JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В данной статье представлен маломасштабный протокол изоляции плазматической мембраны для характеристики белка Candida albicans ABC (АТФ-связывающая кассета) Cdr1, сверхэкспрессированного в Saccharomyces cerevisiae. Расщепленная протеаза C-концевая двойная метка mGFPHis с 16-остатчным линкером между Cdr1 и меткой была разработана для облегчения очистки и моющего скрининга Cdr1.

Аннотация

Успешная биохимическая и биофизическая характеристика АВС-транспортеров в значительной степени зависит от выбора гетерологии системы экспрессии. За последние два десятилетия мы разработали платформу экспрессии белка дрожжевой мембраны, которая использовалась для изучения многих важных белков грибковых мембран. Экспрессия хозяина Saccharomyces cerevisiae ADΔΔ удалена в семи основных эндогенных переносчиках ABC и содержит транскрипционный фактор Pdr1-3 с мутацией усиления функции, которая позволяет конститутивную сверхэкспрессию генов гетерологийного мембранного белка, стабильно интегрированных в виде одиночных копий в геномном локусе PDR5. Создание универсальных плазмидных векторов и оптимизация одноэтапных стратегий клонирования позволяет быстро и точно клонировать, мутагенез и экспрессию гетерологийных ABC-транспортеров. Здесь мы описываем разработку и использование новой протеазно-расщепляемой двойной метки mGFPHis (т.е. мономерного дрожжевого усиленного зеленого флуоресцентного белка yEGFP3, сплавленного с шестигистидиновой меткой очистки с аффинностью), которая была разработана, чтобы избежать возможного вмешательства метки в интересующий белок и повысить эффективность связывания метки His с никель-аффинными смолами. Слияние mGFPHis с мембранным белком ORF (открытая рамка считывания) позволяет легко количественно оценить белок путем проверки полиакриламидных гелей и обнаружения продуктов деградации, сохраняющих метку mGFPHis. Мы демонстрируем, как эта функция облегчает скрининг моющих средств для солюбилизации мембранного белка. Представлен протокол эффективной, быстрой и надежной изоляции мелкомасштабных плазматических мембранных препаратов C-терминально помеченного мультилекарственного транспортера излияния Candida albicans Cdr1, переэкспрессированного в S. cerevisiae ADΔΔ. Этот маломасштабный протокол изоляции плазматических мембран генерирует высококачественные плазматические мембраны в течение одного рабочего дня. Препараты плазматической мембраны могут быть использованы для определения ферментной активности мутантных вариантов Cdr1 и Cdr1.

Введение

Извлечение интегральных мембранных белков из их родной липидной среды может резко повлиять на их структуру и функцию1,2,3,4. Комплексный липидный состав биологических мембран5 обеспечивает возможность критически важных белково-липидных взаимодействий6. Липиды поддерживают структурную целостность мембранных белков, что позволяет им правильно функционировать в своем мембранном отсеке назначения (назначениях)7,8. Поэтому критическим первым шагом в очистке мембранного белка является извлечение белка из его родной среды без влияния на его структуру и / или функцию.

Существует множество препятствий для характеристики структуры мембранных белков, большинство из которых связаны с их гидрофобной природой, а также трудностями экспрессии правильно свернутых и функциональных мембранных белков в количествах, необходимых для рентгеновской кристаллографии или криоэлектроновой микроскопии (крио-ЭМ)9,10,11,12. Существует три типа мембранных белковых экспрессии систем: гомологичные9,гетерологичные13,14,15и системы экспрессии in vitro 16,17. Часто низкие уровни экспрессии или непомерно низкие затраты многих систем экспрессии оставляют только несколько хозяев в качестве предпочтительного варианта для производства мембранных белков. Они включают бактериального хозяина, Escherichia coli,дрожжи S. cerevisiae и Pichia pastorisи высшие эукариоты, такие как клетки насекомых Sf9 или клеточные линии млекопитающих18. Все технологии экспрессии мембранных белков имеют свои преимущества и недостатки; однако S. cerevisiae является, пожалуй, наиболее изученным эукариотическим модельным организмом, пригодным для производства мембранного белка. Он очень универсален с приложениями в генной инженерии, открытии лекарств, синтетической биологии и экспрессии белков эукариотической мембраны14,19,20,21.

В этом исследовании была использована запатентованная технология экспрессии мембранного белка S. cerevisiae 21, с S. cerevisiae ADΔ14 и ADΔΔ22 в качестве предпочтительных хозяев(фиг.1A),для сверхэкспрессии и изучения основного мультилекарственного эффлюксного насоса Cr1. Оба штамма S. cerevisiae являются производными AD1-8u-23, которые имеют либо ura3 (ADΔ), либо оба гена ura3 и his1 (ADΔΔ), удаленные для устранения любых ложноположительных прототрофных трансформантов урацила или гистидина, возникающих в результате нежелательной интеграции в геномных локусах URA3 или HIS1. Удаление 7 основных мультилекарственных эффлюксных насосов23,указанных на фиг.1A, делает ADΔΔ чрезвычайно чувствительным к большинству ксенобиотиков. Мутантный транскрипционный фактор усиления функции Pdr1-3 вызывает конститутивную сверхэкспрессию гетерологичных мембранных белков, таких как Cdr1 (красные восьмиугольники на фиг.1A)после интеграции гетерологично-ORF-содержащей кассеты трансформации(рисунок 1A)в геномном локусе PDR5 (синий прямоугольник на фиг.1A)посредством двух гомологичных событий рекомбинации. Правильная локализация плазматической мембраны С-концевых mGFPHis помеченных белков может быть подтверждена конфокальной микроскопией(рисунок 1А),а метка His может быть использована для никель-аффинной очистки помеченного белка. Однако клонирование некоторых грибковых транспортеров ABC (например, Candida krusei ABC1)в плазмиды, полученные из pABC3, было невозможным, поскольку они не могли быть распространены в кишечной палочке из-за клеточной токсичности. Это побудило к разработке одноэтапного клонирования мембранных белков14,24, помеченных либо на их N-, либо на C-конце с различным сродством, эпитопом или репортерными метками непосредственно в S. cerevisiae ADΔΔ(рисунок 1C). S. cerevisiae Штаммы ADΔΔ, чрезмерно экспрессирующие различные мутанты CDR1, также могут быть эффективно созданы таким образом, используя до пяти отдельных фрагментов ПЦР, которые перекрываются на 25 bp(рисунок 1C). Используя этот протокол, многие интересующие ORF могут быть клонированы, выражены и охарактеризованы с низкой стоимостью и высокой эффективностью в течение очень короткого промежутка времени. Эффективность трансформации снижается всего в ~2 раза с каждым дополнительным фрагментом ПЦР. 

При желании уровнями выражений также можно легко манипулировать с помощью праймерного дизайна, чтобы предсказуемо настроить уровни выражений до 0,1%-50% от обычно высоких, конститутивных уровней выражения25. Оптимизированный, многофункциональный вектор клонированияpABC3 14, pABC3-XLmGFPHis26 (рисунок 1B)содержит участок расщепления протеазы HRV-3C (X; ЛЕВЛЬФК| GP), протеаза, которая работает лучше при 4 ° C, чем часто используемая протеаза вируса травля табака (TEV)27. L представляет собой линкер с пятью аминокислотами (GSGGS), mGFP представляет собой мономерный мутант (A206K)28,29 версию дрожжевого усиленного зеленофлуоресцентного варианта белка yEGFP330,а His представляет собой трехаломиновый линкер (GGS), за которым следует шестигистидинная (HHHHHH) никель-аффинная белковая очистка метка.

Эта технология экспрессии была успешно использована в открытии лекарств и изучении мембранных белков. Первая структура грибкового азолового препарата-мишени, S. cerevisiae Erg1131,была решена с использованием этой технологии. Это также позволило детально охарактеризовать C. albicans Cdr132, 33,34и создать молекулу Cdr1с дефицитом цистеина35, подходящую для исследований сшивания цистеина для проверки любой будущей структуры с высоким разрешением. Многие другие abc-транспортеры из основных грибковых патогенов человека (например, C. albicans, Candida glabrata, Candida auris, Candida krusei, Candida utilis, Cryptococcus neoformans, Aspergillus fumigatus, Penicillium marneffei и видовой комплекс Fusarium solani) также были подробно изучены с использованием этой платформы экспрессии24,36,37,38,39. Это позволило создать панель штаммов S. cerevisiae, чрезмерно экспрессирующих эфлюксные насосы, которые были использованы в высокопроизводительных экранах, чтобы обнаружить новую флуоресцентную подложку эфлюксного насоса Nile red40 и 41 и широкого спектра действия ингибиторов эфлюксного насоса14,33,43,44. Использование этой системы также позволило обнаружить клоргилин в качестве первого в своем роде грибкового ингибитора мультилекарственного эфлюксного насоса широкого спектра действия42.

Полная солюбилизация мембранных белков и создание однородного мембранного белково-мицеллевого препарата, лишенного эндогенных липидов, требует высоких концентраций детергентов45. Но, к сожалению, это также часто инактивирует мембранный белок5,8,45,46. На свойства моющих мономеров и их агрегацию в растворе влияют физические свойства гидрофобного хвоста, длина и ветвление алкильной цепи, наличие ароматического ядра или фторалкильной боковой цепи или количество полиоксиэтиленовых единиц. Таким образом, скрининг моющих средств является важным первым шагом для определения наиболее подходящего моющего средства для солюбилизации и очистки мембранного белка.

C. albicans является основным грибковым патогеном человека лиц с ослабленным иммунитетом, который может вызывать серьезные, опасные для жизни инвазивные инфекции47,и он может стать устойчивым к азоловым противогрибковым препаратам48,49. Одним из основных механизмов мультилекарственности C. albicans является сверхэкспрессия Cdr150,который является ПЕРЕНОСЧИКОМ51 подсемейства ABCG типа II, расположенным в плазматической мембране. Полноразмерные грибковые транспортеры ABCG (состоящие из двух нуклеотидсвязывающих доменов [NBD] и двух трансмембранных доменов [TMD]) более известны как переносчики плейотропной лекарственной устойчивости (PDR) и характеризуются их уникальной инвертированной доменной топологией [NBD-TMD]2. Транспортеры PDR встречаются только в растениях52,53 и грибах54. Несмотря на их важность, нет никаких конструкций для транспортеров PDR, хотя недавно были решены конструкции для транспортеров ABCG половинного размера, что помогло создать первую предварительную модель для Cdr133. Однако наши недавние экспериментальные данные свидетельствуют о том, что эта модель является ошибочной, возможно, потому, что грибковые транспортеры PDR имеют характерные асимметричные NBD, что, вполне возможно, приводит к уникальному транспортному механизму. Таким образом, структура Cdr1 с высоким разрешением необходима как для рационального проектирования новых ингибиторов эфлюксного насоса, которые могут помочь преодолеть опосредованную из потоком лекарственную устойчивость, так и для понимания механизма действия этого важного семейства транспортеров ABC.

Целью данного исследования была разработка надежных протоколов экспрессии, солюбилизации и очистки Cdr1 в генетически модифицированном хозяине экспрессии S. cerevisiae с конечной целью получения структуры высокого разрешения для Cdr1. В рамках этого процесса была разработана протеазно-расщепляемая двойная метка mGFPHis(рисунок 1B)с 16-остаточной линкером, отделяющей метку от C-конца Cdr1, что улучшило связывание прикрепленной 6x его метки сродства с никелем-аффинной смолой и позволило контролировать уровни экспрессии Cdr1 в живых клетках и во время всего процесса очистки. Также был разработан воспроизводимый протокол для мелкомасштабных дрожжевых препаратов белка плазматической мембраны, содержащих около 10% C. albicans Cdr1 (по оценкам окрашивания Кумасси после SDS-PAGE), который может быть использован для биохимической характеристики Cdr1.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. Подготовка свежих или замороженных запасов трансформационных компетентных ADΔ и ADΔΔ клеток

  1. Инокулировать 25 мл 2x YPCD [т.е. 2x YPD; 2% (мас./об.) дрожжевого экстракта, 2% (мас./об.) пептона, 4% (мас./об.) декстрозы), 0,079% (мас./об.) CSM (полная смесь добавок)]35 среды с одной дрожжевой колонией и инкубата в течение ночи (o/n) в течение 16 ч при 30 °C с встряхиванием при 200 оборотах в минуту (об/мин).
  2. Инокулировать 225 мл 2x YPCD среды 25 мл o/n культурой и проверить оптическую плотность клеток при 600 нм (OD600); OD600 обычно составляет ~0,5-1,0.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе убедитесь, что все материалы, необходимые для следующего эксперимента по преобразованию, легко доступны.
  3. Выращивайте культуру при 30 °C в течение еще ~6-8 ч с встряхиванием при 200 об/мин до тех пор, пока плотность клеток не достигнет OD600 ~ 6-8.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги выполняются при комнатной температуре (RT), если не указано иное.
  4. Собирают эти логарифмически-фазовые ячейки путем центрифугирования при 3000 х г в течение 3 мин.
  5. Повторно суспендировать клетки и дважды промыть их стерильной двойной дистиллированной водой (ddH2O; т.е. 200 мл, а затем 20 мл).
  6. Соберите клетки при 3000 х г в течение 3 мин.
  7. Медленно (т.е. добавляйте 30 равных аликвот замороженного раствора компетентных клеток (FCC) каждую минуту в течение 30 мин) повторно суспендируют гранулу ячейки в X мл FCC [5% (мас./об.) глицерина, 10% (v/v) диметилсульфоксида (DMSO)] на льду (где X = OD600;например, если OD600 = 6 повторное суспендирование в 6 мл или если OD600 = 3 повторное суспендирование в 3 мл).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Правильная композиция FCC имеет решающее значение для успеха трансформации.
  8. Держите клетки на льду в течение 2 ч перед трансформацией или храните аликвоты при -80 °C до тех пор, пока это не потребуется.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки ADΔ и ADΔΔ очень чувствительны к замораживанию. Таким образом, ячейки необходимо медленно охлаждать до -80 °C: поместить ледяные микроцентрифужные трубки, содержащие 50-600 мкл клеточных аликвот, в пластиковый ящик для хранения (RT). Поместите коробку в контейнер из полистирола большего размера (RT) и закройте контейнер фитинговой полистирольной крышкой. Затем поместите контейнер в морозильную камеру -80 °C.
    ВНИМАНИЕ: Медленное замораживание имеет решающее значение для выживания клеток.

2. Трансформация ADΔ и ADΔΔ с CaCDR1-XLmGFPHis и подтверждение правильных трансформантов путем колонии ПЦР и секвенирования ДНК

ПРИМЕЧАНИЕ: Плазмида pABC3-CDR1-mGFPHis была создана с использованием обычных стратегий клонирования, подробно описанных в Lamping et al., 201055 и проиллюстрированных на рисунке 1B. Дикий тип C. albicans CDR1 был выделен как фрагмент PacI/NotI из плазмиды pABC3-CaCDR1A-GFP14 и клонирован в pABC3-XLmGFPHis26.

  1. ПЦР амплируют всю кассету трансформации CDR1 высокоточной ДНК-полимеразой и праймерной парой PDR5-pro/PDR5-ter35 с использованием 1-10 нг pABC3-CaCDR1-XLmGFPHis в качестве шаблона ДНК или, альтернативно, переваривают 2 мкг pABC3-CaCDR1-XLmGFPHis до завершения с 10 U рестрикционным ферментом AscI при 37 °C(Рисунок 1A,B).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Кассета преобразования CDR1 (рисунок 1A)содержит промоутер PDR5 - CaCDR1-mGFPHis - терминатор PGK1 - маркер выбора URA3 - нисходящую область PDR5.
  2. Выполните электрофорез агарозного геля и экстракт геля на кассете трансформации ~8 kb.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Гелевая очистка кассеты трансформации CaCDR1 ~8 кб удаляет любую возможную непереваренную плазмидную ДНК, что может привести к неправильным трансформантам, которые имеют всю плазмиду, а не кассету линейного преобразования, интегрированную в геномный локус PDR5.
  3. Денектура необходимого количества ДНК носителя спермы лосося (2 мг/мл; 10 мМ Трис, 1 мМ ЭДТА; рН 7,5) в течение 10 мин на кипящей водяной бане и держать на льду. Используйте завинчивающиеся трубки для кипячения ДНК сперматозоидов лосося, чтобы избежать открытия крышки.
  4. Смешайте 50 мкл денатурированной ДНК сперматозоидов лосося с 14 мкл кассеты трансформации (500-2000 нг) и держите 64 мкл смеси ДНК на льду до дальнейшего использования.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте 10 нг плазмиды E. coli-дрожжевого челночного челночного (например, pYES2) в качестве положительного контроля трансформации(рисунок 2B).
  5. Повторно суспендировать свежие или замороженные грамотные клетки, быстро размораживают в течение 5 мин на водяной бане 30 °C и делят их на 50 мкл аликвот в микроцентрифужных трубках объемом 1,5 мл.
  6. Заготавливайте клетки центрифугированием в течение 1 мин в микрофуге на максимальной скорости (18 000 х г).
  7. Удалите супернатант и сохраните ячейку гранулы на RT.
  8. Для каждой трансформации смешайте 296 мкл комбинаций (RT) 260 мкл 50% (мас./об.) полиэтиленгликоля (PEG 3350) и 36 мкл 1 М ацетата лития (LiAc) путем повторного пипетирования с соответствующими 64 мкл ледяных смесей ДНК.
  9. Немедленно добавьте соответствующую смесь в 50 мкл компетентную ячейку гранулы аликвоты.
  10. Повторно суспендируют клеточную гранулу в 360 мкл смеси PEG-LiAc-ДНК путем тщательного вихря в течение примерно 30 с.
  11. Инкубировать клеточную смесь на водяной бане при 30 °C в течение 1 ч.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Ячейки ADΔ и ADΔΔ лучше преобразуются при 30 °C, чем при 42 °C35.
  12. Собирайте клетки при 18 000 х г в течение 10 с. Откажитесь от супернатанта и повторно суспендьте ячейку гранулы в 80 мкл ddH2O.
  13. Распределите клетки на агаровую пластинуCSM-URA 35 [т.е. 0,67% (мас./об.) дрожжевого азотного основания без аминокислот, 0,077% (мас./об.) CSM минус урацил, 2% (мас./об.) глюкозы и 2% (мас./об.) агара].
  14. Инкубировать пластины в течение 2-3 дней при 30 °C до тех пор, пока не будут хорошо видны прототрофные трансфоранты урацила.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Ожидайте ~100 трансформаторов на мкг линейной кассеты преобразования CaCDR1 ~8 кб и ~4 x 104 трансформаторов на мкг pYES2.
  15. Выберите пять независимых трансформантов и распределите их на свежую пластину CSM-URA, чтобы отделить прототрофные трансформанты урацила от остатков нетрансформированных клеток-хозяев.
  16. Удалите все возможные миниатюрные мутанты, вырастив трансформанты на пластинах YPG-агара [1% (мас./об.) дрожжевого экстракта, 2% (мас./об.) пептона, 2% (в/об.) глицерина и 2% (мас./об.) агара](рисунок 2D).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Маленькие мутанты имеют дефектные митохондрии и, таким образом, не могут расти на неферментируемых источниках углерода. Они довольно распространены у S. cerevisiae56. S. cerevisiae ADΔ и ADΔΔ особенно склонны к приобретению петитфенотипа.
  17. Выполните ПЦР колонии дрожжей и подтвердите, что по крайней мере три независимых трансформанта правильно интегрированы в геномный локус PDR5 (рисунок 1C),амплифицировка всей кассеты трансформации CaCDR1 ~8 кб специфической ДНК-полимеразой, оптимизированной для амплиации продуктов ПЦР из нечистых источников шаблона ДНК. Используйте набор праймеров, которые связываются непосредственно за пределами места интеграции, и 1 мкл аликвот клеточных суспензий (в ddH2O), полученных из отдельных колоний, в качестве шаблонов ДНК.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эта конкретная ДНК-полимераза надежно усиливает ~ 8 кб фрагментов ПЦР из неповрежденных дрожжевых клеток. Однако для надежной амплификации требуется 45 циклов ПЦР, и дрожжевые клетки должны быть повторно суспендированы при OD600 1-10 в ddH2O.
  18. Подтвердите правильный продукт амплификации ПЦР ~8 кб электрофорезом ДНК-агарозного геля 1 мкл части реакции ПЦР.
  19. Удалите избыточные амплификационные праймеры из 10-мкл-секции реакции ПЦР ферментной смесью одноцепочечной ДНК-экзонуклеазы и фосфатазы в соответствии с инструкциями производителя перед секвенированием всего ОВФ с использованием частей обработанного образца ДНК с соответствующими праймерами.

3. Протокол изоляции плазматической мембраны маломасштабных дрожжей

  1. Выращивание дрожжевых клеток
    1. Предварительно культивировали одну колонию дрожжей в 10 мл СС при 30 °C в течение ~7-8 ч с встряхиванием при 200 об/мин.
    2. Инокулируют 40 мл среды YPD предварительной культурой 10 мл и инкубируют клетки при 30 °C o/n (~16 ч) с встряхиванием при 200 об/мин до тех пор, пока плотность клеток не достигнет OD600 1-3.
  2. Сбор дрожжевых клеток
    1. Соберите 40 единиц OD (ODU; например, 1 мл при OD600 1 = 1 ODU) логарифмических фазовых ячеек при 4 200 х г в течение 5 мин при 4 °C.
    2. Повторно суспендировать и промыть клетки дважды ледяным холодным стерильным ddH2O (т.е. 40 мл, а затем 1 мл; собирать клетки между этапами центрифугированием при 4,200 х г в течение 5 мин при 4 °C).
    3. Повторно суспендируют гранулу в 1 мл ледяного холодного стерильного ddH2O и переложат клеточную суспензию в предварительно охлажденный (на льду) 1,5 мл микроцентрифужную трубку.
    4. Собирайте ячейки при 3 300 х г в течение 3 мин при 4 °C.
    5. Аспирировать супернатанта.
    6. Повторно суспендируют клеточную гранулу в гомогенизирующий буфер 0,5 мл [HB; 50 мМ Tris, 0,5 мМ ЭДТА, 20% (v/v) глицерин; pH 7,5], только что дополненный 1 мМ фенилметилсульфонилфторидом (PMSF).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда добавляйте PMSF свежим, потому что PMSF быстро инактивируется при воздействии воды.
      ВНИМАНИЕ: PMSF является ингибитором серинпротеазы, который чрезвычайно коррозионный и разрушительный для тканей. Это может привести к необратимому повреждению глаз.
    7. Храните клеточную суспензию при -80 °C или используйте немедленно.
  3. Изоляция плазматических мембран
    1. Если заморожены, разморозить клетки на льду в течение ~1 ч.
    2. Добавьте ледяные шарики кремнезема диаметром 0,5 мм к суспензии ячейки 0,5 мл, чтобы достичь общего объема 1 мл.
    3. Разбейте клетки с 6 циклами вихря при максимальной интенсивности встряхивания в течение 1 мин, перемежаясь с 3 мин периодами охлаждения на льду.
    4. Сделайте тонкое отверстие на дне трубки с помощью нагретого лезвия скальпеля.
    5. Соберите гомогенат сломанной ячейки через дно трубки, установленной в другой ледяной микроцентрифужной трубке 1,5 мл с низкоскоростным (~ 200 об/мин) вращением 10 с.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это гарантирует, что шарики кремнезема останутся в исходной трубке.
    6. Центрифугируют гомогенат клеток при 5,156 х г в течение 5 мин при 4 °C для удаления клеточного мусора, неразрывных клеток и ядер.
    7. Переложите 450 мкл супернатанта в ледяную микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл и добавьте еще 1 мл ледяного HB, дополненного свежим PMSF (1 мМ).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап разведения имеет решающее значение для восстановления высококачественного белка плазматической мембраны.
    8. Собирают плазматические мембраны при 17,968 х г в течение 1 ч при 4 °C и повторно суспендируют гранулу плазматической мембраны путем повторного пипетирования в 100 мкл HB, только что дополненного 1 мМ PMSF. Ослабьте гранулу клетки для правильной гомогенизации плазматической мембраны, перемешав гранулу клетки наконечником пипетки 100 мкл перед высвобождением 100 мкл HB и пипеткой вверх и вниз.
    9. Измерьте концентрацию белка препарата плазматической мембраны с помощью набора для анализа белка, совместимого с буферами, содержащими восстановительный агент и моющее средство.
    10. Храните плазматические мембраны при -80 °C или храните на льду для немедленного использования.

4. Электрофорез полиакриламидного геля додецилсульфата натрия (SDS-PAGE)

  1. Соберите аппарат для приготовления полиакриламидных гелей.
  2. Для двух разделяющих гелей (7% полиакриламида) смешайте 2,1 мл 40% акриламида/бис-акриламида, 3 мл 4-кратного разделительного буфера (1,5 М Трис, 0,4% додецилсульфата натрия [SDS] (мас./об);рН 8,8) и 6,9 мл ddH2O. Добавьте 8 мкл тетраметилэтилендиамина (TEMED) и 60 мкл 10% персульфата аммония (APS), чтобы инициировать полимеризацию акриламида.
    ВНИМАНИЕ: Акриламид/бис-акриламид очень токсичен. Он вызывает раздражение кожи, периферическую невропатию и является канцерогеном. TEMED вреден при проглатывании или вдыхании. АФС вреден при проглатывании. Вызывает серьезные раздражения глаз и кожи.
  3. Налейте ~4-5 мл этой смеси в собранный гель-аппарат, до ~2 см сверху.
  4. Осторожно наложите ~ 1-2 мл 0,1% SDS сверху, чтобы создать планарный мениск.
  5. Дайте полиакриламиду заготовиться в течение ~60 мин при RT.
  6. Приготовьте смесь гелевого укладки для двух гелей, смешивая 0,5 мл 40% акриламида/бис-акриламида, 1 мл 4-кратного буфера укладки (0,5 М Трис, 0,4% SDS (мас./об.); рН 6,8) и 6,9 мл ddH2O. Добавьте 2 мкл TEMED и 30 мкл 10% APS, чтобы начать полимеризацию акриламида.
  7. Удалите слой SDS 0,1% из полимеризованного разделительного геля и промойте ddH2O, чтобы удалить следы SDS.
  8. Налейте смесь геля для укладки на разделительные гели.
  9. Поместите расческу в гель для укладки и удалите пузырьки воздуха вокруг гребня.
  10. Дайте укладывать гель в течение ~60 мин при RT.
  11. Снимите расческу и промойте гелевые прорези водой. Поместите гель в гелевой резервуар и заполните гель-резервуар сверху 1x бегущим буфером (24,8 мМ Tris, 190 мМ глицина, 0,1% SDS).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте 1-кратный работающий буфер из 10-кратного буферного запаса (248 мМ Tris, 1,9 М глицина, 1% SDS (с/в) в ddH2O), хранящегося в RT.
  12. Смешайте образцы плазматической мембраны 5-10 мкл (т.е. 10-20 мкг белка) с равными объемами 2-кратного красителя для загрузки белка [120 мМ Tris-HCl (рН 6,8), 20% глицерина, 0,02% бромфенола синего, 4% SDS, 200 мМ дитиотрейтола (DTT)] и немедленно загрузите в отдельные гелевые щели, погруженные в работающий буфер.
    ВНИМАНИЕ: DTT вреден при проглатывании. Вызывает серьезные раздражения глаз и кожи.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Сделайте 10 мл запаса 2x белкового красителя, аликвоты и храните при -20 °C. Не нагревайте смешанные образцы, а немедленно загружайте их в отдельные гелевые пазы, чтобы метка GFP не денатурировалась, и можно было обнаружить сигналы флуоресценции в геле.
  13. Загрузите маркеры молекулярной массы белка (диапазон 10-245 кДа) в отдельный слот, чтобы можно было оценить размер отдельных фрагментов белка.
  14. Выполняют гель-электрофорез при 200 В до тех пор, пока синий нагрузочный краситель не достигнет дна геля (обычно 45-55 мин).
  15. Исследуйте гель на наличие геля на GFP-флуоресценцию с помощью гелевой системы визуализации (длины волн возбуждения и излучения составляют 475-485 нм и 520 нм соответственно).
  16. После визуализации флуоресценции в геле фиксируют белки путем мягкого перемешивания геля в ~10-20 мл раствора для фиксации белкового геля (40% этанола, 10% уксусной кислоты) в течение 15 мин при RT.
  17. Промыть гель дважды в течение 10 мин 10 мл ddH2O и визуализировать белковые полосы, поместив гель в 10 мл коллоидного раствора для окрашивания Coomassie с мягким встряхиванием в течение ~ 1 ч при RT.
  18. Для улучшения визуализации белковых полос обезкрасить гель один или два раза в ~20 мл ddH2O в течение ~1 ч перед записью изображений с помощью гелевой системы визуализации.

5. Определение деятельности Cdr1 ATPase 57

  1. Разбавляем образцы плазматической мембраны >2,2 мг/мл до 1-2 мг/мл в ГВ.
  2. Уравновешивайте коктейль для анализа АТФазы (75 мМ MES-Tris, 75 мМ нитрата калия, 0,3 мМ молибдата аммония, 7,5 мМ азида натрия; рН 7,5) и Mg-АТФ (28,8 мМ АТФ динатриевой соли, 28,8 мМ MgCl2;рН 7,0) до 30 °C в инкубаторе с 30 °C.
    ВНИМАНИЕ: Азид натрия очень токсичен.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что все буферные запасы и бутылки не содержит фосфатов; т.е. промыть стеклянную посуду с 1% (об/об) HCl и промыть ее несколько раз ddH2O. Кроме того, держите его отдельно от другой стеклянной посуды, которая, вероятно, содержит следы фосфата, обычно присутствующего в моющих средствах, используемых для мытья стеклянной посуды.
  3. Добавьте 90 мкл пробирного коктейля с ингибитором Cdr1-АТФазы или без него (20 мкМ олигомицина) в отдельные колодцы 96-скважинной микротитровой пластины.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Анализ выполняется в трех разах.
  4. Добавьте 5 мкл изолированных плазматических мембран (~5-10 мкг белка) или фосфатных стандартов (0-100 нмоль Pi) в соответствующие колодцы микротитрой пластины.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Сохраните первую и последнюю колонки для двух отдельных наборов стандартов на фосфаты.
  5. Начинают анализ с добавления 25 мкл предварительно высужденного 28,8 мМ Mg-АТФ (конечная концентрация 6 мМ) с многоканальной пипеткой в отдельные скважины и инкубируют при 30 °C в течение 30 мин.
  6. Остановить реакцию можно добавлением 130 мкл реагента развития (1,6% L-аскорбата натрия, 1% SDS, 12% молибдата аммония в 6 М серной кислоты).
    ВНИМАНИЕ: Концентрированная серная кислота бурно реагирует с водой. Он коррозионный и может вызвать повреждение кожи и легких.
  7. Инкубировать в RT в течение 10 мин.
  8. Считывание поглощения микротитрных пластинчатых колодцев при 750 нм с помощью считывателя микротитерных пластин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Соблюдение 10-минутного времени инкубации для развития синего красителя (т.е. восстановленного фосфорно-молибденового комплекса) имеет решающее значение для точности анализа, поскольку развитие синего красителя продолжается со временем.
  9. Получение Cdr1-специфической активности АТФазы (т.е. активности Олигомицин-чувствительной АТФазы) путем вычитания активности АТФазы в присутствии олигомицина из общей активности АТФазы в отсутствие олигомицина.

6. Мелкомасштабный моющий экран

  1. Комбинируйте препараты плазматической мембраны (т.е. 2,5 мг белка плазматической мембраны) клеток, чрезмерно экспрессирующих Cdr1-mGFPHis, с буфером GTED-20 [10 мМ Tris, 0,5 мМ ЭДТА, 20 % (мас./об.) глицерина; рН 7,5; только что дополненным 1 мМ PMSF], содержащим 5 мг испытуемого моющего средства, чтобы достичь общего объема 0,5 мл, дополненного 1% (мас./об.) моющим средством.
  2. Вращайте смесь при 4-8 °C в течение 2 ч, с помощью устройства вращения.
  3. Центрифугировать смесь при 141 000 х г при 4 °C в течение 1 ч.
  4. Перенесите супернатант, содержащий солюбилизированный материал, в свежую микроцентрифужную трубку.
  5. Добавьте 0,5 мл буфера GTED-20, дополненного 2% (мас./об.) SDS к нерастворимой фракции гранул, и инкубируйте при 30 °C o/n в встряхивающем инкубаторе для извлечения всего нерастворимого в моющем средстве мембранного белка.
  6. Анализ и сравнение фракций супернатантов и солюбилизированных гранул с помощью SDS-PAGE.
  7. Сфотографируйте гели, содержащие белки с GFP-метками, для флуоресценции GFP в геоле перед окрашиванием Coomassie и количественно оцените уровни экспрессии с помощью системы визуализации.
  8. Используйте фракцию растворимого мембранного белка для последующих применений, таких как флуоресцентная хроматография (FSEC)58 для определения подходящего моющего средства.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Высокая частота превращения S. cerevisiae ADΔΔ (~4 x 104 трансформантов/мкг) была достигнута с помощью pYES2(рисунок 2B). Как и ожидалось, управление без ДНК (т.е.толькоddH 2 O) не давало трансформаторов, а 1 мкг линейной кассеты преобразования CDR1-mGFPHis (?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Несмотря на недавний прогресс в структурном анализе мембранных белков, в настоящее время нет 3D-структуры для Cdr1 или любого другого транспортера PDR. Таким образом, получение знаний о структуре Cdr1 и ее биохимических особенностях важно, поскольку это не только даст представление о рациона...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Авторы с благодарностью отмечают финансирование из Новозеландского фонда Марсдена (грант UOO1305) и блочный грант от медицинского факультета Университета Чулалонгкорн, Бангкок, Таиланд (М. Ниими). Они хотели бы поблагодарить Университет Отаго за предоставление Г. Мадани стипендии PhD. Авторы также хотели бы выразить свою благодарность профессору Штефану Раунсеру и его коллегам, доктору Амиру Апельбауму и доктору Дейванаягабарати Винаягаму, за их поддержку и руководство во время 6-месячного визита Г. Мадани в Институт молекулярной физиологии Макса Планка (MPIMP), Дортмунд, Германия. Авторы также благодарят Немецкую службу академических обменов (DAAD) за предоставление Г. Мадани исследовательского гранта (57381332) для посещения MPIMP.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
2-(N-Morpholino)ethane-sulphonic acid (MES)Sigma-AldrichM3671
2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol (Tris base; ultra-pure)Merck77-86-1
2,2-Didecylpropane-1,3-bis-β-D-maltopyranosideAnatraceNG310SLMNG
2,2-Dihexylpropane-1,3-bis-β-D-glucopyranosideAnatraceNG311SOGNG (MNG-OG)
2,2-Dioctylpropane-1,3-bis-β-D-maltopyranosideAnatraceNG322SDMNG
4-Trans-(4-trans-propylcyclohexyl)-cyclohexyl α-D-maltopyranosideGlycon Biochemicals GmbHD99019-CPCC-α-M
40% Acrylamide/Bis-acrylamide (37.5:1)Bio-Rad1610148
Acetic acid (glacial)Merck64-19-7
AgarFormedium 009002-18-0
Ammonium molybdateSigma-Aldrich13106-76-8
Ammonium persulphate (APS)Bio-Rad1610700
ATP disodium saltsigma-AldrichA-6419
Bromophenol blueSERVA Electrophoresis GmbH34725-61-6
CHAPSAnatraceC316S
CHAPSOAnatraceC317S
CSMFormediumDCS0019
CSM minus uracilFormediumDCS0161
Cyclohexyl-1-butyl-β-D-maltopyranosideAnatraceC324SCYMAL-4
Cyclohexyl-1-heptyl-β-D-maltopyranosideAnatraceC327SCYMAL-7
Cyclohexyl-methyl-β-D-maltopyranosideAnatraceC321SCYMAL-1
DigitoninSigma-Aldrich11024-24-1
Dithiothreitol (DTT)Roche Diagnostics10197785103
DMSOMerck67-68-5
EthanolMerck459836
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA; Titriplex III)Merck6381-92-6
ExoSAP-IT PCR Product Cleanup ReagentApplied Biosystems78205A blend of exonuclease and phosphatase
GlucoseFormedium50-99-7
GlycerolMerck56-81-5
GlycineMerckG8898
HEPESFormedium7365-45-9
Hydrochloric acidMerck1003172510
KOD Fx NeoTOYOBO CoKFX-201Use for reliable colony PCR
lithium acetate (LiAc)Sigma-Aldrich546-89-4
Magnesium chloride hexa-hydratesigma-AldrichM2393
MESFormedium145224-94-8
n-Decanoyl-N-hydroxyethyl-glucamideAnatraceH110SHEGA-10
n-Decanoyl-N-methyl-glucamideAnatraceM320SMEGA-10
n-Decyl-phosphocholineAnatraceF304SFos-choline-10
n-Decyl-β-D-maltopyranosideAnatraceD322SDM
n-Dodecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulphonateAnatraceAZ312SAnzergent 3-12
n-Dodecyl-N,N-dimethylamine-N-oxideAnatraceD360SLDAO
n-Dodecyl-α-D-maltopyranosideAnatraceD310HAα-DDM
n-Dodecyl-β-D-maltopyranosideAnatraceD310Sβ-DDM
n-Nonyl-β-D-glucopyranosideAnatraceN324SNG
n-Nonyl-β-D-maltopyranosideAnatraceN330SNM
n-Octadecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulphonateAnatraceAZ318SAnzergent 3-18
n-Octyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulphonateAnatraceAZ308SAnzergent 3-8
n-Octyl-phosphocholineAnatraceF300SFos-choline-8
n-Octyl-β-D-glucopyranosideAnatraceO311SOG
n-Tetradecyl-phosphocholineAnatraceF312SFos-choline-14
n-Tetradecyl-β-D-maltopyranosideAnatraceT315STDM
n-Tridecyl-phosphocholineAnatraceF310SFos-choline-13
n-Tridecyl-β-D-maltopyranosideAnatraceT323S-
n-Undecyl-β-D-maltopyranosideAnatraceU300SUM (UDM)
N,N,N’,N’-tetramethyl-ethylenediamine (TEMED)Sigma-AldrichT9281
OctylphenoxypolyethoxyethanolSigma-Aldrich9002-93-1TRITON X-100
OligomycinSigma-Aldrich75351
PeptoneFormedium3049-73-7
phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)Roche Diagnostics329-98-6
Phusion Hot Start Flex DNA PolymeraseNew England BiolabsM0535SHigh-fidelity DNA polymerase
polyethylene glycol (PEG 3350)Sigma-Aldrich25322-68-3
polyoxyethylenesorbitan monooleateSigma-Aldrich9005-65-6TWEEN 80
Potassium nitrateSigma-AldrichP8394
Protein Assay KitBio-Rad5000122RC DC Protein Assay Kit II
QC Colloidal Coomassie StainBio-Rad1610803
Prism Ultra Protein Ladder (10-245 kDa)AbcamAB116028
Sodium azideSigma-Aldrich71289
Sodium dodecyl sulphateSigma-Aldrich151-21-3SDS
Sodium L-ascorbate BioXtraSigma-Aldrich11140
Sucrose MonododecanoateAnatraceS350SDDS
Sulphuric acidSigma-Aldrich339741
Yeast extractFormedium008013-01-2
Yeast nitrogen base without amino acidsFormediumCYN0402
 Equipment (type)
Centrifuge  (Eppendorf 5804)Eppendorf
Centrifuge (Beckman Ultra)Beckman
Centrifuge (Sorvall RC6)Sorvall
FSEC apparatus (NGC Chromatography Medium Pressure system equipped with a fluorescence detector, an autosampler, a fractionator)Bio-Rad
Gel imaging (GelDoc EZ Imager)Bio-Rad
Microplate reader (Synergy 2 Multi-Detection)BioTek Instruments
PCR thermal cycler (C1000 Touch)Bio-Rad
Power supply (PowerPac)Bio-Rad
SDS PAGE (Mini-PROTEAN Tetra)Bio-Rad
Shaking incubator (Multitron)Infors HT, Bottmingen
Superose 6 Increase 10/300 GLGE Healthcare Life SciencesGE17-5172-01
UV/Visible spectrophotometer (Ultraspec 6300 pro)Amersham BioSciences UK Ltd

Ссылки

  1. Arachea, B. T., et al. Detergent selection for enhanced extraction of membrane proteins. Protein Expression and Purification. 86 (1), 12-20 (2012).
  2. Guo, Y. Be cautious with crystal structures of membrane proteins or complexes prepared in detergents. Crystals (Basel). 10 (2), 86(2020).
  3. Lewinson, O., Orelle, C., Seeger, M. A. Structures of ABC transporters: handle with care. FEBS Letters. 594 (23), 3799-3814 (2020).
  4. Luckey, M. Membrane Structural Biology: With Biochemical and Biophysical Foundations. , Cambridge University Press. Ch. 4 69-105 (2014).
  5. Opekarova, M., Tanner, W. Specific lipid requirements of membrane proteins--a putative bottleneck in heterologous expression. Biochimica et Biophysica Acta. 1610 (1), 11-22 (2003).
  6. Qiu, W., et al. Structure and activity of lipid bilayer within a membrane-protein transporter. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (51), 12985-12990 (2018).
  7. Dowhan, W. Molecular basis for membrane phospholipid diversity: why are there so many lipids. Annual Review of Biochemistry. 66, 199-232 (1997).
  8. Lee, A. G. Lipid-protein interactions in biological membranes: a structural perspective. Biochimica et Biophysica Acta. 1612 (1), 1-40 (2003).
  9. Ahn, J. H., Pan, J. G., Rhee, J. S. Homologous expression of the lipase and ABC transporter gene cluster, tliDEFA, enhances lipase secretion in Pseudomonas spp. Applied and Environmental Microbiology. 67 (12), 5506-5511 (2001).
  10. Newby, Z. E., et al. A general protocol for the crystallization of membrane proteins for X-ray structural investigation. Nature Protocols. 4 (5), 619-637 (2009).
  11. Parker, J. L., Newstead, S. Membrane protein crystallisation: current trends and future perspectives. Advances in Experimental Medicine and Biology. 922, 61-72 (2016).
  12. Wiener, M. C. A pedestrian guide to membrane protein crystallization. Methods. 34 (3), 364-372 (2004).
  13. Grisshammer, R. Understanding recombinant expression of membrane proteins. Current Opinion in Biotechnology. 17 (4), 337-340 (2006).
  14. Lamping, E., et al. Characterization of three classes of membrane proteins involved in fungal azole resistance by functional hyperexpression in Saccharomyces cerevisiae. Eukaryot Cell. 6 (7), 1150-1165 (2007).
  15. Macauley-Patrick, S., Fazenda, M. L., McNeil, B., Harvey, L. M. Heterologous protein production using the Pichia pastoris expression system. Yeast. 22 (4), 249-270 (2005).
  16. Focke, P. J., et al. Combining in vitro folding with cell free protein synthesis for membrane protein expression. Biochemistry. 55 (30), 4212-4219 (2016).
  17. Reckel, S., et al. Strategies for the cell-free expression of membrane proteins. Methods in Molecular Biology. 607, 187-212 (2010).
  18. Pandey, A., Shin, K., Patterson, R. E., Liu, X. Q., Rainey, J. K. Current strategies for protein production and purification enabling membrane protein structural biology. Biochemistry and Cell Biology. 94 (6), 507-527 (2016).
  19. Harvey, C. J. B., et al. HEx: A heterologous expression platform for the discovery of fungal natural products. Science Advances. 4 (4), (2018).
  20. Kingsman, S. M., Kingsman, A. J., Dobson, M. J., Mellor, J., Roberts, N. A. Heterologous gene expression in Saccharomyces cerevisiae. Biotechnology & Genetic Engineering Reviews. 3, 377-416 (1985).
  21. Monk, B. C., et al. Yeast membrane protein expression system and its application in drug screening. US patent. , 8728797 NZ 513755, AU 2002330796, US 8728797 patent NZ 513755, AU 2002330796 (2002).
  22. Sagatova, A. A., Keniya, M. V., Wilson, R. K., Monk, B. C., Tyndall, J. D. Structural insights into binding of the antifungal drug fluconazole to Saccharomyces cerevisiae lanosterol 14alpha-demethylase. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (8), 4982-4989 (2015).
  23. Decottignies, A., et al. ATPase and multidrug transport activities of the overexpressed yeast ABC protein Yor1p. The Journal of Biological Chemistry. 273 (20), 12612-12622 (1998).
  24. Lamping, E., Zhu, J. Y., Niimi, M., Cannon, R. D. Role of ectopic gene conversion in the evolution of a Candida krusei pleiotropic drug resistance transporter family. Genetics. 205 (4), 1619-1639 (2017).
  25. Lamping, E., Niimi, M., Cannon, R. D. Small, synthetic, GC-rich mRNA stem-loop modules 5' proximal to the AUG start-codon predictably tune gene expression in yeast. Microbial Cell Factories. 12, 74(2013).
  26. James, J. E., Lamping, E., Santhanam, J., Cannon, R. D. PDR transporter ABC1 is involved in the innate azole resistance of the human fungal pathogen Fusarium keratoplasticum. Frontiers in Microbiology. , (2021).
  27. Ullah, R., et al. Activity of the human rhinovirus 3C protease studied in various buffers, additives and detergent solutions for recombinant protein production. PLoS One. 11 (4), 0153436(2016).
  28. von Stetten, D., Noirclerc-Savoye, M., Goedhart, J., Gadella, T. W., Royant, A. Structure of a fluorescent protein from Aequorea victoria bearing the obligate-monomer mutation A206K. Acta Crystallographica Section F. Structural Biology and Crystalization Communications. 68, Pt 8 878-882 (2012).
  29. Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells. Science. 296 (5569), 913-916 (2002).
  30. Cormack, B. P., et al. Yeast-enhanced green fluorescent protein (yEGFP): a reporter of gene expression in Candida albicans. Microbiology (Reading). 143, Pt 2 303-311 (1997).
  31. Monk, B. C., et al. Architecture of a single membrane spanning cytochrome P450 suggests constraints that orient the catalytic domain relative to a bilayer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (10), 3865-3870 (2014).
  32. Holmes, A. R., et al. ABC transporter Cdr1p contributes more than Cdr2p does to fluconazole efflux in fluconazole-resistant Candida albicans clinical isolates. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 52 (11), 3851-3862 (2008).
  33. Tanabe, K., et al. FK506 resistance of Saccharomyces cerevisiae Pdr5 and Candida albicans Cdr1 involves mutations in the transmembrane domains and extracellular loops. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 63 (1), 01146(2019).
  34. Tanabe, K., et al. Chimeras of Candida albicans Cdr1p and Cdr2p reveal features of pleiotropic drug resistance transporter structure and function. Molecular Microbiology. 82 (2), 416-433 (2011).
  35. Madani, G., Lamping, E., Cannon, R. D. Engineering a cysteine-deficient functional Candida albicans Cdr1 molecule reveals a conserved region at the cytosolic apex of ABCG transporters important for correct folding and frafficking of Cdr1. mSphere. 6 (1), (2021).
  36. Lamping, E., et al. Abc1p is a multidrug efflux transporter that tips the balance in favor of innate azole resistance in Candida krusei. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (2), 354-369 (2009).
  37. Panapruksachat, S., et al. Identification and functional characterization of Penicillium marneffei pleiotropic drug resistance transporters ABC1 and ABC2. Medical Mycology. 54 (5), 478-491 (2016).
  38. Wada, S., et al. Phosphorylation of Candida glabrata ATP-binding cassette transporter Cdr1p regulates drug efflux activity and ATPase stability. The Journal of Biological Chemistry. 280 (1), 94-103 (2005).
  39. Watanasrisin, W., et al. Identification and characterization of Candida utilis multidrug efflux transporter CuCdr1p. FEMS Yeast Research. 16 (4), (2016).
  40. Ivnitski-Steele, I., et al. Identification of Nile red as a fluorescent substrate of the Candida albicans ATP-binding cassette transporters Cdr1p and Cdr2p and the major facilitator superfamily transporter Mdr1p. Analytical Biochemistry. 394 (1), 87-91 (2009).
  41. Niimi, K., et al. Specific interactions between the Candida albicans ABC transporter Cdr1p ectodomain and a D-octapeptide derivative inhibitor. Molecular Microbiology. 85 (4), 747-767 (2012).
  42. Holmes, A. R., et al. The monoamine oxidase A inhibitor clorgyline is a broad-spectrum inhibitor of fungal ABC and MFS transporter efflux pump activities which reverses the azole resistance of Candida albicans and Candida glabrata clinical isolates. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 56 (3), 1508-1515 (2012).
  43. Reis de Sa, L. F., et al. Synthetic organotellurium compounds sensitize drug-resistant Candida albicans clinical isolates to fluconazole. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 61 (1), 01231(2017).
  44. Tanabe, K., et al. Inhibition of fungal ABC transporters by unnarmicin A and unnarmicin C, novel cyclic peptides from marine bacterium. Biochemical and Biophysical Research Communications. 364 (4), 990-995 (2007).
  45. le Maire, M., Champeil, P., Moller, J. V. Interaction of membrane proteins and lipids with solubilizing detergents. Biochimica et Biophysica Acta. 1508 (1-2), 86-111 (2000).
  46. Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera. Biochimica et Biophysica Acta. 1666 (1-2), 105-117 (2004).
  47. Pfaller, M. A. Nosocomial candidiasis: emerging species, reservoirs, and modes of transmission. Clinical Infectious Diseases. 22, Suppl 2 89-94 (1996).
  48. Cannon, R. D., et al. Efflux-mediated antifungal drug resistance. Clinical Microbiology Reviews. 22 (2), 291-321 (2009).
  49. Sanglard, D., et al. Mechanisms of resistance to azole antifungal agents in Candida albicans isolates from AIDS patients involve specific multidrug transporters. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 39 (11), 2378-2386 (1995).
  50. Prasad, R., De Wergifosse, P., Goffeau, A., Balzi, E. Molecular cloning and characterization of a novel gene of Candida albicans, CDR1, conferring multiple resistance to drugs and antifungals. Current Genetics. 27 (4), 320-329 (1995).
  51. Lamping, E., Madani, G., Lee, H. J., Niimi, M., Cannon, R. D. Candida albicans: Cellular and Molecular Biology. Prasad, R. , Chapter 18 379-406 (2017).
  52. Crouzet, J., Trombik, T., Fraysse, A. S., Boutry, M. Organization and function of the plant pleiotropic drug resistance ABC transporter family. FEBS Letters. 580 (4), 1123-1130 (2006).
  53. Kang, J., et al. Plant ABC Transporters. Arabidopsis Book. 9, 0153(2011).
  54. Lamping, E., et al. Fungal PDR transporters: phylogeny, topology, motifs and function. Fungal Genetics and Biology. 47 (2), 127-142 (2010).
  55. Lamping, E., Cannon, R. D. Use of a yeast-based membrane protein expression technology to overexpress drug resistance efflux pumps. Methods in Molecular Biology. 666, 219-250 (2010).
  56. Day, M. Yeast petites and small colony variants: for everything there is a season. Advances in Applied Microbiology. 85, 1-41 (2013).
  57. Niimi, K., et al. Chemosensitization of fluconazole resistance in Saccharomyces cerevisiae and pathogenic fungi by a D-octapeptide derivative. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 48 (4), 1256-1271 (2004).
  58. Kawate, T., Gouaux, E. Fluorescence-detection size-exclusion chromatography for precrystallization screening of integral membrane proteins. Structure. 14 (4), 673-681 (2006).
  59. Hao, Z., et al. A novel and fast purification method for nucleoside transporters. Frontiers in Molecular Biosciences. 3, 23(2016).
  60. Nakamura, K., et al. Functional expression of Candida albicans drug efflux pump Cdr1p in a Saccharomyces cerevisiae strain deficient in membrane transporters. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 45 (12), 3366-3374 (2001).
  61. Bernaudat, F., et al. Heterologous expression of membrane proteins: choosing the appropriate host. PLoS One. 6 (12), 29191(2011).
  62. Byrne, B. Pichia pastoris as an expression host for membrane protein structural biology. Current Opinion in Structural Biology. 32, 9-17 (2015).
  63. Holmes, A. R., et al. Heterozygosity and functional allelic variation in the Candida albicans efflux pump genes CDR1 and CDR2. Molecular Microbiology. 62 (1), 170-186 (2006).
  64. Keniya, M. V., et al. Drug resistance is conferred on the model yeast Saccharomyces cerevisiae by expression of full-length melanoma-associated human ATP-binding cassette transporter ABCB5. Molecular Pharmaceutics. 11 (10), 3452-3462 (2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

172

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены