JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

מאמר זה מציג פרוטוקול בידוד קרום פלזמה בקנה מידה קטן לאפיון קנדידה albicans ABC (קלטת מחייבת ATP) Cdr1, overexpressed ב Saccharomyces cerevisiae. תג כפול של מסוף C-מחשוף של פרוטאז עם מקשר של 16 שאריות בין Cdr1 לתג תוכנן כדי להקל על הטיהור והקרנת חומר הניקוי של Cdr1.

Abstract

האפיון הביוכימי והביופיסי המוצלח של מובילי ABC תלוי במידה רבה בבחירת מערכת הביטוי ההטרולוגית. במהלך שני העשורים האחרונים, פיתחנו פלטפורמת ביטוי חלבון קרום שמרים ששימשה לחקר חלבונים רבים חשובים ממברנה פטרייתית. מארח הביטוי Saccharomyces cerevisiae ADΔΔ נמחק בשבעה מובילי ABC אנדוגניים עיקריים והוא מכיל את גורם התמלול Pdr1-3 עם מוטציה רווח-של-פונקציה המאפשרת ביטוי יתר המרכיב של גנים חלבון ממברנה הטרולוגית משולבים ביציבות כעותקים בודדים על locus PDR5 הגנומי. יצירת וקטורים פלסמידים רב-תכליתיים ואופטימיזציה של אסטרטגיות שיבוט של שלב אחד מאפשרים שיבוט מהיר ומדויק, מוטגנזה וביטוי של מובילי ABC הטרולוגיים. כאן, אנו מתארים את הפיתוח והשימוש בתג כפול mGFPHis חדשני הניתן למחשוף פרוטאז (כלומר, שמרים מונומריים משופרים חלבון פלואורסצנטי ירוק yEGFP3 התמזגו לתג טיהור זיקה של שישה היסטידין) שנועד למנוע הפרעה אפשרית של התג עם חלבון העניין ולהגדיל את היעילות המחייבת של התג שלו לשרף זיקה ניקל. ההיתוך של mGFPHis לחלבון הממברנה ORF (מסגרת קריאה פתוחה) מאפשר כימות קל של החלבון על ידי בדיקה של ג'לים polyacrylamide וזיהוי של מוצרי השפלה שמירה על תג mGFPHis. אנו מדגימים כיצד תכונה זו מאפשרת הקרנת דטרגנט עבור solubilization חלבון ממברנה. פרוטוקול לבידוד יעיל, מהיר ואמין של תכשירי קרום הפלזמה בקנה מידה קטן של C-סופני קנדידה albicans רב-דראג שיגור efflux Cdr1 overexpressed ב S. cerevisiae ADΔΔ, מוצג. פרוטוקול בידוד קרום פלזמה בקנה מידה קטן זה מייצר ממברנות פלזמה באיכות גבוהה בתוך יום עבודה אחד. תכשירי קרום הפלזמה יכולים לשמש כדי לקבוע את פעילות האנזים של Cdr1 ו- Cdr1 וריאנטים מוטנטיים.

Introduction

מיצוי חלבונים ממברנה אינטגרליים מסביבת השומנים הטבעית שלהם יכול להשפיע באופן דרמטי על המבנה שלהםותפקוד 1,2,3,4. הרכב השומנים המורכב של ממברנות ביולוגיות5 מבטיח כי אינטראקציות חלבון-שומנים חשובות באופן קריטי יכול להתרחש6. שומנים שומרים על השלמות המבנית של חלבוני הממברנה, ובכך מאפשרים להם לתפקד כראוי ביעד תא הממברנהשלהם(ים) 7,8. לכן, צעד ראשון קריטי בטיהור חלבון הממברנה הוא הפקת החלבון מסביבתו הטבעית מבלי להשפיע על המבנה ו/או תפקודו.

ישנם מכשולים רבים לאפיון המבנה של חלבוני הממברנה, שרובם קשורים לאופי ההידרופובי שלהם, ואת הקשיים של ביטוי חלבוני ממברנה מקופלים כראוי פונקציונלי בכמויות הנדרשות קריסטלוגרפיה רנטגן או מיקרוסקופיה קריו-אלקטרונית (cryo-EM)9,10,11,12. ישנם שלושה סוגים של מערכות ביטוי חלבון ממברנה: הומולוג9, הטרולוגי13,14,15,ומערכות ביטוי במבחנה 16,17. רמות הביטוי הנמוכות לעתים קרובות, או העלויות האסורות, של מערכות ביטוי רבות משאירות רק פונדקאים מעטים כאפשרות המועדפת לייצר חלבוני ממברנה. הם כוללים את המארח החיידקי, Escherichia coli, שמרים S. cerevisiae ו Pichia פסטוריס, ו eukaryotes גבוה יותר כגון תאי חרק Sf9 או קווי תאים יונקים18. לכל טכנולוגיות ביטוי חלבון הממברנה יש יתרונות וחסרונות; עם זאת, S. cerevisiae הוא אולי האורגניזם המודל האוקריוטי הנחקר הטוב ביותר המתאים לייצור חלבון ממברנה. זה מאוד תכליתי עם יישומים בהנדסה גנטית, גילוי סמים, ביולוגיה סינתטית, ואת הביטוי של חלבונים ממברנה eukaryotic14,19,20,21.

במחקר זה, פטנט S. cerevisiae קרום ביטוי טכנולוגיית ביטוי21 שימש, עם S. cerevisiae ADΔ14 ו ADΔΔ22 כמו המארחים המועדפים (איור 1A), כדי להדגיש יתר על המידה וללמוד את משאבת efflux רב-תכליתי C. albicans הגדולה Cdr1. שני זני S. cerevisiae הם נגזרות של AD1-8u- 23 שיש להם גם את ura3 (ADΔ) או שניהם ura3 ו שלו1 (ADΔΔ) גנים שנמחקו כדי לחסל כל uracil חיובי שווא או פרוטוטרופים פרוטוטרופים הנובעים דרך שילוב לא רצוי ב URA3 או LOCI הגנומי HIS1. מחיקת 7 משאבות השפכים הרב-תכליתיות העיקריות23, המצוינות באיור 1A, הופכת את ADΔΔ לרגיש להפליא לרוב הקסנוביוטיים. גורם התמלול המוטנטי של הרווח-של-פונקציה Pdr1-3 גורם לביטוי יתר מהווה של חלבוני קרום הטרולוגיים כגון Cdr1 (מתומנים אדומים באיור 1A)לאחר שילוב של קלטת הטרנספורמציה ההטרולוגית-ORF המכילה (איור 1A) בלוקוס PDR5 הגנומי (מלבן כחול באיור 1A)באמצעות שני אירועי רקומבינציה הומולוגית. לוקליזציה נכונה של קרום פלזמה של חלבונים מתויגים C-סופניHis ניתן לאשר על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית (איור 1A), ואת התג שלו יכול לשמש לטיהור ניקל-זיקה של החלבון המתויג. שיבוט כמה מובילי ABC פטרייתיים (למשל, קנדידה krusei ABC1)לתוך pABC3 נגזר plasmids היה, עם זאת, לא אפשרי כי הם לא יכלו להיות מופצים Escherichia קולי בשל רעילות התא. זה הניע את הפיתוח של שיבוט שלב אחד של חלבוני ממברנה14,24 מתויגים ב- N שלהם או C-terminus עם זיקה שונים, אפיטופה, או תגי כתב ישירות לתוך S. cerevisiae ADΔΔ (איור 1C). ס. סרביסיה זני ADΔ מגזים בביטוי יתר של מוטציות CDR1 שונות יכולים גם להיווצר ביעילות בדרך זו באמצעות עד חמישה שברי PCR בודדים החופפים ב- 25 bp (איור 1C). באמצעות פרוטוקול זה, ORFs רבים של עניין ניתן לשכפל, להביע, ומאופיין בעלות נמוכה וביעילות גבוהה בתוך פרק זמן קצר מאוד. יעילות הטרנספורמציה מפחיתה פי 2 בלבד עם כל שבר PCR נוסף.

אם תרצה, ניתן גם לטפל ברמות הביטוי בקלות על-ידי עיצוב פריימר כדי לכוונן את רמות הביטוי כצפוי עד לכל מקום בין 0.1%-50% מרמות הביטוי הגבוהות בדרך כלל25. וקטור השיבוט הנגזר pABC314 הממוטב, pABC3-XLmGFPHis26 (איור 1B) מכיל אתר מחשוף פרוטאז HRV-3C (X; לוולפק| GP), פרוטאז שמבצע טוב יותר ב 4 °C (55 °F) מאשר וירוס תחריט טבק בשימוש תכוף (TEV) פרוטאז27. L הוא מקשר חמש חומצות אמינו (GSGGS), mGFP הוא מוטציה מונומרית (A206K)28,29 גרסה של שמרים משופר ירוק פלואורסצנטי חלבון yEGFP330, שלו הוא שלוש חומצות אמינו מקשר (GGS) ואחריו שישה היסטידין (HHHHHH) ניקל-זיקה חלבון תג.

טכנולוגיית ביטוי זו שימשה בהצלחה בגילוי תרופות ובחקר חלבוני ממברנה. המבנה הראשון עבור יעד תרופה אזול פטרייתי, S. cerevisiae Erg1131, נפתר באמצעות טכנולוגיה זו. זה גם איפשר את האפיון המפורט של C. albicans Cdr132,33,34 ויצירת מולקולת Cdr1 חסר ציסטאין35 מתאים מחקרים ציסטאין crosslinking כדי לאמת כל מבנה ברזולוציה גבוהה בעתיד. מובילים רבים אחרים של ABC מפתוגנים פטרייתיים אנושיים גדולים (כלומר, C. albicans, קנדידה גלברטה, קנדידה אאוריס, קנדידה קרוסיי, קנדידה אוטיליס, קריפטוקוקוס ניאופורמנים, אספרגילוס פומיגאטוס, פניציליום מרנפי ומתחם המינים פוסאריום סולני) נחקרו גם הם בפירוט באמצעות פלטפורמת ביטוי זו24,36,37,38,39. זה איפשר את הדור של פאנל של זני S. cerevisiae overexpressing משאבות שפכים ששימשו במסכי תפוקה גבוהה כדי לגלות את מצע משאבת השפכים הפלואורסצנטית החדשה40 ו41 ספציפית ורחבת טווח14,33,42,43,44 מעכבי משאבת שפכים. השימוש במערכת זו איפשר גם את גילוי קלורגילין כראשון מסוגו מעכב משאבת שפכים רב-תכליתית רב-תכליתית42.

סולוביליזציה מלאה של חלבונים ממברנה ויצירת קרום הומוגני חלבון-micelle הכנה נטולת שומנים אנדוגניים, דורש ריכוזי דטרגנט גבוהים45. אבל למרבה הצער, זה גם לעתים קרובות מנטרל את חלבון הממברנה5,8,45,46. המאפיינים של מונומרים דטרגנט וצבירה שלהם בפתרון מושפעים המאפיינים הפיזיים של הזנב ההידרופובי, האורך והסתעפות של שרשרת אלקיל, נוכחות של גרעין ארומטי או שרשרת צד פלואורואלקיל, או מספר יחידות פוליאוקסיאתילן. לכן, הקרנת דטרגנט היא צעד ראשון חשוב כדי לקבוע את חומר הניקוי המתאים ביותר עבור solubilization חלבון ממברנה וטיהור.

C. albicans הוא פתוגן פטרייתי אנושי גדול של אנשים אימונוקום כי יכול לגרום לזיהומים חמורים, סכנת חיים פולשניות47, וזה יכול להיות עמיד בפני תרופות נגד פטריות אזול48,49. אחד המנגנונים העיקריים של התנגדות multidrug C. albicans הוא ביטוי יתר של Cdr150, שהוא סוג II ATP מחייב טרנספורטר (ABC) טרנספורטר51 של ABCG subfamily הממוקם בקרום הפלזמה. מובילי ABCG פטרייתיים בגודל מלא (המורכבים משני תחומים מחייבים נוקלאוטידים [NBDs] ושני תחומים טרנס-מברניים [TMDs]) ידועים יותר בשם מובילי התנגדות לתרופות פליוטרופיות (PDR) ומאופיינים בטופולוגיית הדומיין ההפוכה הייחודית שלהם [NBD-TMD]2. מובילי PDR נמצאים רק בצמחים52,53 ופטריות54. למרות חשיבותם, אין מבנים עבור מובילי PDR, אם כי מבנים עבור מובילי ABCG בגודל חצי אדם נפתרו לאחרונה אשר סייע ליצור את המודל ההססני הראשון עבור Cdr133. הראיות הניסיוניות האחרונות שלנו מצביעות, עם זאת, כי מודל זה פגום אולי בגלל מובילי PDR פטרייתי יש NBDs אסימטרי אופייני וכתוצאה מכך ייתכן מאוד במנגנון תחבורה ייחודי. מבנה ברזולוציה גבוהה של Cdr1 נדרש, אם כן, הן עבור העיצוב הרציונלי של מעכבי משאבת שפכים חדשניים שעשויים לסייע להתגבר על עמידות לתרופות בתיווך שפכים, והן כדי לספק תובנות על מנגנון הפעולה של משפחת טרנספורטר חשובה זו של ABC.

מטרת מחקר זה הייתה לפתח פרוטוקולים אמינים לביטוי, סולוביליזציה וטיהור של Cdr1 במארח הביטוי S. cerevisiae מהונדס גנטית, במטרה הסופית להשיג מבנה ברזולוציה גבוהה עבור Cdr1. כחלק מתהליך זה, תג כפול mGFPHis באורך פרוטאז (איור 1B) תוכנן עם מקשר של 16 שאריות המפריד בין התג לבין מסוף C של Cdr1, אשר שיפר את הכריכה של תג הזיקה שלו 6x המצורף לשרף זיקת ניקל ואיפשר ניטור של רמות הביטוי Cdr1 בתאים חיים ובמהלך כל תהליך הטיהור. פרוטוקול לשחזור עבור תכשירי חלבון פלזמה שמרים בקנה מידה קטן המכיל כ 10% C. albicans Cdr1 (כפי שהוערך על ידי כתמי Coomassie לאחר SDS-PAGE) פותח גם, אשר יכול לשמש לאפיון הביוכימי של Cdr1.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. הכנת מלאי טרי או קפוא של תאי ADΔ ו- ADΔΔ

  1. לחסן 25 מ"ל של 2x YPCD [כלומר, 2x YPD; 2% (w/v) תמצית שמרים, 2% (w/v) פפטון, 4% (w/v) דקסטרוז), 0.079 % (w/v) CSM (תערובת תוספת מלאה)]35 בינוני עם מושבת שמרים אחת ודגרה לילה (o/n) עבור 16 שעות ב 30 °C עם רועד ב 200 מהפכות לדקה (סל"ד).
  2. לחסן 225 מ"ל של 2x YPCD בינוני עם 25 מ"ל o / n תרבות ולבדוק את הצפיפות האופטית של התא ב 600 ננומטר (OD600); OD600 הוא בדרך כלל ~ 0.5-1.0.
    הערה: בשלב זה ודא כי כל החומרים הנדרשים לניסוי הטרנספורמציה הבא זמינים בקלות.
  3. לגדל את התרבות ב 30 °C (6-8 שעות) עם רעד ב 200 סל"ד עד צפיפות התא מגיע OD600 של ~ 6-8.
    הערה: השלבים הבאים מבוצעים בטמפרטורת החדר (RT) אלא אם צוין אחרת.
  4. קציר תאים אלה שלב לוגריתמי על ידי צנטריפוגה ב 3,000 x g במשך 3 דקות.
  5. resuspend התאים לשטוף אותם פעמיים עם מים סטריליים מזוקקים כפולים (ddH2O; כלומר, 200 מ"ל ולאחר מכן 20 מ"ל).
  6. לקצור את התאים ב 3,000 x g במשך 3 דקות.
  7. לאט (כלומר, להוסיף 30 aliquots שווה של תא מוסמך קפוא (FCC) פתרון כל דקה במשך 30 דקות) resuspend גלולה התא ב X mL של FCC [5% (w/ v) גליצרול, 10% (v / v) דימתיל סולפוקסיד (DMSO)] על קרח (שם X = OD600; למשל, אם OD600 = 6 resuspend ב 6 מ"ל, או אם OD600 = 3 resuspend ב 3 מ"ל).
    הערה: הרכב ה- FCC הנכון הוא קריטי להצלחת הטרנספורמציה.
  8. שמור על תאים על קרח במשך 2 שעות לפני ההמרה או לאחסן aliquots ב -80 °C (70 °F) עד הצורך.
    הערה: תאי ADΔ ו- ADΔΔ רגישים מאוד להקפאה. לכן, יש לקרר תאים לאט עד -80 °C (80 °F): למקם צינורות microcentrifuge קר כקרח המכיל 50-600 aliquots תא μL לתוך תיבת אחסון פלסטיק (RT). מניחים את הקופסה במיכל פוליסטירן גדול יותר (RT) וסוגרים את המיכל עם מכסה פוליסטירן מתאים. לאחר מכן, לשים את המיכל לתוך -80 °C מקפיא.
    זהירות: הקפאה איטית היא קריטית להישרדות התא.

2. טרנספורמציה של ADΔ ו- ADΔΔ עם CaCDR1-XLmGFPHis ואישור של טרנספורמטורים נכונים על ידי PCR המושבה ורצף DNA

הערה: Plasmid pABC3-CDR1-mGFPHis נוצר באמצעות אסטרטגיות שיבוט קונבנציונליות המתוארות בפירוט ב Lamping et al., 201055 והוא מאויר באיור 1B. סוג פראי C. albicans CDR1 היה מבודד כמו PacI /לאאני שבר מ plasmid pABC3-CaCDR1A-GFP14 משובט לתוך pABC3-XLmGFPHis26.

  1. PCR להגביר את כל קלטת טרנספורמציה CDR1 עם פולימראז DNA בנאמנות גבוהה וזוג פריימר PDR5-pro /PDR5-ter35 באמצעות 1-10 ננוגרם של pABC3-CaCDR1-XLmGFPHis כתבנית DNA או, לחלופין, לעכל 2 מיקרוגרם של pABC3-CaCDR1-XLmGFPHis כדי להשלים עם אנזים הגבלת U AscI ב 37 °C (איור 1A, B).
    הערה: קלטת הטרנספורמציה CDR1 (איור 1A) כוללת את מקדם PDR5 - CaCDR1-mGFPHis - שליחות קטלנית PGK1 - סמן בחירה URA3 - אזור PDR5 במורד הזרם.
  2. בצע אלקטרופורזה ג'ל אגרוז ולחלץ את קלטת טרנספורמציה ~ 8 kb.
    הערה: טיהור ג'ל של קלטת הטרנספורמציה של ~8 kb CaCDR1 מסיר כל דנ"א פלסמיד לא מעוקל אפשרי, מה שעלול להוביל לשינויים שגויים שיש להם את כל הפלסמיד, ולא את קלטת הטרנספורמציה הליניארית, המשולבת בלוקוס PDR5 הגנומי.
  3. דנטורה את הכמות הנדרשת של DNA נושא זרע סלמון (2 מ"ג / מ"ל; 10 mM טריס, 1 mM EDTA; pH 7.5) במשך 10 דקות באמבט מים רותחים ולשמור על קרח. השתמש בצינורות בורג לדנ"א זרע סלמון רותח כדי למנוע פתיחת המכסה.
  4. מערבבים 50 μL של DNA זרע סלמון דנטורי עם 14 μL של קלטת טרנספורמציה (500-2,000 ננוגרם) ולשמור את 64 μL של תערובת DNA על קרח עד לשימוש נוסף.
    הערה: השתמש 10 ננוגרם של E. coli- שמרים מעבורת plasmid (למשל, pYES2) כבקרת טרנספורמציה חיובית (איור 2B).
  5. תאים מוסמכים טריים או קפואים מחדש מופשרים במהירות במשך 5 דקות באמבט מים של 30 מעלות צלזיוס ומחלקים אותם ל-50 עליקוטים של μL בצינורות מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל.
  6. קציר תאים על ידי צנטריפוגה במשך 1 דקות במיקרופוגה במהירות מקסימלית (18,000 x גרם).
  7. הסר את supernatant ולשמור את גלולה התא ב RT.
  8. עבור כל טרנספורמציה, לערבב 296 שילובי μL (RT) של 260 μL של 50% (w / v) פוליאתילן גליקול (PEG 3350) ו 36 μL של 1 M ליתיום אצטט (LiAc), על ידי pipetting חוזר, עם 64 μL המתאים של תערובות DNA קר כקרח.
  9. מוסיפים את התערובת המתאימה מיד ל- aliquot גלולה תא מוסמך 50 μL.
  10. resuspend גלולה התא ב 360 μL של תערובת PEG-LiAc-DNA על ידי מערבולת ביסודיות במשך כ -30 s.
  11. לדגור על תערובת התא באמבט מים 30 °C במשך 1 שעה.
    הערה: תאי ADΔ ו- ADΔΔ הופכים טובים יותר ב 30 °C (55 °F) מאשר ב 42 °C(35 °F).
  12. לקצור את התאים ב 18,000 x g עבור 10s. להשליך את supernatant ו resuspend גלולה התא ב 80 μL של ddH2O.
  13. יש למרוח את התאים על צלחת אגר CSM-URA35 [כלומר, 0.67% (w/v) בסיס חנקן שמרים ללא חומצות אמינו, 0.077% (w/v) CSM פחות אורסיל, 2% (w/v) גלוקוז ו-2% (w/v) אגר].
  14. לדגור על הצלחות במשך 2-3 ימים ב 30 °C (50 °F) עד uracil פרוטוטרופים טרנספורמטים נראים בבירור.
    הערה: צפו ~100 טרנספורמטים לμg של קלטת הטרנספורמציה ליניארית ~ 8 kb CaCDR1 ו- ~ 4 x 104 טרנספורמטים ל- μg pYES2.
  15. בחרו חמישה טרנספורמטים עצמאיים ופרחו אותם על צלחת CSM-URA טרייה כדי להפריד את טרנספורמטורי הפרוטוטרופים של אורסיל לבין שרידים של תאים מארחים שלא השתנו.
  16. הסר כל מוטציות קטנות אפשריות על ידי גידול הטרנספורמטים על צלחות YPG-אגר [1% (w/v) תמצית שמרים, 2% (w/v) פפטונה, 2% (v/v) גליסול, ו 2% (w/v) אגר](איור 2D).
    הערה: למוטנטים הקטנים יש מיטוכונדריה פגומה, ולכן הם אינם יכולים לגדול על מקורות פחמן שאינם ניתנים לתסיסה. הם נפוצים למדי ב S. cerevisiae56. ס. סרביסיה ADΔ ו ADΔΔ נוטים במיוחד לרכוש את הפנוטיפ הקטן.
  17. בצעו PCR של מושבת שמרים ואשרו לפחות שלושה טרנספורמטורים עצמאיים שישולבו כראוי בלוקוס PDR5 הגנומי (איור 1C) על-ידיגברת כל קלטת הטרנספורמציה של CaCDR1 בגודל ~8 kb עם פולימראז DNA ספציפי הממוטב להגברת מוצרי PCR ממקורות תבנית DNA טמאים. השתמש קבוצה של פריימרים שנקשרים ממש מחוץ לאתר האינטגרציה ו- 1 μL aliquots של השעיות תאים (ב- ddH2O) הנגזר ממושבות בודדות כתבניות DNA.
    הערה: זה פולימראז DNA מסוים מגביר באופן אמין ~ 8 kb שברי PCR מתאי שמרים שלמים. עם זאת, עבור הגברה אמינה, 45 מחזורי PCR נדרשים, ואת תאי שמרים חייב להיות resuspended ב OD600 1-10 ב ddH2O.
  18. אשר את מוצר הגברה PCR הנכון ~ 8 kb על ידי DNA agarose ג'ל אלקטרופורזה של חלק 1 μL של תגובת PCR.
  19. הסר פריימרים להגברה עודפת מחלק 10 μL של תגובת PCR עם תערובת אנזימים של exonuclease DNA גדיל יחיד ופוספטאז בעקבות הוראות היצרן לפני רצף ORF כולו באמצעות חלקים של דגימת ה- DNA המטופל עם פריימרים מתאימים.

3. פרוטוקול בידוד פלזמה שמרים בקנה מידה קטן

  1. גידול תאי שמרים
    1. טרום תרבות מושבת שמרים אחת ב 10 מ"ל של YPD ב 30 °C (7-8 שעות עם רועד ב 200 סל"ד.
    2. לחסן 40 מ"ל של בינוני YPD עם 10 מ"ל טרום תרבית ולדגירה את התאים ב 30 °C /n (~ 16 שעות) עם רועד ב 200 סל"ד עד צפיפות התא מגיע OD600 של 1-3.
  2. קצירת תאי שמרים
    1. קציר 40 יחידות OD (ODU; למשל, 1 מ"ל ב OD600 של 1 = 1 ODU) של תאים לוגריתמיים פאזה ב 4,200 x גרם במשך 5 דקות ב 4 °C (5 °F).
    2. resuspend ולשטוף תאים פעמיים עם ddH קר כקרח סטרילי2O (כלומר, 40 מ"ל ולאחר מכן 1 מ"ל; תאי קציר בין צעדים על ידי צנטריפוגה ב 4,200 x גרם במשך 5 דקות ב 4 °C (5 °F).
    3. resuspend הכדור ב 1 מ"ל של ddH קר קר קר ddH2O ולהעביר את השעיית התא לתוך מקורר מראש (על קרח) 1.5 מ"ל צינור microcentrifuge.
    4. קציר תאים ב 3,300 x g במשך 3 דקות ב 4 °C (70 °F).
    5. שאף את סופר-טבעי.
    6. Resuspend גלולה התא ב 0.5 מ"ל חיץ הומוגניזציה [HB; 50 mM טריס, 0.5 mM EDTA, 20% (v/ v) גליצרול; pH 7.5] טרי בתוספת 1 mM פנילמתילסולפוניל פלואוריד (PMSF).
      הערה: הוסף תמיד PMSF טרי מכיוון ש- PMSF אינו מופעל במהירות עם החשיפה למים.
      זהירות: PMSF הוא מעכב פרוטאז סרין, שהוא מאכל מאוד והרסני לרקמות. זה עלול לגרום לנזק בלתי הפיך לעיניים.
    7. לאחסן את ההשעיה התא ב -80 °C (80 °F) או להשתמש מיד.
  3. בידוד של ממברנות פלזמה
    1. אם קפוא, להפשיר את התאים על קרח עבור ~ 1 שעה.
    2. הוסף חרוזי סיליקה בקוטר 0.5 מ"מ קרים כקרח להשעיית תאי 0.5 מ"ל כדי להגיע לנפח כולל של 1 מ"ל.
    3. לשבור תאים עם 6 מחזורים של מערבולת בעוצמה רועדת מקסימלית במשך 1 דקות שזורות עם 3 דקות תקופות קירור על קרח.
    4. הפוך חור דק בתחתית הצינור עם להב אזמל מחומם.
    5. לאסוף את התא השבור הומוגנט דרך החלק התחתון של הצינור מצויד עוד צינור microcentrifuge קר כקרח עם ספין 10 s במהירות נמוכה (~ 200 סל"ד).
      הערה: זה מבטיח כי חרוזי סיליקה להישאר בצינור המקורי.
    6. צנטריפוגות התא הומוגנט ב 5,156 x g במשך 5 דקות ב 4 °C (70 °F) כדי להסיר פסולת תאים, תאים רצוף, גרעין.
    7. העבר 450 μL של supernatant לתוך קר כקרח 1.5 מ"ל microcentrifuge צינור ולהוסיף 1 מ"ל נוספים של HB קר כקרח בתוספת PMSF טרי (1 mM).
      הערה: שלב דילול זה הוא קריטי להתאוששות חלבון קרום פלזמה באיכות גבוהה.
    8. קציר קרום פלזמה ב 17,968 x g עבור 1 שעות ב 4 °C (4 °C) ו resuspend גלולה קרום פלזמה, על ידי pipetting חוזר, ב 100 μL של HB טרי בתוספת 1 mM PMSF. לשחרר את גלולה התא עבור הומוגניזציה קרום פלזמה נכונה על ידי ערבוב גלולה התא עם קצה 100 μL pipette לפני שחרור 100 μL של HB וצינורות למעלה ולמטה.
    9. מדוד את ריכוז החלבון של הכנת קרום הפלזמה עם ערכת בדיקת חלבון התואמת למאגרים המכילים חומר הפחתת חומר וחומר ניקוי.
    10. לאחסן את ממברנות הפלזמה ב -80 °C (80 °F) או לשמור על קרח לשימוש מיידי.

4. נתרן דודסיל סולפט פולאקרילמיד ג'ל אלקטרופורזה (SDS-PAGE)

  1. להרכיב את המנגנון להכנת ג'לים polyacrylamide.
  2. עבור שני ג'לים מפרידים (7% פוליאקרילמיד), יש לערבב 2.1 מ"ל של 40% אקרילאמיד/ביס-אקרילאמיד, 3 מ"ל של 4x הפרדת חוצץ (1.5 M טריס, 0.4% נתרן דודסיל סולפט [SDS] (w/v); pH 8.8), ו 6.9 מ"ל של ddH2O. להוסיף 8 μL של tetramethyl אתילנדיאמין (TEMED) ו 60 μL של 10% אמוניום פרסולפט (APS) ליזום פילמור של אקרילאמיד.
    זהירות: אקרילאמיד/ביס-אקרילאמיד רעיל מאוד. זה גורם לגירוי בעור, נוירופתיה היקפית והוא מסרטן. TEMED מזיק אם הוא נבלע או נשאף. APS מזיק אם נבלע. זה גורם לגירויים חמורים בעין ובעור.
  3. יוצקים ~ 4-5 מ"ל של תערובת זו לתוך מנגנון הג'ל המורכב, עד ~ 2 ס"מ מלמעלה.
  4. שכבה בזהירות ~ 1-2 מ"ל של 0.1% SDS למעלה כדי ליצור מניסקוס מנדר.
  5. אפשר לפוליאקרילמיד להגדיר במשך ~ 60 דקות ב RT.
  6. הכן תערובת ג'ל לערום עבור שני ג'לים על ידי ערבוב 0.5 מ"ל של 40% אקרילאמיד / ביס-אקרילאמיד, 1 מ"ל של 4x buffer לערום (0.5 M טריס, 0.4% SDS (w / v); pH 6.8), ו 6.9 מ"ל של ddH2O. הוסף 2 μL של TEMED ו 30 μL של 10% APS ליזום פילמור של אקרילאמיד.
  7. הסר את שכבת ה-SDS 0.1% מהג'ל המפריד הפולימרי ושטוף עם ddH2O כדי להסיר עקבות של SDS.
  8. יוצקים את תערובת ג'ל הערימה על ג'ל ההפרדה.
  9. מניחים מסרק לתוך ג'ל הערימה ולהסיר את כל בועות האוויר מסביב מסרק.
  10. אפשר ג'ל לערום להגדיר במשך ~ 60 דקות ב RT.
  11. הסר את המסרק ולשטוף את חריצי הג'ל במים. שים את הג'ל במיכל הג'ל ומלא את מיכל הג'ל למעלה עם חוצץ ריצה 1x (24.8 מ"מ טריס, 190 mM גליצין, 0.1% SDS).
    הערה: הכן מאגר פועל 1x ממלאי חיץ 10x (248 mM Tris, 1.9 M גליצין, 1% SDS (w/v) ב- ddH2O) המאוחסן ב- RT.
  12. ערבבו דגימות קרום פלזמה 5-10 מיקרו-מילימטר (כלומר, 10-20 מיקרוגרם חלבון) עם נפחים שווים של 2x צבע טעינת חלבון [120 mM Tris-HCl (pH 6.8), 20% גליצריול, 0.02% ברומופנול כחול, 4% SDS, 200 mM dithiothreitol (DTT)] ומיד לטעון לחריצי ג'ל בודדים שקועים במאגר פועל.
    אזהרה: DTT מזיק אם נבלע. זה גורם לגירויים חמורים בעין ובעור.
    הערה: הפוך מלאי 10 מ"ל של צבע טעינת חלבון 2x, aliquot ולאחסן ב -20 °C (70 °F). אין לחמם את הדגימות המעורבות אלא לטעון אותן מיד לחריצי ג'ל בודדים, כך שתג GFP אינו נגח, וניתן לזהות את אותות הפלואורסצנטיות של הג'ל.
  13. טען סמני משקל מולקולריים של חלבון (טווח 10-245 kDa) לחריץ נפרד כדי לאפשר הערכת גודל של שברי חלבון בודדים.
  14. בצע אלקטרופורזה ג'ל ב 200 V עד צבע הטעינה הכחול מגיע לתחתית הג'ל (בדרך כלל 45-55 דקות).
  15. בדוק את הג'ל עבור in-gel GFP-פלואורסצנטיות עם מערכת הדמיה ג'ל (עירור ואורכי גל פליטה הם 475-485 ננומטר ו 520 ננומטר, בהתאמה).
  16. לאחר הדמיית פלואורסצנטיות בג'ל, לתקן חלבונים על ידי עצבנות עדינה של הג'ל בתמיסת תיקון ג'ל חלבון ~ 10-20 מ"ל (40% אתנול, 10% חומצה אצטית) למשך 15 דקות ב- RT.
  17. יש לשטוף את הג'ל פעמיים למשך 10 דקות עם 10 מ"ל של ddH2O ולדמיין רצועות חלבון על ידי הצבת הג'ל בתמיסת כתמי קומאסי קולואידית בגודל 10 מ"ל עם רעד עדין למשך שעה ב-RT.
  18. להדמיה משופרת של רצועות חלבון, דה-מכתים את הג'ל פעם או פעמיים ב- ~ 20 מ"ל של ddH2O למשך ~ 1 שעות לפני הקלטת תמונות עם מערכת הדמיית הג'ל.

5. קביעת פעילויות ATPase CDR1 57

  1. לדלל דגימות קרום פלזמה >2.2 מ"ג / מ"ל ל 1-2 מ"ג / מ"ל ב- HB.
  2. יש להקפיד על קוקטייל ה-ATPase assay (75 mM MES-Tris, 75 mM אשלגן חנקתי, 0.3 מ"מ אמוניום מוליבידאט, 7.5 מ"מ נתרן אזיד; pH 7.5) ו-Mg-ATP (28.8 מ"מ מלח דיסודיום ATP, 28.8 מ"מ MgCl2; pH 7.0) עד 30 °C בחממה של 30 °C.
    זהירות: נתרן אזיד רעיל מאוד.
    הערה: ודא שכל מלאי המאגר והבקבוקים הם ללא פוספט; כלומר, לשטוף כלי זכוכית עם 1% (vol/vol) HCl ולשטוף אותו מספר פעמים עם ddH2O. כמו כן, לשמור אותו בנפרד מכלי זכוכית אחרים כי סביר להניח מכיל עקבות של פוספט בדרך כלל נוכח דטרגנטים המשמשים לשטוף כלי זכוכית.
  3. הוסף 90 μL של קוקטייל אסאי עם או בלי מעכב Cdr1-ATPase (20 מיקרומטר של אוליגומיצין) לתוך בארות בודדות של צלחת microtiter 96 טוב.
    הערה: ההסתה מבוצעת במשולש.
  4. הוסף 5 μL של קרום הפלזמה המבודד (~ 5-10 מיקרוגרם חלבון) או תקני פוספט (0-100 נמול פאי) לתוך בארות המתאימות של צלחת microtiter.
    הערה: שמור את העמודות הראשונות והאחרונות עבור שתי ערכות נפרדות של תקני פוספט.
  5. התחל את ההסתערות על ידי הוספת 25 μL של 28.8 מ"מ מ"מ Mg-ATP (ריכוז סופי של 6 מ"מ) עם פיפטה רב ערוצית לבארות בודדות ודגרה ב 30 °C (30 °F) במשך 30 דקות.
  6. עצרו את התגובה על ידי הוספת 130 מיקרו-אל של ריאגנט פיתוח (1.6% נתרן L-אסקורבאט, 1% SDS, 12% אמוניום מוליבאדאט ב-6 M חומצה גופרתית).
    זהירות: חומצה גופרתית מרוכזת מגיבה באלימות במים. זה מאכל ועלול לגרום נזק לעור ולריאות.
  7. דגירה ב RT במשך 10 דקות.
  8. קרא את הספיגה של בארות צלחת microtiter ב 750 ננומטר עם קורא לוחות microtiter.
    הערה: היצמדות לזמן הדגירה של 10 דקות לפיתוח צבע כחול (כלומר, קומפלקס זרחן-מוליבדן מופחת) היא קריטית לדיוק ה- assay מכיוון שהתפתחות הצבע הכחול נמשכת עם הזמן.
  9. להשיג את פעילות ATPase ספציפי CDr1 (כלומר, פעילות ATPase רגיש אוליגומיצין) על ידי הפחתה של פעילות ATPase בנוכחות אוליגומיצין מכלל פעילות ATPase בהיעדר אוליגומיצין.

6. מסך דטרגנט בקנה מידה קטן

  1. שלב את תכשירי קרום הפלזמה (כלומר, 2.5 מ"ג של חלבון קרום פלזמה) של תאים המשמידים יתר על המידה Cdr1-mGFPHis עם חיץ GTED-20 [10 mM Tris, 0.5 mM EDTA, 20 % (w/v) גלצל; pH 7.5; תוספת טרייה עם 1 mM PMSF] המכיל 5 מ"ג של חומר ניקוי הבדיקה, כדי להגיע לנפח כולל של 0.5 מ"ל בתוספת 1% (w/v) דטרגנט.
  2. לסובב את התערובת ב 4-8 °C (5 °F) במשך 2 שעות, עם התקן סיבוב.
  3. צנטריפוגות התערובת ב 141,000 x גרם ב 4 °C (50 °F) במשך 1 שעה.
  4. מעבירים את חומר העל המכיל חומר סולובילי לצינור מיקרוצנטריפוגה טרי.
  5. הוסיפו 0.5 מ"ל של חיץ GTED-20 בתוספת 2% (w/v) SDS לשבר הכדור המסיס ודגרה ב-30 °C o/n באינקובטור רועד כדי לחלץ את כל חלבון הממברנה החדיר לדטרגנט.
  6. נתח והשווה את שברי הכדורים השופע והסולובילים על-ידי SDS-PAGE.
  7. ג'ל צילום המכיל חלבונים מתויגים GFP עבור in-gel GFP-פלואורסצנטיות לפני כתמי קומאסי וכימות רמות הביטוי עם מערכת ההדמיה.
  8. השתמש בשבר חלבון הממברנה המסיס עבור יישומים במורד הזרם כגון כרומטוגרפיה של אי-הכללה בגודל פלואורסצנטי (FSEC)58 כדי לזהות חומרי ניקוי מתאימים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

תדירות גבוהה של טרנספורמציה של S. cerevisiae ADΔΔ (~ 4 x 104 טרנספורמטורים / מיקרוגרם) הושגה עם pYES2 (איור 2B). כצפוי, בקרת השינוי ללא DNA (כלומר, ddH2O בלבד) לא נתנה טרנספורמטורים, ו- 1 מיקרוגרם של קלטת הטרנספורמציה הליניארית של CDR1-mGFPHis (איור 1A) העניקה ~ ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

למרות ההתקדמות האחרונה בניתוח המבני של חלבוני ממברנה, אין מבנה תלת-ממדי עבור Cdr1, או כל טרנספורטר PDR אחר, זמין כעת. לכן, רכישת ידע על מבנה Cdr1 ואת התכונות הביוכימיות שלה חשוב, כמו זה לא רק לספק תובנה על עיצוב רציונלי של תרופות חדשניות כדי להתגבר על עמידות לתרופות בתיווך שפכים, אלא גם לתוך מנגנון...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

המחברים מודים במימון מקרן מרסדן בניו זילנד (Grant UOO1305), ומענק בלוק מהפקולטה לרפואה, אוניברסיטת צ'ולאלונגקורן, בנגקוק, תאילנד (M. Niimi). הם מבקשים להודות לאוניברסיטת אוטגו על שהעניקה לג' מדאני מלגת דוקטורט. המחברים מבקשים גם להביע את תודתם לפרופסור סטפן ראונסר ועמיתיו, ד"ר אמיר אפלבאום, וד"ר דיבאנאיאגבארתי ויניאגאם, על תמיכתם ופיקוחם במהלך ביקור בן 6 חודשים של ג' מדאני במכון מקס פלנק לפיזיולוגיה מולקולרית (MPIMP), דורטמונד, גרמניה. המחברים מודים גם לשירות חילופי האקדמיה הגרמנית (DAAD) על כך שהעניק לג'י מדאני מענק מחקר (57381332) לביקור ב- MPIMP.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
2-(N-Morpholino)ethane-sulphonic acid (MES)Sigma-AldrichM3671
2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol (Tris base; ultra-pure)Merck77-86-1
2,2-Didecylpropane-1,3-bis-β-D-maltopyranosideAnatraceNG310SLMNG
2,2-Dihexylpropane-1,3-bis-β-D-glucopyranosideAnatraceNG311SOGNG (MNG-OG)
2,2-Dioctylpropane-1,3-bis-β-D-maltopyranosideAnatraceNG322SDMNG
4-Trans-(4-trans-propylcyclohexyl)-cyclohexyl α-D-maltopyranosideGlycon Biochemicals GmbHD99019-CPCC-α-M
40% Acrylamide/Bis-acrylamide (37.5:1)Bio-Rad1610148
Acetic acid (glacial)Merck64-19-7
AgarFormedium 009002-18-0
Ammonium molybdateSigma-Aldrich13106-76-8
Ammonium persulphate (APS)Bio-Rad1610700
ATP disodium saltsigma-AldrichA-6419
Bromophenol blueSERVA Electrophoresis GmbH34725-61-6
CHAPSAnatraceC316S
CHAPSOAnatraceC317S
CSMFormediumDCS0019
CSM minus uracilFormediumDCS0161
Cyclohexyl-1-butyl-β-D-maltopyranosideAnatraceC324SCYMAL-4
Cyclohexyl-1-heptyl-β-D-maltopyranosideAnatraceC327SCYMAL-7
Cyclohexyl-methyl-β-D-maltopyranosideAnatraceC321SCYMAL-1
DigitoninSigma-Aldrich11024-24-1
Dithiothreitol (DTT)Roche Diagnostics10197785103
DMSOMerck67-68-5
EthanolMerck459836
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA; Titriplex III)Merck6381-92-6
ExoSAP-IT PCR Product Cleanup ReagentApplied Biosystems78205A blend of exonuclease and phosphatase
GlucoseFormedium50-99-7
GlycerolMerck56-81-5
GlycineMerckG8898
HEPESFormedium7365-45-9
Hydrochloric acidMerck1003172510
KOD Fx NeoTOYOBO CoKFX-201Use for reliable colony PCR
lithium acetate (LiAc)Sigma-Aldrich546-89-4
Magnesium chloride hexa-hydratesigma-AldrichM2393
MESFormedium145224-94-8
n-Decanoyl-N-hydroxyethyl-glucamideAnatraceH110SHEGA-10
n-Decanoyl-N-methyl-glucamideAnatraceM320SMEGA-10
n-Decyl-phosphocholineAnatraceF304SFos-choline-10
n-Decyl-β-D-maltopyranosideAnatraceD322SDM
n-Dodecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulphonateAnatraceAZ312SAnzergent 3-12
n-Dodecyl-N,N-dimethylamine-N-oxideAnatraceD360SLDAO
n-Dodecyl-α-D-maltopyranosideAnatraceD310HAα-DDM
n-Dodecyl-β-D-maltopyranosideAnatraceD310Sβ-DDM
n-Nonyl-β-D-glucopyranosideAnatraceN324SNG
n-Nonyl-β-D-maltopyranosideAnatraceN330SNM
n-Octadecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulphonateAnatraceAZ318SAnzergent 3-18
n-Octyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulphonateAnatraceAZ308SAnzergent 3-8
n-Octyl-phosphocholineAnatraceF300SFos-choline-8
n-Octyl-β-D-glucopyranosideAnatraceO311SOG
n-Tetradecyl-phosphocholineAnatraceF312SFos-choline-14
n-Tetradecyl-β-D-maltopyranosideAnatraceT315STDM
n-Tridecyl-phosphocholineAnatraceF310SFos-choline-13
n-Tridecyl-β-D-maltopyranosideAnatraceT323S-
n-Undecyl-β-D-maltopyranosideAnatraceU300SUM (UDM)
N,N,N’,N’-tetramethyl-ethylenediamine (TEMED)Sigma-AldrichT9281
OctylphenoxypolyethoxyethanolSigma-Aldrich9002-93-1TRITON X-100
OligomycinSigma-Aldrich75351
PeptoneFormedium3049-73-7
phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)Roche Diagnostics329-98-6
Phusion Hot Start Flex DNA PolymeraseNew England BiolabsM0535SHigh-fidelity DNA polymerase
polyethylene glycol (PEG 3350)Sigma-Aldrich25322-68-3
polyoxyethylenesorbitan monooleateSigma-Aldrich9005-65-6TWEEN 80
Potassium nitrateSigma-AldrichP8394
Protein Assay KitBio-Rad5000122RC DC Protein Assay Kit II
QC Colloidal Coomassie StainBio-Rad1610803
Prism Ultra Protein Ladder (10-245 kDa)AbcamAB116028
Sodium azideSigma-Aldrich71289
Sodium dodecyl sulphateSigma-Aldrich151-21-3SDS
Sodium L-ascorbate BioXtraSigma-Aldrich11140
Sucrose MonododecanoateAnatraceS350SDDS
Sulphuric acidSigma-Aldrich339741
Yeast extractFormedium008013-01-2
Yeast nitrogen base without amino acidsFormediumCYN0402
 Equipment (type)
Centrifuge  (Eppendorf 5804)Eppendorf
Centrifuge (Beckman Ultra)Beckman
Centrifuge (Sorvall RC6)Sorvall
FSEC apparatus (NGC Chromatography Medium Pressure system equipped with a fluorescence detector, an autosampler, a fractionator)Bio-Rad
Gel imaging (GelDoc EZ Imager)Bio-Rad
Microplate reader (Synergy 2 Multi-Detection)BioTek Instruments
PCR thermal cycler (C1000 Touch)Bio-Rad
Power supply (PowerPac)Bio-Rad
SDS PAGE (Mini-PROTEAN Tetra)Bio-Rad
Shaking incubator (Multitron)Infors HT, Bottmingen
Superose 6 Increase 10/300 GLGE Healthcare Life SciencesGE17-5172-01
UV/Visible spectrophotometer (Ultraspec 6300 pro)Amersham BioSciences UK Ltd

References

  1. Arachea, B. T., et al. Detergent selection for enhanced extraction of membrane proteins. Protein Expression and Purification. 86 (1), 12-20 (2012).
  2. Guo, Y. Be cautious with crystal structures of membrane proteins or complexes prepared in detergents. Crystals (Basel). 10 (2), 86(2020).
  3. Lewinson, O., Orelle, C., Seeger, M. A. Structures of ABC transporters: handle with care. FEBS Letters. 594 (23), 3799-3814 (2020).
  4. Luckey, M. Membrane Structural Biology: With Biochemical and Biophysical Foundations. , Cambridge University Press. Ch. 4 69-105 (2014).
  5. Opekarova, M., Tanner, W. Specific lipid requirements of membrane proteins--a putative bottleneck in heterologous expression. Biochimica et Biophysica Acta. 1610 (1), 11-22 (2003).
  6. Qiu, W., et al. Structure and activity of lipid bilayer within a membrane-protein transporter. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (51), 12985-12990 (2018).
  7. Dowhan, W. Molecular basis for membrane phospholipid diversity: why are there so many lipids. Annual Review of Biochemistry. 66, 199-232 (1997).
  8. Lee, A. G. Lipid-protein interactions in biological membranes: a structural perspective. Biochimica et Biophysica Acta. 1612 (1), 1-40 (2003).
  9. Ahn, J. H., Pan, J. G., Rhee, J. S. Homologous expression of the lipase and ABC transporter gene cluster, tliDEFA, enhances lipase secretion in Pseudomonas spp. Applied and Environmental Microbiology. 67 (12), 5506-5511 (2001).
  10. Newby, Z. E., et al. A general protocol for the crystallization of membrane proteins for X-ray structural investigation. Nature Protocols. 4 (5), 619-637 (2009).
  11. Parker, J. L., Newstead, S. Membrane protein crystallisation: current trends and future perspectives. Advances in Experimental Medicine and Biology. 922, 61-72 (2016).
  12. Wiener, M. C. A pedestrian guide to membrane protein crystallization. Methods. 34 (3), 364-372 (2004).
  13. Grisshammer, R. Understanding recombinant expression of membrane proteins. Current Opinion in Biotechnology. 17 (4), 337-340 (2006).
  14. Lamping, E., et al. Characterization of three classes of membrane proteins involved in fungal azole resistance by functional hyperexpression in Saccharomyces cerevisiae. Eukaryot Cell. 6 (7), 1150-1165 (2007).
  15. Macauley-Patrick, S., Fazenda, M. L., McNeil, B., Harvey, L. M. Heterologous protein production using the Pichia pastoris expression system. Yeast. 22 (4), 249-270 (2005).
  16. Focke, P. J., et al. Combining in vitro folding with cell free protein synthesis for membrane protein expression. Biochemistry. 55 (30), 4212-4219 (2016).
  17. Reckel, S., et al. Strategies for the cell-free expression of membrane proteins. Methods in Molecular Biology. 607, 187-212 (2010).
  18. Pandey, A., Shin, K., Patterson, R. E., Liu, X. Q., Rainey, J. K. Current strategies for protein production and purification enabling membrane protein structural biology. Biochemistry and Cell Biology. 94 (6), 507-527 (2016).
  19. Harvey, C. J. B., et al. HEx: A heterologous expression platform for the discovery of fungal natural products. Science Advances. 4 (4), (2018).
  20. Kingsman, S. M., Kingsman, A. J., Dobson, M. J., Mellor, J., Roberts, N. A. Heterologous gene expression in Saccharomyces cerevisiae. Biotechnology & Genetic Engineering Reviews. 3, 377-416 (1985).
  21. Monk, B. C., et al. Yeast membrane protein expression system and its application in drug screening. US patent. , 8728797 NZ 513755, AU 2002330796, US 8728797 patent NZ 513755, AU 2002330796 (2002).
  22. Sagatova, A. A., Keniya, M. V., Wilson, R. K., Monk, B. C., Tyndall, J. D. Structural insights into binding of the antifungal drug fluconazole to Saccharomyces cerevisiae lanosterol 14alpha-demethylase. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (8), 4982-4989 (2015).
  23. Decottignies, A., et al. ATPase and multidrug transport activities of the overexpressed yeast ABC protein Yor1p. The Journal of Biological Chemistry. 273 (20), 12612-12622 (1998).
  24. Lamping, E., Zhu, J. Y., Niimi, M., Cannon, R. D. Role of ectopic gene conversion in the evolution of a Candida krusei pleiotropic drug resistance transporter family. Genetics. 205 (4), 1619-1639 (2017).
  25. Lamping, E., Niimi, M., Cannon, R. D. Small, synthetic, GC-rich mRNA stem-loop modules 5' proximal to the AUG start-codon predictably tune gene expression in yeast. Microbial Cell Factories. 12, 74(2013).
  26. James, J. E., Lamping, E., Santhanam, J., Cannon, R. D. PDR transporter ABC1 is involved in the innate azole resistance of the human fungal pathogen Fusarium keratoplasticum. Frontiers in Microbiology. , (2021).
  27. Ullah, R., et al. Activity of the human rhinovirus 3C protease studied in various buffers, additives and detergent solutions for recombinant protein production. PLoS One. 11 (4), 0153436(2016).
  28. von Stetten, D., Noirclerc-Savoye, M., Goedhart, J., Gadella, T. W., Royant, A. Structure of a fluorescent protein from Aequorea victoria bearing the obligate-monomer mutation A206K. Acta Crystallographica Section F. Structural Biology and Crystalization Communications. 68, Pt 8 878-882 (2012).
  29. Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells. Science. 296 (5569), 913-916 (2002).
  30. Cormack, B. P., et al. Yeast-enhanced green fluorescent protein (yEGFP): a reporter of gene expression in Candida albicans. Microbiology (Reading). 143, Pt 2 303-311 (1997).
  31. Monk, B. C., et al. Architecture of a single membrane spanning cytochrome P450 suggests constraints that orient the catalytic domain relative to a bilayer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (10), 3865-3870 (2014).
  32. Holmes, A. R., et al. ABC transporter Cdr1p contributes more than Cdr2p does to fluconazole efflux in fluconazole-resistant Candida albicans clinical isolates. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 52 (11), 3851-3862 (2008).
  33. Tanabe, K., et al. FK506 resistance of Saccharomyces cerevisiae Pdr5 and Candida albicans Cdr1 involves mutations in the transmembrane domains and extracellular loops. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 63 (1), 01146(2019).
  34. Tanabe, K., et al. Chimeras of Candida albicans Cdr1p and Cdr2p reveal features of pleiotropic drug resistance transporter structure and function. Molecular Microbiology. 82 (2), 416-433 (2011).
  35. Madani, G., Lamping, E., Cannon, R. D. Engineering a cysteine-deficient functional Candida albicans Cdr1 molecule reveals a conserved region at the cytosolic apex of ABCG transporters important for correct folding and frafficking of Cdr1. mSphere. 6 (1), (2021).
  36. Lamping, E., et al. Abc1p is a multidrug efflux transporter that tips the balance in favor of innate azole resistance in Candida krusei. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (2), 354-369 (2009).
  37. Panapruksachat, S., et al. Identification and functional characterization of Penicillium marneffei pleiotropic drug resistance transporters ABC1 and ABC2. Medical Mycology. 54 (5), 478-491 (2016).
  38. Wada, S., et al. Phosphorylation of Candida glabrata ATP-binding cassette transporter Cdr1p regulates drug efflux activity and ATPase stability. The Journal of Biological Chemistry. 280 (1), 94-103 (2005).
  39. Watanasrisin, W., et al. Identification and characterization of Candida utilis multidrug efflux transporter CuCdr1p. FEMS Yeast Research. 16 (4), (2016).
  40. Ivnitski-Steele, I., et al. Identification of Nile red as a fluorescent substrate of the Candida albicans ATP-binding cassette transporters Cdr1p and Cdr2p and the major facilitator superfamily transporter Mdr1p. Analytical Biochemistry. 394 (1), 87-91 (2009).
  41. Niimi, K., et al. Specific interactions between the Candida albicans ABC transporter Cdr1p ectodomain and a D-octapeptide derivative inhibitor. Molecular Microbiology. 85 (4), 747-767 (2012).
  42. Holmes, A. R., et al. The monoamine oxidase A inhibitor clorgyline is a broad-spectrum inhibitor of fungal ABC and MFS transporter efflux pump activities which reverses the azole resistance of Candida albicans and Candida glabrata clinical isolates. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 56 (3), 1508-1515 (2012).
  43. Reis de Sa, L. F., et al. Synthetic organotellurium compounds sensitize drug-resistant Candida albicans clinical isolates to fluconazole. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 61 (1), 01231(2017).
  44. Tanabe, K., et al. Inhibition of fungal ABC transporters by unnarmicin A and unnarmicin C, novel cyclic peptides from marine bacterium. Biochemical and Biophysical Research Communications. 364 (4), 990-995 (2007).
  45. le Maire, M., Champeil, P., Moller, J. V. Interaction of membrane proteins and lipids with solubilizing detergents. Biochimica et Biophysica Acta. 1508 (1-2), 86-111 (2000).
  46. Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera. Biochimica et Biophysica Acta. 1666 (1-2), 105-117 (2004).
  47. Pfaller, M. A. Nosocomial candidiasis: emerging species, reservoirs, and modes of transmission. Clinical Infectious Diseases. 22, Suppl 2 89-94 (1996).
  48. Cannon, R. D., et al. Efflux-mediated antifungal drug resistance. Clinical Microbiology Reviews. 22 (2), 291-321 (2009).
  49. Sanglard, D., et al. Mechanisms of resistance to azole antifungal agents in Candida albicans isolates from AIDS patients involve specific multidrug transporters. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 39 (11), 2378-2386 (1995).
  50. Prasad, R., De Wergifosse, P., Goffeau, A., Balzi, E. Molecular cloning and characterization of a novel gene of Candida albicans, CDR1, conferring multiple resistance to drugs and antifungals. Current Genetics. 27 (4), 320-329 (1995).
  51. Lamping, E., Madani, G., Lee, H. J., Niimi, M., Cannon, R. D. Candida albicans: Cellular and Molecular Biology. Prasad, R. , Chapter 18 379-406 (2017).
  52. Crouzet, J., Trombik, T., Fraysse, A. S., Boutry, M. Organization and function of the plant pleiotropic drug resistance ABC transporter family. FEBS Letters. 580 (4), 1123-1130 (2006).
  53. Kang, J., et al. Plant ABC Transporters. Arabidopsis Book. 9, 0153(2011).
  54. Lamping, E., et al. Fungal PDR transporters: phylogeny, topology, motifs and function. Fungal Genetics and Biology. 47 (2), 127-142 (2010).
  55. Lamping, E., Cannon, R. D. Use of a yeast-based membrane protein expression technology to overexpress drug resistance efflux pumps. Methods in Molecular Biology. 666, 219-250 (2010).
  56. Day, M. Yeast petites and small colony variants: for everything there is a season. Advances in Applied Microbiology. 85, 1-41 (2013).
  57. Niimi, K., et al. Chemosensitization of fluconazole resistance in Saccharomyces cerevisiae and pathogenic fungi by a D-octapeptide derivative. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 48 (4), 1256-1271 (2004).
  58. Kawate, T., Gouaux, E. Fluorescence-detection size-exclusion chromatography for precrystallization screening of integral membrane proteins. Structure. 14 (4), 673-681 (2006).
  59. Hao, Z., et al. A novel and fast purification method for nucleoside transporters. Frontiers in Molecular Biosciences. 3, 23(2016).
  60. Nakamura, K., et al. Functional expression of Candida albicans drug efflux pump Cdr1p in a Saccharomyces cerevisiae strain deficient in membrane transporters. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 45 (12), 3366-3374 (2001).
  61. Bernaudat, F., et al. Heterologous expression of membrane proteins: choosing the appropriate host. PLoS One. 6 (12), 29191(2011).
  62. Byrne, B. Pichia pastoris as an expression host for membrane protein structural biology. Current Opinion in Structural Biology. 32, 9-17 (2015).
  63. Holmes, A. R., et al. Heterozygosity and functional allelic variation in the Candida albicans efflux pump genes CDR1 and CDR2. Molecular Microbiology. 62 (1), 170-186 (2006).
  64. Keniya, M. V., et al. Drug resistance is conferred on the model yeast Saccharomyces cerevisiae by expression of full-length melanoma-associated human ATP-binding cassette transporter ABCB5. Molecular Pharmaceutics. 11 (10), 3452-3462 (2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

172

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved