onde X = OD600; por exemplo, se OD600 = 6 resuspend em 6 mL, ou se OD600 = 3 resuspendd em 3 mL).
    NOTA: A composição correta da FCC é fundamental para o sucesso da transformação.
  8. Mantenha as células no gelo por 2h antes da transformação ou armazene alíquotas a -80 °C até que seja necessário.
    NOTA: As células ADΔ e ADΔΔ são muito sensíveis ao congelamento. Assim, as células devem ser resfriadas lentamente para -80 °C: coloque tubos de microcentrifuuge frios contendo alíquotas de células de 50-600 μL em uma caixa de armazenamento de plástico (RT). Coloque a caixa em um recipiente de poliestireno maior (RT) e feche o recipiente com uma tampa de poliestireno de montagem. Em seguida, coloque o recipiente no congelador -80 °C.
    ATENÇÃO: O congelamento lento é fundamental para a sobrevivência celular.

2. Transformação de ADΔ e ADΔ Δ com CaCDR1-XLmGFPHis e confirmação de transformadores corretos por colônia PCR e sequenciamento de DNA

NOTA: Plasmid pABC3-CDR1-mGFPHis foi criado usando estratégias convencionais de clonagem descritas em detalhes em Lamping et al., 201055 e é ilustrada na Figura 1B. Wild-type C. albicans CDR1 foi isolado como um fragmento pacI/NotI de plasmid pABC3-CaCDR1A-GFP14 e clonado em pABC3-XLmGFPHis26.

  1. PCR amplifica todo o de transformação CDR1 com um polimerase de DNA de alta fidelidade e par de primer PDR5-pro/PDR5-ter35 usando 1-10 ng de pABC3-CaCDR1-XLmGFPHis como um modelo de DNA ou, alternativamente, digerir 2 μg de pABC3-CaCDR1-XLmGFPHis até a conclusão com 10 U restrição enzima AscI a 37 °C (Figura 1A,B).
    NOTA: O de transformação CDR1 (Figura 1A) compreende o promotor PDR5 - CaCDR1-mGFPHis - terminator PGK1 - marcador de seleção URA3 - região a jusante PDR5.
  2. Realize agarose gel eletrophoresis e gel extrair o de transformação ~8 kb.
    NOTA: A purificação do gel do de transformação CaCDR1 de ~8 kb remove qualquer DNA plasmídeo não digerido, o que poderia levar a transformadores incorretos que têm todo o plasmídeo, em vez do de transformação linear, integrado no lócus genômico PDR5.
  3. Desnaturar a quantidade necessária de DNA portador de espermatozomário de salmão (2 mg/mL; 10 mM Tris, 1 mM EDTA; pH 7.5) por 10 minutos em um banho de água fervente e manter no gelo. Use tubos com tampa de parafuso para ferver o DNA do esperma do salmão para evitar a abertura da tampa.
  4. Misture 50 μL de DNA de esperma de salmão desnaturado com 14 μL do de transformação (500-2.000 ng) e mantenha os 64 μL de mistura de DNA no gelo até o uso posterior.
    NOTA: Use 10 ng de um e.coli-levedura plasmid (por exemplo, pYES2) como um controle de transformação positivo(Figura 2B).
  5. Resuspenque células competentes frescas ou congeladas descongeladas rapidamente por 5 minutos em um banho de água de 30 °C e divida-as em alíquotas de 50 μL em tubos de microcentrifuuagem de 1,5 mL.
  6. Células de colheita por centrifugação por 1 min em um microfumido em velocidade máxima (18.000 x g).
  7. Remova o supernatante e mantenha a pelota de célula em RT.
  8. Para cada transformação, misture 296 combinações de μL (RT) de 260 μL de 50% (w/v) polietileno glicol (PEG 3350) e 36 μL de acetato de lítio de 1 M (LiAc), por tubulação repetida, com as 64 μL apropriadas de misturas de DNA gelado.
  9. Adicione a mistura apropriada imediatamente a uma alíquota de pelotização de pelotização de célula competente de 50 μL.
  10. Resuspenque a pelota celular na mistura PEG-LiAc-DNA de 360 μL por meio de um vórtice completamente para cerca de 30 s.
  11. Incubar a mistura celular em um banho de água de 30 °C por 1h.
    NOTA: As células ADΔ e ADΔΔ se transformam melhor a 30 °C do que a 42 °C35.
  12. Colher as células a 18.000 x g por 10 s. Descarte o supernatante e resuspenque a pelota de célula em 80 μL de ddH2O.
  13. Espalhe as células em uma placa de ágar CSM-URA35 [ou seja, 0,67% (w/v) base de nitrogênio de levedura sem aminoácidos, 0,077% (w/v) CSM menos uracil, 2% (w/v) glicose e 2% (w/v) ágar].
  14. Incubar as placas por 2-3 dias a 30 °C até que os transformadores de prototrófico uracil estejam claramente visíveis.
    NOTA: Espere ~100 transformadores por μg do de transformação linear ~8 kb CaCDR1 e ~4 x 104 transformadores por μg pYES2.
  15. Escolha cinco transformadores independentes e espalhe-os em uma placa CSM-URA fresca para separar os transformadores de prototrófico uracil de restos de células hospedeiras não transformadas.
  16. Remova quaisquer mutantes de pequeno porte, cultivando os transformadores em placas de YPG-ágar [1% (w/v) extrato de levedura, 2% (w/v) peptone, 2% (v/v) glicerol e 2% (w/v) ágar](Figura 2D).
    NOTA: Mutantes pequenos têm mitocôndrias defeituosas e, portanto, não podem crescer em fontes de carbono não fermentáveis. Eles são bastante comuns em S. cerevisiae56. S. cerevisiae ADΔ e ADΔΔ são particularmente propensos a adquirir o fenótipo pequeno.
  17. Execute a colônia de leveduras PCR e confirme pelo menos três transformadores independentes a serem corretamente integrados ao lócus PDR5 genômico(Figura 1C)amplificando todo o de transformação de ~8 kb CaCDR1 com um polimerase de DNA específico que é otimizado para amplificar produtos PCR de fontes de modelo de DNA impuro. Use um conjunto de primers que se ligam fora do local de integração e alíquotas de 1 μL de suspensões celulares (em ddH2O) derivadas de colônias únicas como modelos de DNA.
    NOTA: Esta polimerase de DNA em particular amplifica de forma confiável ~8 kb fragmentos pcr de células de levedura intactas. No entanto, para amplificação confiável, são necessários 45 ciclos de PCR, e as células de levedura devem ser resuspendidas em OD600 1-10 em ddH2O.
  18. Confirme o produto correto de amplificação PCR de ~8 kb por eletroforese de gel de DNA agarose de uma porção de 1 μL da reação pcr.
  19. Remova os primers de amplificação em excesso de uma porção de 10 μL da reação do PCR com uma mistura enzimática de uma exonuclease de DNA de um fio único e uma fosfatase seguindo as instruções do fabricante antes de sequenciar todo o ORF usando partes da amostra de DNA tratada com primers apropriados.

3. Protocolo de isolamento da membrana de plasma de levedura de pequena escala

  1. Células de levedura em crescimento
    1. Pré-cultura uma única colônia de leveduras em 10 mL de YPD a 30 °C por ~7-8 h com agitação a 200 rpm.
    2. Inocular 40 mL de meio YPD com a pré-cultura de 10 mL e incubar as células a 30 °C o/n (~16 h) com agitação a 200 rpm até que a densidade celular atinja um OD600 de 1-3.
  2. Colhendo células de levedura
    1. Colher 40 unidades de OD (ODU; por exemplo, 1 mL a um OD600 de 1 = 1 ODU) de células de fase logarítmica a 4.200 x g por 5 min a 4 °C.
    2. Resuspend e lave as células duas vezes com ddH2O estéril gelado (ou seja, 40 mL e depois 1 mL; colher células entre as etapas por centrifugação a 4.200 x g por 5 min a 4 °C).
    3. Resuspenque a pelota em 1 mL de ddH2O estéril gelado e transfira a suspensão celular para um tubo de microcentrifuge pré-resfriado (no gelo) de 1,5 mL.
    4. Células de colheita a 3.300 x g por 3 min a 4 °C.
    5. Aspire o supernatante.
    6. Resuspend a pelota celular em tampão homogeneizador de 0,5 mL [HB; 50 mM Tris, 0,5 mM EDTA, 20% (v/v) glicerol; pH 7,5] recém-suplementado com fluoreto de fenilmetilsulfonyl de 1 mM (PMSF).
      NOTA: Adicione sempre o PMSF fresco porque o PMSF é inativado rapidamente após a exposição à água.
      ATENÇÃO: O PMSF é um inibidor de protease serina, extremamente corrosivo e destrutivo para os tecidos. Pode causar danos irreversíveis ao olho.
    7. Armazene a suspensão do celular a -80 °C ou use imediatamente.
  3. Isolamento das membranas plasmáticas
    1. Se congelado, descongele as células no gelo por ~1 h.
    2. Adicione contas de sílica de 0,5 mm de diâmetro à suspensão celular de 0,5 mL para atingir um volume total de 1 mL.
    3. Quebrar células com 6 ciclos de vórtice em intensidade máxima de agitação por 1 min intercaladas com períodos de resfriamento de 3 minutos no gelo.
    4. Faça um fino orifício na parte inferior do tubo com uma lâmina de bisturi aquecida.
    5. Colete a célula quebrada homogeneizar através da parte inferior do tubo encaixado em outro tubo de microcentrifus de 1,5 mL gelado com um giro de baixa velocidade de 10 s (~200 rpm).
      NOTA: Isso garante que as contas de sílica permaneçam no tubo original.
    6. Centrifugar a célula homogeneizar a 5.156 x g por 5 min a 4 °C para remover detritos celulares, células ininterruptas e núcleos.
    7. Transfira 450 μL de supernacido em um tubo de microcentrifusagem de 1,5 mL gelado e adicione um adicional de 1 mL de HB gelado complementado com PMSF fresco (1 mM).
      NOTA: Esta etapa de diluição é fundamental para a recuperação da proteína da membrana plasmática de alta qualidade.
    8. Colher membranas plasmáticas a 17.968 x g por 1 h a 4 °C e resuspencar a pelota da membrana plasmática, por tubulação repetida, em 100 μL de HB recém-suplementada com 1 mM PMSF. Solte a pelota celular para homogeneização adequada da membrana plasmática, mexendo a pelota celular com a ponta de pipeta de 100 μL antes de liberar os 100 μL de HB e para cima e para baixo.
    9. Meça a concentração proteica da preparação da membrana plasmática com um kit de ensaio proteico compatível com tampões que contenham agente redutor e detergente.
    10. Armazene as membranas plasmáticas a -80 °C ou mantenha no gelo para uso imediato.

4. Sulfato de sódio de sulfato de poliacrilamida eletroforese de gel (SDS-PAGE)

  1. Monte o aparelho para preparar géis de poliacrilamida.
  2. Para dois géis separados (7% poliacrilamida), misture 2,1 mL de 40% de acrilamida/bis-acrilamida, 3 mL de tampão de separação de 4x (1,5 M Tris, 0,4% sulfato de dodecil de sódio [SDS] (w/v); pH 8,8) e 6,9 mL de ddH2O. Adicione 8 μL de tetrametetilenodiamina (TEMED) e 60 μL de persulfato de amônio de 10% (APS) para iniciar a polimerização de acrilamida.
    ATENÇÃO: A acrilamida/bis-acrilamida é muito tóxica. Causa irritação da pele, neuropatia periférica e é um cancerígeno. TEMED é prejudicial se engolido ou inalado. APS é prejudicial se engolido. Causa sérias irritações nos olhos e na pele.
  3. Despeje ~4-5 mL desta mistura no aparelho de gel montado, até ~2 cm do topo.
  4. Camada cuidadosa ~1-2 mL de 0,1% SDS em cima para criar um menisco planar.
  5. Deixe que o poliacrilamida seja definido por ~60 min no RT.
  6. Prepare uma mistura de gel de empilhamento para dois géis misturando 0,5 mL de 40% de acrilamida/bis-acrilamida, 1 mL de tampão de empilhamento 4x (0,5 M Tris, 0,4% SDS (w/v); pH 6,8) e 6,9 mL de ddH2O. Adicione 2 μL de TEMED e 30 μL de 10% APS para iniciar a polimerização da acrilamida.
  7. Remova a camada SDS de 0,1% do gel de separação polimerizada e enxágue com ddH2O para remover traços de SDS.
  8. Despeje a mistura de gel de empilhamento no gel de separação.
  9. Coloque um pente no gel de empilhamento e remova quaisquer bolhas de ar ao redor do pente.
  10. Deixe que o gel de empilhamento seja definido por ~60 min no RT.
  11. Retire o pente e enxágue as ranhuras de gel com água. Coloque o gel no tanque de gel e encha o tanque de gel até o topo com 1x de tampão de corrida (24,8 mM Tris, 190 mM de glycina, 0,1% SDS).
    NOTA: Prepare 1x tampão de execução de um estoque tampão de 10x (248 mM Tris, 1,9 M de gliccina, 1% SDS (w/v) em ddH2O) armazenado na RT.
  12. Misture 5-10 μL amostras de membrana plasmática (i.e., 10-20 μg de proteína) com volumes iguais de corante de carga de proteína 2x [120 mM Tris-HCl (pH 6,8), 20% glicerol, 0,02% azul bromofenol, 4% SDS, dithiothiothreitol (DTT)] e carga imediata em slots de gel individuais submersos em tampão de corrida.
    ATENÇÃO: O DTT é prejudicial se ingerido. Causa sérias irritações nos olhos e na pele.
    NOTA: Faça um estoque de 10 mL de corante de carregamento de proteína 2x, alíquota e armazene a -20 °C. Não aqueça as amostras mistas, mas carregue-as imediatamente em ranhuras de gel individuais para que a tag GFP não seja desnaturada, e os sinais de fluorescência em gel possam ser detectados.
  13. Carregar marcadores de peso molecular de proteína (faixa de 10-245 kDa) em um slot separado para permitir a estimativa de tamanho de fragmentos de proteínas individuais.
  14. Realize a eletroforese de gel a 200 V até que o corante azul de carga atinja a parte inferior do gel (geralmente 45-55 min).
  15. Examine o gel para gfp-fluorescência em gel com um sistema de imagem de gel (comprimentos de onda de excitação e emissão são 475-485 nm e 520 nm, respectivamente).
  16. Seguindo a imagem de fluorescência em gel, fixar proteínas por agitação suave do gel em ~10-20 mL Protein Gel Fixing Solution (40% etanol, 10% ácido acético) por 15 min na RT.
  17. Enxágüe o gel duas vezes por 10 min com 10 mL de ddH2O e visualize bandas proteicas colocando o gel em solução de mancha cooidal coomassie de 10 mL com agitação suave por ~1 h na RT.
  18. Para melhor visualização de bandas proteicas, descolora o gel uma ou duas vezes em ~20 mL de ddH2O por ~1 h antes de gravar imagens com o sistema de imagem em gel.

5. Determinação das Atividades CDR1 ATPase 57

  1. Diluir amostras de membrana plasmática > 2,2 mg/mL a 1-2 mg/mL em HB.
  2. Equilibre o coquetel de ensaio ATPase (75 mM MES-Tris, Nitrato de potássio de 75 mM, 0,3 mM de amônio molipto, 7,5 mM de azida de sódio; pH 7,5) e Mg-ATP (28,8 mM de sal de disódio ATP, 28,8 mM MgCl2; pH 7,0) a 30 °C em uma incubadora de 30 °C.
    ATENÇÃO: O azida de sódio é altamente tóxico.
    NOTA: Certifique-se de que todos os estoques e garrafas tampão estão livres de fosfato; ou seja, lave os vidros com 1% (vol/vol) HCl e enxágue-o várias vezes com ddH2O. Além disso, mantenha-o separado de outros vidros que provavelmente contêm traços de fosfato comumente presentes em detergentes usados para lavar vidros.
  3. Adicione 90 μL de coquetel de ensaio com ou sem inibidor de Cdr1-ATPase (20 μM de oligomicina) em poços individuais de uma placa de microtiter de 96 poços.
    NOTA: O ensaio é realizado em triplicado.
  4. Adicione 5 μL das membranas plasmáticas isoladas (~5-10 μg de proteína) ou padrões de fosfato (0-100 nmoles Pi) nos poços apropriados da placa de microtúrfato.
    NOTA: Mantenha as primeira e últimas colunas para dois conjuntos separados de padrões de fosfato.
  5. Inicie o ensaio adicionando 25 μL de 28,8 mM Mg-ATP (concentração final de 6 mM) com uma pipeta multicanal em poços individuais e incubar a 30 °C por 30 min.
  6. Pare a reação adicionando 130 μL de reagente de desenvolvimento (1,6% de L-ascorbate de sódio, 1% SDS, 12% mlybdate de amônio em ácido sulfúrico de 6 M).
    ATENÇÃO: O ácido sulfúrico concentrado reage violentamente com água. É corrosivo e pode causar danos na pele e no pulmão.
  7. Incubar na RT por 10 minutos.
  8. Leia a absorção dos poços de placa de microtétmetro a 750 nm com um leitor de placas de microtiter.
    NOTA: Aderir ao tempo de incubação de 10 minutos para o desenvolvimento de corante azul (ou seja, um complexo de fosfor-molbdenum reduzido) é fundamental para a precisão do ensaio porque o desenvolvimento de corante azul continua com o tempo.
  9. Obtenha a atividade ATPase específica do CdR1 (ou seja, a atividade ATPase sensível à oligomicina) subtraindo a atividade ATPase na presença de oligomicina da atividade total de ATPase na ausência de oligomicina.

6. Tela de detergente em pequena escala

  1. Combine as preparações da membrana plasmática (ou seja, 2,5 mg de proteína de membrana plasmática) de células que superexpressam Cdr1-mGFPHis com tampão GTED-20 [10 mM Tris, 0,5 mM EDTA, 20 % (w/v) glicerol; pH 7,5; recém-suplementado com 1 mM PMSF] contendo 5 mg do detergente de teste, para atingir um volume total de 0,5 mL complementado com 1% (w/v) detergente.
  2. Gire a mistura a 4-8 °C por 2 h, com um dispositivo de rotação.
  3. Centrifugar a mistura a 141.000 x g a 4 °C por 1 h.
  4. Transfira o supernatante contendo material solubilizado para um tubo de microcentrifuuge fresco.
  5. Adicione 0,5 mL de tampão GTED-20 suplementado com SDS de 2% (w/v) à fração de pelota insolúvel e incubar a 30 °C o/n em uma incubadora de agitação para extrair toda a proteína de membrana insolúvel de detergente.
  6. Analise e compare as frações de pelotas supernascentes e solubilizadas pelo SDS-PAGE.
  7. Géis fotográficos contendo proteínas marcadas por GFP para gfp-fluorescência em gel antes da coloração coomassie e quantificar os níveis de expressão com o sistema de imagem.
  8. Use a fração de proteína de membrana solúvel para aplicações a jusante, como cromatografia de exclusão do tamanho da fluorescência (FSEC)58 para identificar detergentes adequados.

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Resultados

Uma alta frequência de transformação de S. cerevisiae ADΔΔ (~4 x 104 transformadores/μg) foi alcançada com pYES2(Figura 2B). Como esperado, o controle no DNA (ou seja, apenas ddH2O) não deu transformadores, e 1 μg do cdr1linear - de transformaçãomGFPHis (Figura 1A) deu ~50 transformadores(Figura 2C) com o protocolo otimizado de transformação ADΔΔ. Os transformadores

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Discussão

Apesar dos recentes progressos na análise estrutural das proteínas de membrana, nenhuma estrutura 3D para Cdr1, ou qualquer outro transportador PDR, está atualmente disponível. Assim, o conhecimento da estrutura do Cdr1 e suas características bioquímicas é importante, pois isso não só fornecerá insights sobre o desenho racional de novas drogas para superar a resistência a medicamentos mediados pelo efflux, mas também no mecanismo de função de uma importante subfamília das proteínas ABC.

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Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Os autores reconhecem com gratidão o financiamento do Fundo Marsden da Nova Zelândia (Grant UOO1305), e uma subvenção de bloco da Faculdade de Medicina, Universidade Chulalongkorn, Bangkok, Tailândia (M. Niimi). Eles desejam agradecer à Universidade de Otago por fornecer a G. Madani uma bolsa de doutorado. Os autores também desejam expressar sua gratidão ao professor Stefan Raunser e seus colegas, Dr. Amir Apelbaum, e ao Dr. Deivanayagabarathy Vinayagam, por seu apoio e supervisão durante uma visita de 6 meses de G. Madani no Instituto Max Planck de Fisiologia Molecular (MPIMP), Dortmund, Alemanha. Os autores também agradecem ao Serviço Alemão de Intercâmbio Acadêmico (DAAD) por fornecer a G. Madani uma bolsa de pesquisa (57381332) para visitar o MPIMP.

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Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
2-(N-Morpholino)ethane-sulphonic acid (MES)Sigma-AldrichM3671
2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol (Tris base; ultra-pure)Merck77-86-1
2,2-Didecylpropane-1,3-bis-β-D-maltopyranosideAnatraceNG310SLMNG
2,2-Dihexylpropane-1,3-bis-β-D-glucopyranosideAnatraceNG311SOGNG (MNG-OG)
2,2-Dioctylpropane-1,3-bis-β-D-maltopyranosideAnatraceNG322SDMNG
4-Trans-(4-trans-propylcyclohexyl)-cyclohexyl α-D-maltopyranosideGlycon Biochemicals GmbHD99019-CPCC-α-M
40% Acrylamide/Bis-acrylamide (37.5:1)Bio-Rad1610148
Acetic acid (glacial)Merck64-19-7
AgarFormedium 009002-18-0
Ammonium molybdateSigma-Aldrich13106-76-8
Ammonium persulphate (APS)Bio-Rad1610700
ATP disodium saltsigma-AldrichA-6419
Bromophenol blueSERVA Electrophoresis GmbH34725-61-6
CHAPSAnatraceC316S
CHAPSOAnatraceC317S
CSMFormediumDCS0019
CSM minus uracilFormediumDCS0161
Cyclohexyl-1-butyl-β-D-maltopyranosideAnatraceC324SCYMAL-4
Cyclohexyl-1-heptyl-β-D-maltopyranosideAnatraceC327SCYMAL-7
Cyclohexyl-methyl-β-D-maltopyranosideAnatraceC321SCYMAL-1
DigitoninSigma-Aldrich11024-24-1
Dithiothreitol (DTT)Roche Diagnostics10197785103
DMSOMerck67-68-5
EthanolMerck459836
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA; Titriplex III)Merck6381-92-6
ExoSAP-IT PCR Product Cleanup ReagentApplied Biosystems78205A blend of exonuclease and phosphatase
GlucoseFormedium50-99-7
GlycerolMerck56-81-5
GlycineMerckG8898
HEPESFormedium7365-45-9
Hydrochloric acidMerck1003172510
KOD Fx NeoTOYOBO CoKFX-201Use for reliable colony PCR
lithium acetate (LiAc)Sigma-Aldrich546-89-4
Magnesium chloride hexa-hydratesigma-AldrichM2393
MESFormedium145224-94-8
n-Decanoyl-N-hydroxyethyl-glucamideAnatraceH110SHEGA-10
n-Decanoyl-N-methyl-glucamideAnatraceM320SMEGA-10
n-Decyl-phosphocholineAnatraceF304SFos-choline-10
n-Decyl-β-D-maltopyranosideAnatraceD322SDM
n-Dodecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulphonateAnatraceAZ312SAnzergent 3-12
n-Dodecyl-N,N-dimethylamine-N-oxideAnatraceD360SLDAO
n-Dodecyl-α-D-maltopyranosideAnatraceD310HAα-DDM
n-Dodecyl-β-D-maltopyranosideAnatraceD310Sβ-DDM
n-Nonyl-β-D-glucopyranosideAnatraceN324SNG
n-Nonyl-β-D-maltopyranosideAnatraceN330SNM
n-Octadecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulphonateAnatraceAZ318SAnzergent 3-18
n-Octyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulphonateAnatraceAZ308SAnzergent 3-8
n-Octyl-phosphocholineAnatraceF300SFos-choline-8
n-Octyl-β-D-glucopyranosideAnatraceO311SOG
n-Tetradecyl-phosphocholineAnatraceF312SFos-choline-14
n-Tetradecyl-β-D-maltopyranosideAnatraceT315STDM
n-Tridecyl-phosphocholineAnatraceF310SFos-choline-13
n-Tridecyl-β-D-maltopyranosideAnatraceT323S-
n-Undecyl-β-D-maltopyranosideAnatraceU300SUM (UDM)
N,N,N’,N’-tetramethyl-ethylenediamine (TEMED)Sigma-AldrichT9281
OctylphenoxypolyethoxyethanolSigma-Aldrich9002-93-1TRITON X-100
OligomycinSigma-Aldrich75351
PeptoneFormedium3049-73-7
phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)Roche Diagnostics329-98-6
Phusion Hot Start Flex DNA PolymeraseNew England BiolabsM0535SHigh-fidelity DNA polymerase
polyethylene glycol (PEG 3350)Sigma-Aldrich25322-68-3
polyoxyethylenesorbitan monooleateSigma-Aldrich9005-65-6TWEEN 80
Potassium nitrateSigma-AldrichP8394
Protein Assay KitBio-Rad5000122RC DC Protein Assay Kit II
QC Colloidal Coomassie StainBio-Rad1610803
Prism Ultra Protein Ladder (10-245 kDa)AbcamAB116028
Sodium azideSigma-Aldrich71289
Sodium dodecyl sulphateSigma-Aldrich151-21-3SDS
Sodium L-ascorbate BioXtraSigma-Aldrich11140
Sucrose MonododecanoateAnatraceS350SDDS
Sulphuric acidSigma-Aldrich339741
Yeast extractFormedium008013-01-2
Yeast nitrogen base without amino acidsFormediumCYN0402
 Equipment (type)
Centrifuge  (Eppendorf 5804)Eppendorf
Centrifuge (Beckman Ultra)Beckman
Centrifuge (Sorvall RC6)Sorvall
FSEC apparatus (NGC Chromatography Medium Pressure system equipped with a fluorescence detector, an autosampler, a fractionator)Bio-Rad
Gel imaging (GelDoc EZ Imager)Bio-Rad
Microplate reader (Synergy 2 Multi-Detection)BioTek Instruments
PCR thermal cycler (C1000 Touch)Bio-Rad
Power supply (PowerPac)Bio-Rad
SDS PAGE (Mini-PROTEAN Tetra)Bio-Rad
Shaking incubator (Multitron)Infors HT, Bottmingen
Superose 6 Increase 10/300 GLGE Healthcare Life SciencesGE17-5172-01
UV/Visible spectrophotometer (Ultraspec 6300 pro)Amersham BioSciences UK Ltd

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