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Résumé

Cet article présente un protocole d’isolement de la membrane plasmique à petite échelle pour la caractérisation de la protéine Cdr1 Cdr1 de Candida albicans ABC (ATP-binding cassette), surexprimée dans Saccharomyces cerevisiae. Une double étiquette mGFPHis clivable C-terminale avec un linker de 16 résidus entre Cdr1 et l’étiquette a été conçue pour faciliter la purification et le criblage détergent de Cdr1.

Résumé

Le succès de la caractérisation biochimique et biophysique des transporteurs ABC dépend fortement du choix du système d’expression hétérologue. Au cours des deux dernières décennies, nous avons développé une plateforme d’expression des protéines membranaires de levure qui a été utilisée pour étudier de nombreuses protéines membranaires fongiques importantes. L’expression hôte Saccharomyces cerevisiae ADΔΔ est supprimée dans sept principaux transporteurs ABC endogènes et contient le facteur de transcription Pdr1-3 avec une mutation de gain de fonction qui permet la surexpression constitutive de gènes protéiques membranaires hétérologues intégrés de manière stable sous forme de copies uniques au locus génomique PDR5. La création de vecteurs plasmidiques polyvalents et l’optimisation de stratégies de clonage en une seule étape permettent le clonage, la mutagénèse et l’expression rapides et précis de transporteurs ABC hétérologues. Ici, nous décrivons le développement et l’utilisation d’une nouvelle double étiquette mGFPHis clivée par la protéase (c’est-à-dire la protéine fluorescente verte améliorée par levure monomère yEGFP3 fusionnée à une étiquette de purification d’affinité à six histidines) qui a été conçue pour éviter toute interférence possible de la balise avec la protéine d’intérêt et pour augmenter l’efficacité de liaison de la balise His aux résines d’affinité nickel. La fusion de mGFPHis à la protéine membranaire ORF (cadre de lecture ouvert) permet une quantification facile de la protéine par inspection de gels de polyacrylamide et détection de produits de dégradation conservant la balise mGFPHis. Nous démontrons comment cette caractéristique facilite le criblage des détergents pour la solubilisation des protéines membranaires. Un protocole pour l’isolation efficace, rapide et fiable des préparations de membrane plasmique à petite échelle du transporteur d’efflux multimédicament Candida albicans Cdr1 surexprimant dans S. cerevisiae ADΔΔ, marqué en C-terminal, est présenté. Ce protocole d’isolation des membranes plasmiques à petite échelle génère des membranes plasmiques de haute qualité en une seule journée de travail. Les préparations de membrane plasmique peuvent être utilisées pour déterminer les activités enzymatiques des variantes mutantes Cdr1 et Cdr1.

Introduction

L’extraction des protéines membranaires intégrales de leur environnement lipidique natif peut affecter considérablement leur structure et leur fonction1,2,3,4. La composition lipidique complexe des membranes biologiques5 garantit que des interactions protéine-lipide d’importance critique peuvent se produire6. Les lipides maintiennent l’intégrité structurelle des protéines membranaires, leur permettant ainsi de fonctionner correctement dans leur(s) compartiment(s) membranaire(s) destination(s)7,8. Par conséquent, une première étape critique dans la purification de la protéine membranaire est l’extraction de la protéine de son environnement natif sans affecter sa structure et / ou sa fonction.

Il existe de nombreux obstacles à la caractérisation de la structure des protéines membranaires, dont la plupart sont liés à leur nature hydrophobe, et aux difficultés d’expression de protéines membranaires correctement repliées et fonctionnelles dans les quantités requises pour la cristallographie aux rayons X ou la cryo-microscopie électronique (cryo-EM)9,10,11,12. Il existe trois types de systèmes d’expression des protéines membranaires :homologues 9, hétérologues13,14,15et systèmes d’expression in vitro 16,17. Les niveaux d’expression souvent faibles, ou les coûts prohibitifs, de nombreux systèmes d’expression ne laissent que quelques hôtes comme option préférée pour produire des protéines membranaires. Ils comprennent l’hôte bactérien, Escherichia coli, les levures S. cerevisiae et Pichia pastoris, et les eucaryotes supérieurs tels que les cellules d’insectes Sf9 ou les lignées cellulaires de mammifères18. Toutes les technologies d’expression des protéines membranaires présentent des avantages et des inconvénients; cependant, S. cerevisiae est peut-être l’organisme modèle eucaryote le mieux étudié adapté à la production de protéines membranaires. Il est très polyvalent avec des applications dans le génie génétique, la découverte de médicaments, la biologie synthétique et l’expression des protéines de la membrane eucaryote14,19,20,21.

Dans cette étude, une technologie brevetée d’expression des protéines membranaires S. cerevisiae 21 a été utilisée, avec S. cerevisiae ADΔ14 et ADΔΔ22 comme hôtes préférés(Figure 1A),pour surexprimer et étudier la principale pompe d’efflux multimédicament C. albicans Cdr1. Les deux souches de S. cerevisiae sont des dérivés de AD1-8u- 23 qui ont soit les gènes ura3 (ADΔ) ou les gènes ura3 et his1 (ADΔΔ) supprimés pour éliminer tout transformant prototrophe uracile ou histidine faussement positif résultant de l’intégration indésirable aux loci génomiques URA3 ou HIS1. La suppression des 7 principales pompes d’efflux multidrogue23, indiquée à la figure 1A, rend ADΔΔ extrêmement sensible à la plupart des xénobiotiques. Le facteur de transcription mutant de gain de fonction Pdr1-3 provoque la surexpression constitutive de protéines membranaires hétérologues telles que Cdr1 (octogones rouges dans la figure 1A)après intégration de la cassette de transformation hétérologue contenant de l’ORF(Figure 1A)au locus génomique PDR5 (rectangle bleu dans la figure 1A)via deux événements de recombinaison homologue. La localisation correcte de la membrane plasmique des protéines marquées mGFPHis C-terminale peut être confirmée par microscopie confocale(Figure 1A),et l’étiquette His peut être utilisée pour la purification par affinité nickel de la protéine marquée. Le clonage de certains transporteurs fongiques ABC (p. ex. Candida krusei ABC1)en plasmides dérivés de pABC3 n’a toutefois pas été possible car ils n’ont pas pu être propagés dans Escherichia coli en raison de la toxicité cellulaire. Cela a incité au développement du clonage en une étape des protéines membranaires14,24 marquées à leur terminus N ou C avec diverses étiquettes d’affinité, d’épitope ou de rapporteur directement dans S. cerevisiae ADΔΔ ( Figure1C). S. cerevisiae Les souches ADΔΔ surexprimant divers mutants CDR1 peuvent également être créées efficacement de cette manière en utilisant jusqu’à cinq fragments PCR individuels qui se chevauchent de 25 pb(Figure 1C). En utilisant ce protocole, de nombreux ORF d’intérêt peuvent être clonés, exprimés et caractérisés à faible coût et à haute efficacité dans un laps de temps très court. L’efficacité de la transformation ne diminue que d’environ 2 fois à chaque fragment de PCR supplémentaire.

Si vous le souhaitez, les niveaux d’expression peuvent également être facilement manipulés par la conception de l’amorce pour régler de manière prévisible les niveaux d’expression entre 0,1% et 50% des niveaux d’expression constitutifs généralement élevés25. Le vecteur de clonage dérivé optimisé et multifonctionnel pABC314, pABC3-XLmGFPHis26 (Figure 1B)contient un site de clivage de la protéase HRV-3C (X; LEVLFQ| GP), une protéase qui fonctionne mieux à 4 °C que la protéase27du virus de la gravure du tabac (TEV) fréquemment utilisée. L est un linker à cinq acides aminés (GSGGS), mGFP est un mutant monomère (A206K)28,version 29 de la variante de protéine de fluorescence verte améliorée de levure yEGFP330, et His est un linker à trois acides aminés (GGS) suivi de la balise de purification de la protéine d’affinité nickel à six histidine (HHHHHH).

Cette technologie d’expression a été utilisée avec succès dans la découverte de médicaments et l’étude des protéines membranaires. La première structure d’une cible fongique de médicament azole, S. cerevisiae Erg1131, a été résolue à l’aide de cette technologie. Il a également permis la caractérisation détaillée de C. albicans Cdr132,33,34 et la création d’une molécule Cdr1 déficiente en cystéine35 adaptée aux études de réticulation de cystéine pour vérifier toute future structure à haute résolution. De nombreux autres transporteurs ABC provenant d’agents pathogènes fongiques humains majeurs (c.-à-d. C. albicans, Candida glabrata, Candida auris, Candida krusei, Candida utilis, Cryptococcus neoformans, Aspergillus fumigatus, Penicillium marneffei et le complexe d’espèces Fusarium solani) ont également été étudiés en détail à l’aide de cette plate-formed’expression24,36,37,38,39. Cela a permis la génération d’un panel de souches de S. cerevisiae surexprimant les pompes d’efflux qui a été utilisé dans les écrans à haut débit pour découvrir le nouveau substrat de pompe d’efflux fluorescent Nile red40 et les inhibiteurs spécifiques de la pomped’efflux41 et à large spectre14,33,42, 43,44. L’utilisation de ce système a également permis la découverte de la clorgyline en tant que premier inhibiteur de pompe d’efflux de médicaments multimédicaments fongiques à large spectre de son genre42.

La solubilisation complète des protéines membranaires et la création d’une préparation homogène de protéines-micelles membranaires dépourvues de lipides endogènes, nécessitent des concentrations détergentes élevées45. Mais malheureusement, cela inactive aussi souvent la protéine membranaire5,8,45,46. Les propriétés des monomères détergents et leur agrégation en solution sont affectées par les propriétés physiques de la queue hydrophobe, la longueur et la ramification de la chaîne alkyle, la présence d’un noyau aromatique ou d’une chaîne latérale fluoroalkyle, ou le nombre d’unités de polyoxyéthylène. Ainsi, le criblage des détergents est une première étape importante pour déterminer le détergent le plus approprié pour la solubilisation et la purification des protéines membranaires.

C. albicans est un pathogène fongique humain majeur des personnes immunodéprimées qui peut causer des infections invasives graves et potentiellement mortelles47, et il peut devenir résistant aux médicaments antifongiques azoles48,49. L’un des principaux mécanismes de la multirésistance aux médicaments de C. albicans est la surexpression de Cdr150, qui est un transporteur de cassette de liaison à l’ATP (ABC) de type II51 de la sous-famille ABCG situé dans la membrane plasmique. Les transporteurs ABCG fongiques pleine grandeur (constitués de deux domaines de liaison aux nucléotides [ND] et de deux domaines transmembranaires [TMD]) sont plus communément appelés transporteurs pléiotropes de résistance aux médicaments (PDR) et se caractérisent par leur topologie unique de domaine inversé [NBD-TMD]2. Les transporteurs PDR ne se trouvent que dans les plantes52,53 et les champignons54. Malgré leur importance, il n’y a pas de structures pour les transporteurs PDR, bien que les structures pour les transporteurs ABCG humains de demi-taille aient récemment été résolues, ce qui a contribué à créer le premier modèle provisoire pour Cdr133. Nos preuves expérimentales récentes suggèrent, cependant, que ce modèle est défectueux peut-être parce que les transporteurs PDR fongiques ont des NBD asymétriques caractéristiques résultant très probablement en un mécanisme de transport unique. Une structure à haute résolution de Cdr1 est donc nécessaire à la fois pour la conception rationnelle de nouveaux inhibiteurs de pompe d’efflux qui peuvent aider à surmonter la résistance aux médicaments médiée par l’efflux, et pour fournir des informations sur le mécanisme d’action de cette importante famille de transporteurs ABC.

L’objectif de cette étude était de développer des protocoles fiables pour l’expression, la solubilisation et la purification de Cdr1 dans l’hôte d’expression de S. cerevisiae génétiquement modifié, dans le but ultime d’obtenir une structure à haute résolution pour Cdr1. Dans le cadre de ce processus, une double étiquette mGFPHis clivée par la protéase(Figure 1B)a été conçue avec un liant à 16 résidus séparant l’étiquette de la terminaison C de Cdr1, ce qui a amélioré la liaison de la balise d’affinité 6x His attachée à la résine d’affinité nickel et a permis de surveiller les niveaux d’expression de Cdr1 dans les cellules vivantes et pendant tout le processus de purification. Un protocole reproductible pour les préparations de protéines de membrane plasmique de levure à petite échelle contenant environ 10% de C. albicans Cdr1 (tel qu’estimé par la coloration de Coomassie après SDS-PAGE) a également été développé, qui pourrait être utilisé pour la caractérisation biochimique de Cdr1.

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Protocole

1. Préparation de stocks frais ou congelés de cellules ADΔ et ADΔΔ compétentes en transformation

  1. Inoculer 25 mL de 2x YPCD [c.-à-d. 2x YPD; 2% (p/v) d’extrait de levure, 2% (p/v) de peptone, 4% (p/v) de dextrose), 0,079 % (p/v) de CSM (mélange complet de supplément)]35 milieu avec une seule colonie de levure et incuber pendant la nuit (o/n) pendant 16 h à 30 °C en agitant à 200 tours par minute (tr/min).
  2. Inoculer 225 mL de milieu 2x YPCD avec la culture 25 mL o/n et vérifier la densité optique de la cellule à 600 nm (OD600); l’OD600 est généralement ~0,5-1,0.
    REMARQUE: À ce stade, assurez-vous que tous les matériaux requis pour l’expérience de transformation suivante sont facilement disponibles.
  3. Cultivez la culture à 30 °C pendant environ 6 à 8 h supplémentaires en agitant à 200 tr/min jusqu’à ce que la densité cellulaire atteigne un OD600 de ~6-8.
    REMARQUE: Les étapes suivantes sont effectuées à température ambiante (RT), sauf indication contraire.
  4. Récolter ces cellules en phase logarithmique par centrifugation à 3 000 x g pendant 3 min.
  5. Resuspendez les cellules et lavez-les deux fois avec de l’eau stérile double distillée (ddH2O, c’est-à-dire 200 mL puis 20 mL).
  6. Récoltez les cellules à 3 000 x g pendant 3 min.
  7. Lentement (c.-à-d. ajouter 30 aliquotes égales de solution congelée de cellules compétentes (FCC) toutes les minutes pendant 30 min) resussuspener la pastille cellulaire dans X mL de FCC [5 % (p/v) de glycérol, 10 % (v/v) de diméthylsulfoxyde (DMSO)] sur de la glace (où X = OD600; p. ex., si OD600 = 6 résaisir dans 6 mL, ou si OD600 = 3 resuspend dans 3 mL).
    REMARQUE: La composition correcte de la FCC est essentielle au succès de la transformation.
  8. Conserver les cellules sur la glace pendant 2 h avant la transformation ou conserver les aliquotes à -80 °C jusqu’à ce que cela soit nécessaire.
    REMARQUE : Les cellules ADΔ et ADΔΔ sont très sensibles à la congélation. Ainsi, les cellules doivent être refroidies lentement jusqu’à -80 °C : placer des tubes de microcentrifugation glacés contenant des aliquotes cellulaires de 50 à 600 μL dans une boîte de stockage en plastique (RT). Placez la boîte dans un récipient en polystyrène (RT) plus grand et fermez le récipient avec un couvercle en polystyrène approprié. Ensuite, mettez le récipient dans le congélateur à -80 °C.
    ATTENTION : La congélation lente est essentielle à la survie des cellules.

2. Transformation d’ADΔ et ADΔΔ avec CaCDR1-XLmGFPHis et confirmation des transformations correctes par PCR de colonie et séquençage de l’ADN

REMARQUE : Le plasmide pABC3-CDR1-mGFPHis a été créé à l’aide de stratégies de clonage conventionnelles décrites en détail dans Lamping et al., 201055 et est illustré à la figure 1B. C. albicans CDR1 de type sauvage a été isolé sous forme de fragment De PacI/NotI à partir du plasmide pABC3-CaCDR1A-GFP14 et cloné dans pABC3-XLmGFPHis26.

  1. La PCR amplifie l’ensemble de la cassette de transformation CDR1 avec une paire d’ADN polymérase haute fidélité et d’amorce PDR5-pro/PDR5-ter35 en utilisant 1 à 10 ng de pABC3-CaCDR1-XLmGFPHis comme modèle d’ADN ou, alternativement, digérer 2 μg de pABC3-CaCDR1-XLmGFPHis jusqu’à compléter avec l’enzyme de restriction 10 U AscI à 37 °C(Figure 1A,B).
    REMARQUE: La cassette de transformation CDR1 (Figure 1A) comprend le promoteur PDR5 - CaCDR1-mGFPHis - terminateur PGK1 - marqueur de sélection URA3 - région aval PDR5.
  2. Effectuez l’électrophorèse sur gel d’agarose et extrayez la cassette de transformation d’environ 8 kb.
    REMARQUE: La purification en gel de la cassette de transformation CaCDR1 d’environ 8 kb élimine tout ADN plasmidique non digéré possible, ce qui pourrait conduire à des transformants incorrects qui ont le plasmide entier, plutôt que la cassette de transformation linéaire, intégré au locus génomique PDR5.
  3. Dénaturer la quantité requise d’ADN porteur de sperme de saumon (2 mg/mL; 10 mM Tris, 1 mM EDTA; pH 7,5) pendant 10 min dans un bain-marie bouillant et garder sur la glace. Utilisez des tubes à bouchon vissé pour faire bouillir l’ADN des spermatozoïdes de saumon afin d’éviter l’ouverture du couvercle.
  4. Mélanger 50 μL d’ADN de spermatozoïdes de saumon dénaturés avec 14 μL de la cassette de transformation (500-2 000 ng) et conserver les 64 μL de mélange d’ADN sur la glace jusqu’à une utilisation ultérieure.
    REMARQUE : Utiliser 10 ng d’un plasmide navette E. coli-levure(p. ex., pYES2) comme témoin de transformation positive(figure 2B).
  5. Remettre en caisse des cellules compétentes fraîches ou congelées rapidement décongelées pendant 5 min dans un bain-marie à 30 °C et les diviser en aliquotes de 50 μL dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 mL.
  6. Récolter des cellules par centrifugation pendant 1 min dans un microfuge à vitesse maximale (18 000 x g).
  7. Retirez le surnageant et maintenez la pastille de cellule à TA.
  8. Pour chaque transformation, mélanger 296 combinaisons μL (RT) de 260 μL de polyéthylène glycol à 50 % (p/v) (PEG 3350) et 36 μL d’acétate de lithium (LiAc) de 1 M, par pipetage répété, avec les 64 μL appropriés de mélanges d’ADN glacés.
  9. Ajouter immédiatement le mélange approprié à une aliquote de granulés cellulaires compétents de 50 μL.
  10. Resuspendez la pastille cellulaire dans le mélange PEG-LiAc-ADN de 360 μL en vortexant complètement pendant environ 30 s.
  11. Incuber le mélange cellulaire dans un bain-marie à 30 °C pendant 1 h.
    REMARQUE : Les cellules ADΔ et ADΔΔ se transforment mieux à 30 °C qu’à 42 °C35.
  12. Récoltez les cellules à 18 000 x g pendant 10 s. Jeter le surnageant et resussuspend la pastille cellulaire dans 80 μL de ddH2O.
  13. Étaler les cellules sur une plaque d’agar CSM-URA35 [c.-à-d. 0,67 % (p/v) de base d’azote de levure sans acides aminés, 0,077 % (p/v) de MSC moins uracile, 2 % (p/v) de glucose et 2 % (p/v) de gélose].
  14. Incuber les plaques pendant 2-3 jours à 30 °C jusqu’à ce que les transformants prototrophes de l’uracile soient clairement visibles.
    REMARQUE: Attendez-vous à ~100 transformants par μg de la cassette de transformation CaCDR1 linéaire ~8 kb et ~4 x 104 transformants par μg pYES2.
  15. Choisissez cinq transformants indépendants et étalez-les sur une plaque CSM-URA fraîche pour séparer les transformants prototrophes de l’uracile des restes de cellules hôtes non transformées.
  16. Éliminez tous les petits mutants possibles en cultivant les transformants sur des plaques de gélose YPG [1 % (p/v) d’extrait de levure, 2 % (p/v) de peptone, 2 % (v/v) de glycérol et 2 % (p/v) d’agar](Figure 2D).
    REMARQUE: Les petits mutants ont des mitochondries défectueuses et, par conséquent, ne peuvent pas se développer sur des sources de carbone non fermentescibles. Ils sont assez fréquents chez S. cerevisiae56. S. cerevisiae ADΔ et ADΔΔ sont particulièrement enclins à acquérir le petit phénotype.
  17. Effectuez une PCR de colonie de levure et confirmez qu’au moins trois transformants indépendants sont correctement intégrés dans le locus génomique PDR5 (Figure 1C)en amplifiant la cassette de transformation CaCDR1 entière d’environ 8 kb avec une ADN polymérase spécifique optimisée pour amplifier les produits PCR à partir de sources de modèles d’ADN impures. Utilisez un ensemble d’amorces qui se lient juste à l’extérieur du site d’intégration et des aliquotes de 1 μL de suspensions cellulaires (en ddH2O) dérivées de colonies uniques comme modèles d’ADN.
    REMARQUE: Cette ADN polymérase particulière amplifie de manière fiable ~ 8 kb de fragments de PCR à partir de cellules de levure intactes. Cependant, pour une amplification fiable, 45 cycles de PCR sont nécessaires et les cellules de levure doivent être ressuspendées à OD600 1-10 en ddH2O.
  18. Confirmez le produit d’amplification PCR correct d’environ 8 kb par électrophorèse sur gel d’agarose d’ADN d’une partie de 1 μL de la réaction PCR.
  19. Retirer les amorces d’amplification en excès d’une partie de 10 μL de la réaction de PCR avec un mélange enzymatique d’une exonucléase d’ADN monocaté brin et d’une phosphatase en suivant les instructions du fabricant avant de séquencer l’ensemble de l’ORF à l’aide de portions de l’échantillon d’ADN traité avec des amorces appropriées.

3. Protocole d’isolement de la membrane plasmique de levure à petite échelle

  1. Cellules de levure en croissance
    1. Pré-culture d’une seule colonie de levure dans 10 mL de YPD à 30 °C pendant ~7-8 h en agitant à 200 tr/min.
    2. Inoculer 40 mL de milieu YPD avec la pré-culture de 10 mL et incuber les cellules à 30 °C o/n (~16 h) en agitant à 200 tr/min jusqu’à ce que la densité cellulaire atteigne un OD600 de 1-3.
  2. Récolte de cellules de levure
    1. Récolter 40 unités OD (ODU; par exemple, 1 mL à une OD600 de 1 = 1 ODU) de cellules en phase logarithmique à 4 200 x g pendant 5 min à 4 °C.
    2. Resuspendez et lavez les cellules deux fois avec du ddH2O stérile glacé (c.-à-d. 40 mL puis 1 mL; prélèvez les cellules entre les étapes par centrifugation à 4 200 x g pendant 5 min à 4 °C).
    3. Remettre la pastille dans 1 mL de ddH2O stérile glacé et transférer la suspension cellulaire dans un tube de microcentrifugation pré-refroidi (sur glace) de 1,5 mL.
    4. Récolter des cellules à 3 300 x g pendant 3 min à 4 °C.
    5. Aspirer le surnageant.
    6. Resuspendez la pastille cellulaire dans un tampon homogénéisant de 0,5 mL [HB; 50 mM Tris, 0,5 mM EDTA, 20% (v/v) de glycérol; pH 7,5] fraîchement complété par 1 mM de fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF).
      REMARQUE: Ajoutez toujours le PMSF frais parce que le PMSF est inactivé rapidement lors de l’exposition à l’eau.
      ATTENTION: PmSF est un inhibiteur de la sérine protéase, qui est extrêmement corrosif et destructeur pour les tissus. Il peut causer des lésions oculaires irréversibles.
    7. Conservez la suspension cellulaire à -80 °C ou utilisez-la immédiatement.
  3. Isolation des membranes plasmiques
    1. Si elles sont congelées, décongelez les cellules sur de la glace pendant environ 1 h.
    2. Ajouter des billes de silice glacées de 0,5 mm de diamètre à la suspension cellulaire de 0,5 mL pour atteindre un volume total de 1 mL.
    3. Briser les cellules avec 6 cycles de vortex à l’intensité maximale de secousse pendant 1 min entrecoupé de 3 min de périodes de refroidissement sur la glace.
    4. Faites un trou mince au fond du tube avec une lame de scalpel chauffée.
    5. Recueillir l’homogénat de cellule cassé à travers le fond du tube installé dans un autre tube de microcentrifugation glacé de 1,5 mL avec un spin à basse vitesse de 10 s (~ 200 tr / min).
      REMARQUE: Cela garantit que les billes de silice restent dans le tube d’origine.
    6. Centrifuger l’homogénat cellulaire à 5 156 x g pendant 5 min à 4 °C pour éliminer les débris cellulaires, les cellules ininterrompues et les noyaux.
    7. Transférer 450 μL de surnageant dans un tube de microcentrifuge glacé de 1,5 mL et ajouter 1 mL supplémentaire de HB glacé complété par du PMSF frais (1 mM).
      REMARQUE: Cette étape de dilution est essentielle pour la récupération de la protéine de la membrane plasmique de haute qualité.
    8. Récolter les membranes plasmiques à 17 968 x g pendant 1 h à 4 °C et ressuspendre la pastille de membrane plasmique, par pipetage répété, dans 100 μL de HB fraîchement complété par 1 mM pmSF. Desserrer la pastille de cellule pour une homogénéisation correcte de la membrane plasmique en remuant la pastille de cellule avec la pointe de pipette de 100 μL avant de libérer les 100 μL de HB et de pipetage de haut en bas.
    9. Mesurez la concentration en protéines de la préparation de la membrane plasmique à l’l’éventreur à l’éventreur à l’cette arme à l’cette arme à l’cette arme.
    10. Conservez les membranes plasmiques à -80 °C ou conservez-les sur de la glace pour une utilisation immédiate.

4. Électrophorèse sur gel de polyacrylamide de dodécylsulfate de sodium (SDS-PAGE)

  1. Assemblez l’appareil pour la préparation de gels de polyacrylamide.
  2. Pour deux gels séparateurs (7 % de polyacrylamide), mélanger 2,1 mL de 40 % d’acrylamide/bis-acrylamide, 3 mL de tampon de séparation 4x (1,5 M tris, 0,4 % de dodécylsulfate de sodium [SDS] (p/v); pH 8,8) et 6,9 mL de ddH2O. Ajouter 8 μL de tétraméthyléthylènediamine (TEMED) et 60 μL de persulfate d’ammonium (APS) à 10 % pour initier la polymérisation de l’acrylamide.
    ATTENTION : L’acrylamide/bis-acrylamide est très toxique. Il provoque une irritation de la peau, une neuropathie périphérique et est cancérigène. TemED est nocif en cas d’ingestion ou d’inhalation. L’APS est nocif s’il est avalé. Il provoque de graves irritations des yeux et de la peau.
  3. Versez ~4-5 mL de ce mélange dans l’appareil à gel assemblé, jusqu’à ~2 cm du haut.
  4. Superposez soigneusement ~ 1-2 mL de 0,1% de SDS sur le dessus pour créer un ménisque planaire.
  5. Laissez le polyacrylamide se régler pendant environ 60 min à TA.
  6. Préparer un mélange de gel empilable pour deux gels en mélangeant 0,5 mL de 40 % d’acrylamide/bis-acrylamide, 1 mL de tampon d’empilage 4x (0,5 M Tris, 0,4 % de SDS (p/v); pH 6,8) et 6,9 mL de ddH2O. Ajouter 2 μL de TEMED et 30 μL de 10 % d’APS pour initier la polymérisation de l’acrylamide.
  7. Retirez la couche de FDS à 0,1 % du gel séparateur polymérisé et rincez avec du ddH2O pour éliminer les traces de FDS.
  8. Versez le mélange de gel empilable sur le gel séparateur.
  9. Placez un peigne dans le gel empilable et retirez toutes les bulles d’air autour du peigne.
  10. Laissez le gel empilable se fixer pendant environ 60 min à RT.
  11. Retirez le peigne et rincez les fentes de gel avec de l’eau. Mettez le gel dans le réservoir de gel et remplissez le réservoir de gel jusqu’au sommet avec 1x tampon de course (24,8 mM Tris, 190 mM de glycine, 0,1% SDS).
    REMARQUE: Préparez 1x tampon de fonctionnement à partir d’un stock tampon 10x (248 mM Tris, 1,9 M de glycine, 1% SDS (w / v) dans ddH2O) stocké à RT.
  12. Mélanger des échantillons de membrane plasmique de 5 à 10 μL (c.-à-d. 10 à 20 μg de protéines) avec des volumes égaux de 2x colorant à charge protéique [120 mM de Tris-HCl (pH 6,8), 20 % de glycérol, 0,02 % de bleu de bromophénol, 4 % de FDS, 200 mM de dithiothréitol (DTT)] et charger immédiatement dans des fentes de gel individuelles immergées dans le tampon de fonctionnement.
    ATTENTION : La TNT est nocive si elle est avalée. Il provoque de graves irritations des yeux et de la peau.
    REMARQUE: Faire un stock de 10 mL de 2x colorant à charge protéique, aliquote et conserver à -20 ° C. Ne chauffez pas les échantillons mélangés, mais chargez-les immédiatement dans des fentes de gel individuelles afin que l’étiquette GFP ne soit pas dénaturée et que les signaux de fluorescence dans le gel puissent être détectés.
  13. Chargez les marqueurs de poids moléculaire des protéines (plage de 10 à 245 kDa) dans un emplacement séparé pour permettre l’estimation de la taille des fragments de protéines individuels.
  14. Effectuez une électrophorèse sur gel à 200 V jusqu’à ce que le colorant à chargement bleu atteigne le fond du gel (généralement 45-55 min).
  15. Examinez le gel pour la fluorescence GFP dans le gel avec un système d’imagerie sur gel (les longueurs d’onde d’excitation et d’émission sont respectivement de 475 à 485 nm et de 520 nm).
  16. Après l’imagerie par fluorescence dans le gel, fixez les protéines par agitation douce du gel dans ~10-20 mL de solution fixatrice de gel protéique (40% d’éthanol, 10% d’acide acétique) pendant 15 min à RT.
  17. Rincez le gel deux fois pendant 10 min avec 10 mL de ddH2O et visualisez les bandes protéiques en plaçant le gel dans une solution colloïdale de coloration de Coomassie de 10 mL avec une secousse douce pendant environ 1 h à TA.
  18. Pour une meilleure visualisation des bandes protéiques, détachant le gel une ou deux fois dans ~20 mL de ddH2Opendant ~1 h avant d’enregistrer des images avec le système d’imagerie en gel.

5. Détermination des activités de Cdr1 ATPase 57

  1. Les échantillons de membrane plasmique dilués >2,2 mg/mL à 1-2 mg/mL dans l’HB.
  2. Équilibrer le cocktail d’essai ATPase (75 mM MES-Tris, 75 mM de nitrate de potassium, 0,3 mM de molybdate d’ammonium, 7,5 mM d’azoure de sodium; pH 7,5) et Mg-ATP (28,8 mM de sel disodique ATP, 28,8 mMMgCl2; pH 7,0) à 30 °C dans un incubateur à 30 °C.
    ATTENTION : L’azide de sodium est très toxique.
    NOTE: S’assurer que tous les stocks régulateurs et bouteilles sont exempts de phosphate; c’est-à-dire laver la verrerie avec 1% (vol/vol) de HCl et la rincer plusieurs fois avec ddH2O. En outre, gardez-le séparé des autres verreries qui contiennent probablement des traces de phosphate couramment présentes dans les détergents utilisés pour laver la verrerie.
  3. Ajouter 90 μL de cocktail d’essai avec ou sans inhibiteur de Cdr1-ATPase (20 μM d’oligomycine) dans des puits individuels d’une plaque de microtitrage de 96 puits.
    REMARQUE: Le test est effectué en trois exemplaires.
  4. Ajouter 5 μL des membranes plasmiques isolées (~5-10 μg de protéines) ou des étalons de phosphate (0-100 nmoles Pi) dans les puits appropriés de la plaque de microtitrage.
    REMARQUE : Conservez les première et dernière colonnes pour deux ensembles distincts d’étalons de phosphate.
  5. Commencez le dosage en ajoutant 25 μL de Mg-ATP pré-averti de 28,8 mM (concentration finale de 6 mM) avec une pipette multicanal dans des puits individuels et incuber à 30 °C pendant 30 min.
  6. Arrêtez la réaction en ajoutant 130 μL de réactif de développement (1,6 % de L-ascorbate de sodium, 1 % de FDS, 12 % de molybdate d’ammonium dans de l’acide sulfurique 6 M).
    ATTENTION : L’acide sulfurique concentré réagit violemment avec l’eau. Il est corrosif et peut causer des dommages à la peau et aux poumons.
  7. Incuber à RT pendant 10 min.
  8. Lisez l’absorbance des puits de plaque de microtitrage à 750 nm avec un lecteur de plaque de microtitrage.
    REMARQUE: S’en tenir au temps d’incubation de 10 minutes pour le développement du colorant bleu (c.-à-d. un complexe phosphore-molybdène réduit) est essentiel pour la précision du test, car le développement du colorant bleu se poursuit avec le temps.
  9. Obtenir l’activité de l’ATPase spécifique à la Cdr1 (c.-à-d. l’activité de l’ATPase sensible à l’oligomycine) en soustrayant l’activité de l’ATPase en présence d’oligomycine de l’activité totale de l’ATPase en l’absence d’oligomycine.

6. Écran de détergent à petite échelle

  1. Combiner les préparations membranaires plasmiques (c.-à-d. 2,5 mg de protéines de membrane plasmique) de cellules surexprimant Cdr1-mGFPHis avec un tampon GTED-20 [10 mM Tris, 0,5 mM EDTA, 20 % (p/v) de glycérol; pH 7,5; fraîchement complété par 1 mM PMSF] contenant 5 mg du détergent d’essai, pour atteindre un volume total de 0,5 mL complété par 1 % (p/v) de détergent.
  2. Faire pivoter le mélange à 4-8 °C pendant 2 h, à l’l’éventrifice d’un dispositif de rotation.
  3. Centrifuger le mélange à 141 000 x g à 4 °C pendant 1 h.
  4. Transférer le surnageant contenant le matériau solubilisé dans un tube de microcentrifugation frais.
  5. Ajouter 0,5 mL de tampon GTED-20 complété par 2 % (p/v) de FDS à la fraction de granulés insolubles et incuber à 30 °C o/n dans un incubateur à agitation pour extraire toutes les protéines membranaires insolubles dans le détergent.
  6. Analyser et comparer les fractions de granulés surnageants et solubilisés par SDS-PAGE.
  7. Photographier les gels contenant des protéines marquées GFP pour la fluorescence GFP dans le gel avant la coloration de Coomassie et quantifier les niveaux d’expression avec le système d’imagerie.
  8. Utilisez la fraction protéique membranaire soluble pour des applications en aval telles que la chromatographie d’exclusion de la taille de fluorescence (FSEC)58 pour identifier le ou les détergents appropriés.

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Résultats

Une fréquence élevée de transformation de S. cerevisiae ADΔΔ (~4 x 104 transformants/μg) a été obtenue avec pYES2(Figure 2B). Comme prévu, le contrôle sans ADN (c’est-à-dire ddH2O uniquement) n’a donné aucun transformant, et 1 μg de la cassette de transformation linéaire CDR1-mGFPHis (Figure 1A) a donné ~ 50 transformants (Figure 2C) avec le protocole de transformat...

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Discussion

Malgré les progrès récents dans l’analyse structurale des protéines membranaires, aucune structure 3D pour Cdr1, ou tout autre transporteur PDR, n’est actuellement disponible. Il est donc important d’acquérir des connaissances sur la structure Cdr1 et ses caractéristiques biochimiques, car cela donnera non seulement un aperçu de la conception rationnelle de nouveaux médicaments pour surmonter la résistance aux médicaments médiée par l’efflux, mais également du mécanisme de fonctionnement d’une imp...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Les auteurs reconnaissent avec gratitude le financement du New Zealand Marsden Fund (Grant UOO1305) et une subvention globale de la Faculté de médecine de l’Université Chulalongkorn, Bangkok, Thaïlande (M. Niimi). Ils souhaitent remercier l’Université d’Otago d’avoir fourni à G. Madani une bourse de doctorat. Les auteurs souhaitent également exprimer leur gratitude au professeur Stefan Raunser et à ses collègues, le Dr Amir Apelbaum et le Dr Deivanayagabarathy Vinayagam, pour leur soutien et leur supervision lors d’une visite de 6 mois de G. Madani à l’Institut Max Planck de physiologie moléculaire (MPIMP), Dortmund, Allemagne. Les auteurs remercient également le Service allemand d’échanges universitaires (DAAD) d’avoir fourni à G. Madani une subvention de recherche (57381332) pour visiter le MPIMP.

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matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
2-(N-Morpholino)ethane-sulphonic acid (MES)Sigma-AldrichM3671
2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol (Tris base; ultra-pure)Merck77-86-1
2,2-Didecylpropane-1,3-bis-β-D-maltopyranosideAnatraceNG310SLMNG
2,2-Dihexylpropane-1,3-bis-β-D-glucopyranosideAnatraceNG311SOGNG (MNG-OG)
2,2-Dioctylpropane-1,3-bis-β-D-maltopyranosideAnatraceNG322SDMNG
4-Trans-(4-trans-propylcyclohexyl)-cyclohexyl α-D-maltopyranosideGlycon Biochemicals GmbHD99019-CPCC-α-M
40% Acrylamide/Bis-acrylamide (37.5:1)Bio-Rad1610148
Acetic acid (glacial)Merck64-19-7
AgarFormedium 009002-18-0
Ammonium molybdateSigma-Aldrich13106-76-8
Ammonium persulphate (APS)Bio-Rad1610700
ATP disodium saltsigma-AldrichA-6419
Bromophenol blueSERVA Electrophoresis GmbH34725-61-6
CHAPSAnatraceC316S
CHAPSOAnatraceC317S
CSMFormediumDCS0019
CSM minus uracilFormediumDCS0161
Cyclohexyl-1-butyl-β-D-maltopyranosideAnatraceC324SCYMAL-4
Cyclohexyl-1-heptyl-β-D-maltopyranosideAnatraceC327SCYMAL-7
Cyclohexyl-methyl-β-D-maltopyranosideAnatraceC321SCYMAL-1
DigitoninSigma-Aldrich11024-24-1
Dithiothreitol (DTT)Roche Diagnostics10197785103
DMSOMerck67-68-5
EthanolMerck459836
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA; Titriplex III)Merck6381-92-6
ExoSAP-IT PCR Product Cleanup ReagentApplied Biosystems78205A blend of exonuclease and phosphatase
GlucoseFormedium50-99-7
GlycerolMerck56-81-5
GlycineMerckG8898
HEPESFormedium7365-45-9
Hydrochloric acidMerck1003172510
KOD Fx NeoTOYOBO CoKFX-201Use for reliable colony PCR
lithium acetate (LiAc)Sigma-Aldrich546-89-4
Magnesium chloride hexa-hydratesigma-AldrichM2393
MESFormedium145224-94-8
n-Decanoyl-N-hydroxyethyl-glucamideAnatraceH110SHEGA-10
n-Decanoyl-N-methyl-glucamideAnatraceM320SMEGA-10
n-Decyl-phosphocholineAnatraceF304SFos-choline-10
n-Decyl-β-D-maltopyranosideAnatraceD322SDM
n-Dodecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulphonateAnatraceAZ312SAnzergent 3-12
n-Dodecyl-N,N-dimethylamine-N-oxideAnatraceD360SLDAO
n-Dodecyl-α-D-maltopyranosideAnatraceD310HAα-DDM
n-Dodecyl-β-D-maltopyranosideAnatraceD310Sβ-DDM
n-Nonyl-β-D-glucopyranosideAnatraceN324SNG
n-Nonyl-β-D-maltopyranosideAnatraceN330SNM
n-Octadecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulphonateAnatraceAZ318SAnzergent 3-18
n-Octyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulphonateAnatraceAZ308SAnzergent 3-8
n-Octyl-phosphocholineAnatraceF300SFos-choline-8
n-Octyl-β-D-glucopyranosideAnatraceO311SOG
n-Tetradecyl-phosphocholineAnatraceF312SFos-choline-14
n-Tetradecyl-β-D-maltopyranosideAnatraceT315STDM
n-Tridecyl-phosphocholineAnatraceF310SFos-choline-13
n-Tridecyl-β-D-maltopyranosideAnatraceT323S-
n-Undecyl-β-D-maltopyranosideAnatraceU300SUM (UDM)
N,N,N’,N’-tetramethyl-ethylenediamine (TEMED)Sigma-AldrichT9281
OctylphenoxypolyethoxyethanolSigma-Aldrich9002-93-1TRITON X-100
OligomycinSigma-Aldrich75351
PeptoneFormedium3049-73-7
phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)Roche Diagnostics329-98-6
Phusion Hot Start Flex DNA PolymeraseNew England BiolabsM0535SHigh-fidelity DNA polymerase
polyethylene glycol (PEG 3350)Sigma-Aldrich25322-68-3
polyoxyethylenesorbitan monooleateSigma-Aldrich9005-65-6TWEEN 80
Potassium nitrateSigma-AldrichP8394
Protein Assay KitBio-Rad5000122RC DC Protein Assay Kit II
QC Colloidal Coomassie StainBio-Rad1610803
Prism Ultra Protein Ladder (10-245 kDa)AbcamAB116028
Sodium azideSigma-Aldrich71289
Sodium dodecyl sulphateSigma-Aldrich151-21-3SDS
Sodium L-ascorbate BioXtraSigma-Aldrich11140
Sucrose MonododecanoateAnatraceS350SDDS
Sulphuric acidSigma-Aldrich339741
Yeast extractFormedium008013-01-2
Yeast nitrogen base without amino acidsFormediumCYN0402
 Equipment (type)
Centrifuge  (Eppendorf 5804)Eppendorf
Centrifuge (Beckman Ultra)Beckman
Centrifuge (Sorvall RC6)Sorvall
FSEC apparatus (NGC Chromatography Medium Pressure system equipped with a fluorescence detector, an autosampler, a fractionator)Bio-Rad
Gel imaging (GelDoc EZ Imager)Bio-Rad
Microplate reader (Synergy 2 Multi-Detection)BioTek Instruments
PCR thermal cycler (C1000 Touch)Bio-Rad
Power supply (PowerPac)Bio-Rad
SDS PAGE (Mini-PROTEAN Tetra)Bio-Rad
Shaking incubator (Multitron)Infors HT, Bottmingen
Superose 6 Increase 10/300 GLGE Healthcare Life SciencesGE17-5172-01
UV/Visible spectrophotometer (Ultraspec 6300 pro)Amersham BioSciences UK Ltd

Références

  1. Arachea, B. T., et al. Detergent selection for enhanced extraction of membrane proteins. Protein Expression and Purification. 86 (1), 12-20 (2012).
  2. Guo, Y. Be cautious with crystal structures of membrane proteins or complexes prepared in detergents. Crystals (Basel). 10 (2), 86(2020).
  3. Lewinson, O., Orelle, C., Seeger, M. A. Structures of ABC transporters: handle with care. FEBS Letters. 594 (23), 3799-3814 (2020).
  4. Luckey, M. Membrane Structural Biology: With Biochemical and Biophysical Foundations. , Cambridge University Press. Ch. 4 69-105 (2014).
  5. Opekarova, M., Tanner, W. Specific lipid requirements of membrane proteins--a putative bottleneck in heterologous expression. Biochimica et Biophysica Acta. 1610 (1), 11-22 (2003).
  6. Qiu, W., et al. Structure and activity of lipid bilayer within a membrane-protein transporter. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (51), 12985-12990 (2018).
  7. Dowhan, W. Molecular basis for membrane phospholipid diversity: why are there so many lipids. Annual Review of Biochemistry. 66, 199-232 (1997).
  8. Lee, A. G. Lipid-protein interactions in biological membranes: a structural perspective. Biochimica et Biophysica Acta. 1612 (1), 1-40 (2003).
  9. Ahn, J. H., Pan, J. G., Rhee, J. S. Homologous expression of the lipase and ABC transporter gene cluster, tliDEFA, enhances lipase secretion in Pseudomonas spp. Applied and Environmental Microbiology. 67 (12), 5506-5511 (2001).
  10. Newby, Z. E., et al. A general protocol for the crystallization of membrane proteins for X-ray structural investigation. Nature Protocols. 4 (5), 619-637 (2009).
  11. Parker, J. L., Newstead, S. Membrane protein crystallisation: current trends and future perspectives. Advances in Experimental Medicine and Biology. 922, 61-72 (2016).
  12. Wiener, M. C. A pedestrian guide to membrane protein crystallization. Methods. 34 (3), 364-372 (2004).
  13. Grisshammer, R. Understanding recombinant expression of membrane proteins. Current Opinion in Biotechnology. 17 (4), 337-340 (2006).
  14. Lamping, E., et al. Characterization of three classes of membrane proteins involved in fungal azole resistance by functional hyperexpression in Saccharomyces cerevisiae. Eukaryot Cell. 6 (7), 1150-1165 (2007).
  15. Macauley-Patrick, S., Fazenda, M. L., McNeil, B., Harvey, L. M. Heterologous protein production using the Pichia pastoris expression system. Yeast. 22 (4), 249-270 (2005).
  16. Focke, P. J., et al. Combining in vitro folding with cell free protein synthesis for membrane protein expression. Biochemistry. 55 (30), 4212-4219 (2016).
  17. Reckel, S., et al. Strategies for the cell-free expression of membrane proteins. Methods in Molecular Biology. 607, 187-212 (2010).
  18. Pandey, A., Shin, K., Patterson, R. E., Liu, X. Q., Rainey, J. K. Current strategies for protein production and purification enabling membrane protein structural biology. Biochemistry and Cell Biology. 94 (6), 507-527 (2016).
  19. Harvey, C. J. B., et al. HEx: A heterologous expression platform for the discovery of fungal natural products. Science Advances. 4 (4), (2018).
  20. Kingsman, S. M., Kingsman, A. J., Dobson, M. J., Mellor, J., Roberts, N. A. Heterologous gene expression in Saccharomyces cerevisiae. Biotechnology & Genetic Engineering Reviews. 3, 377-416 (1985).
  21. Monk, B. C., et al. Yeast membrane protein expression system and its application in drug screening. US patent. , 8728797 NZ 513755, AU 2002330796, US 8728797 patent NZ 513755, AU 2002330796 (2002).
  22. Sagatova, A. A., Keniya, M. V., Wilson, R. K., Monk, B. C., Tyndall, J. D. Structural insights into binding of the antifungal drug fluconazole to Saccharomyces cerevisiae lanosterol 14alpha-demethylase. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (8), 4982-4989 (2015).
  23. Decottignies, A., et al. ATPase and multidrug transport activities of the overexpressed yeast ABC protein Yor1p. The Journal of Biological Chemistry. 273 (20), 12612-12622 (1998).
  24. Lamping, E., Zhu, J. Y., Niimi, M., Cannon, R. D. Role of ectopic gene conversion in the evolution of a Candida krusei pleiotropic drug resistance transporter family. Genetics. 205 (4), 1619-1639 (2017).
  25. Lamping, E., Niimi, M., Cannon, R. D. Small, synthetic, GC-rich mRNA stem-loop modules 5' proximal to the AUG start-codon predictably tune gene expression in yeast. Microbial Cell Factories. 12, 74(2013).
  26. James, J. E., Lamping, E., Santhanam, J., Cannon, R. D. PDR transporter ABC1 is involved in the innate azole resistance of the human fungal pathogen Fusarium keratoplasticum. Frontiers in Microbiology. , (2021).
  27. Ullah, R., et al. Activity of the human rhinovirus 3C protease studied in various buffers, additives and detergent solutions for recombinant protein production. PLoS One. 11 (4), 0153436(2016).
  28. von Stetten, D., Noirclerc-Savoye, M., Goedhart, J., Gadella, T. W., Royant, A. Structure of a fluorescent protein from Aequorea victoria bearing the obligate-monomer mutation A206K. Acta Crystallographica Section F. Structural Biology and Crystalization Communications. 68, Pt 8 878-882 (2012).
  29. Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells. Science. 296 (5569), 913-916 (2002).
  30. Cormack, B. P., et al. Yeast-enhanced green fluorescent protein (yEGFP): a reporter of gene expression in Candida albicans. Microbiology (Reading). 143, Pt 2 303-311 (1997).
  31. Monk, B. C., et al. Architecture of a single membrane spanning cytochrome P450 suggests constraints that orient the catalytic domain relative to a bilayer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (10), 3865-3870 (2014).
  32. Holmes, A. R., et al. ABC transporter Cdr1p contributes more than Cdr2p does to fluconazole efflux in fluconazole-resistant Candida albicans clinical isolates. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 52 (11), 3851-3862 (2008).
  33. Tanabe, K., et al. FK506 resistance of Saccharomyces cerevisiae Pdr5 and Candida albicans Cdr1 involves mutations in the transmembrane domains and extracellular loops. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 63 (1), 01146(2019).
  34. Tanabe, K., et al. Chimeras of Candida albicans Cdr1p and Cdr2p reveal features of pleiotropic drug resistance transporter structure and function. Molecular Microbiology. 82 (2), 416-433 (2011).
  35. Madani, G., Lamping, E., Cannon, R. D. Engineering a cysteine-deficient functional Candida albicans Cdr1 molecule reveals a conserved region at the cytosolic apex of ABCG transporters important for correct folding and frafficking of Cdr1. mSphere. 6 (1), (2021).
  36. Lamping, E., et al. Abc1p is a multidrug efflux transporter that tips the balance in favor of innate azole resistance in Candida krusei. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (2), 354-369 (2009).
  37. Panapruksachat, S., et al. Identification and functional characterization of Penicillium marneffei pleiotropic drug resistance transporters ABC1 and ABC2. Medical Mycology. 54 (5), 478-491 (2016).
  38. Wada, S., et al. Phosphorylation of Candida glabrata ATP-binding cassette transporter Cdr1p regulates drug efflux activity and ATPase stability. The Journal of Biological Chemistry. 280 (1), 94-103 (2005).
  39. Watanasrisin, W., et al. Identification and characterization of Candida utilis multidrug efflux transporter CuCdr1p. FEMS Yeast Research. 16 (4), (2016).
  40. Ivnitski-Steele, I., et al. Identification of Nile red as a fluorescent substrate of the Candida albicans ATP-binding cassette transporters Cdr1p and Cdr2p and the major facilitator superfamily transporter Mdr1p. Analytical Biochemistry. 394 (1), 87-91 (2009).
  41. Niimi, K., et al. Specific interactions between the Candida albicans ABC transporter Cdr1p ectodomain and a D-octapeptide derivative inhibitor. Molecular Microbiology. 85 (4), 747-767 (2012).
  42. Holmes, A. R., et al. The monoamine oxidase A inhibitor clorgyline is a broad-spectrum inhibitor of fungal ABC and MFS transporter efflux pump activities which reverses the azole resistance of Candida albicans and Candida glabrata clinical isolates. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 56 (3), 1508-1515 (2012).
  43. Reis de Sa, L. F., et al. Synthetic organotellurium compounds sensitize drug-resistant Candida albicans clinical isolates to fluconazole. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 61 (1), 01231(2017).
  44. Tanabe, K., et al. Inhibition of fungal ABC transporters by unnarmicin A and unnarmicin C, novel cyclic peptides from marine bacterium. Biochemical and Biophysical Research Communications. 364 (4), 990-995 (2007).
  45. le Maire, M., Champeil, P., Moller, J. V. Interaction of membrane proteins and lipids with solubilizing detergents. Biochimica et Biophysica Acta. 1508 (1-2), 86-111 (2000).
  46. Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera. Biochimica et Biophysica Acta. 1666 (1-2), 105-117 (2004).
  47. Pfaller, M. A. Nosocomial candidiasis: emerging species, reservoirs, and modes of transmission. Clinical Infectious Diseases. 22, Suppl 2 89-94 (1996).
  48. Cannon, R. D., et al. Efflux-mediated antifungal drug resistance. Clinical Microbiology Reviews. 22 (2), 291-321 (2009).
  49. Sanglard, D., et al. Mechanisms of resistance to azole antifungal agents in Candida albicans isolates from AIDS patients involve specific multidrug transporters. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 39 (11), 2378-2386 (1995).
  50. Prasad, R., De Wergifosse, P., Goffeau, A., Balzi, E. Molecular cloning and characterization of a novel gene of Candida albicans, CDR1, conferring multiple resistance to drugs and antifungals. Current Genetics. 27 (4), 320-329 (1995).
  51. Lamping, E., Madani, G., Lee, H. J., Niimi, M., Cannon, R. D. Candida albicans: Cellular and Molecular Biology. Prasad, R. , Chapter 18 379-406 (2017).
  52. Crouzet, J., Trombik, T., Fraysse, A. S., Boutry, M. Organization and function of the plant pleiotropic drug resistance ABC transporter family. FEBS Letters. 580 (4), 1123-1130 (2006).
  53. Kang, J., et al. Plant ABC Transporters. Arabidopsis Book. 9, 0153(2011).
  54. Lamping, E., et al. Fungal PDR transporters: phylogeny, topology, motifs and function. Fungal Genetics and Biology. 47 (2), 127-142 (2010).
  55. Lamping, E., Cannon, R. D. Use of a yeast-based membrane protein expression technology to overexpress drug resistance efflux pumps. Methods in Molecular Biology. 666, 219-250 (2010).
  56. Day, M. Yeast petites and small colony variants: for everything there is a season. Advances in Applied Microbiology. 85, 1-41 (2013).
  57. Niimi, K., et al. Chemosensitization of fluconazole resistance in Saccharomyces cerevisiae and pathogenic fungi by a D-octapeptide derivative. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 48 (4), 1256-1271 (2004).
  58. Kawate, T., Gouaux, E. Fluorescence-detection size-exclusion chromatography for precrystallization screening of integral membrane proteins. Structure. 14 (4), 673-681 (2006).
  59. Hao, Z., et al. A novel and fast purification method for nucleoside transporters. Frontiers in Molecular Biosciences. 3, 23(2016).
  60. Nakamura, K., et al. Functional expression of Candida albicans drug efflux pump Cdr1p in a Saccharomyces cerevisiae strain deficient in membrane transporters. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 45 (12), 3366-3374 (2001).
  61. Bernaudat, F., et al. Heterologous expression of membrane proteins: choosing the appropriate host. PLoS One. 6 (12), 29191(2011).
  62. Byrne, B. Pichia pastoris as an expression host for membrane protein structural biology. Current Opinion in Structural Biology. 32, 9-17 (2015).
  63. Holmes, A. R., et al. Heterozygosity and functional allelic variation in the Candida albicans efflux pump genes CDR1 and CDR2. Molecular Microbiology. 62 (1), 170-186 (2006).
  64. Keniya, M. V., et al. Drug resistance is conferred on the model yeast Saccharomyces cerevisiae by expression of full-length melanoma-associated human ATP-binding cassette transporter ABCB5. Molecular Pharmaceutics. 11 (10), 3452-3462 (2014).

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