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要約

本稿では、サッカロマイセス・セレビシエで過剰発現したカンジダ・アルビカンスABC(ATP結合カセット)タンパク質Cdr1の特性評価のための小規模な血漿膜分離プロトコルを提示する。プロテアーゼ切開性C末端mGFPCdr1とタグの間に16残基リンカーを備えた二重タグは、Cdr1の精製および洗剤スクリーニングを容易にするように設計された。

要約

ABCトランスポーターの生化学的および生物物理学的特徴付けの成功は、異種発現系の選択に大きく依存する。過去20年間、私たちは多くの重要な真菌膜タンパク質を研究するために使用されてきた酵母膜タンパク質発現プラットフォームを開発しました。発現宿主 サッカロミセス・セレビシエ ADΔΔは、7つの主要な内因性ABC輸送体で削除され、ゲノム PDR5 遺伝子座の単一コピーとして安定的に統合された異種膜タンパク質遺伝子の構成過剰発現を可能にする機能獲得変異を有する転写因子Pdr1-3を含む。多目的なプラスミドベクターの作成とワンステップクローニング戦略の最適化により、迅速かつ正確なクローニング、突然変異誘発、および異種ABCトランスポーターの発現が可能になります。ここでは、新規プロテアーゼクレアブルmGFPHis二重タグ(すなわち、単量体酵母強化された緑色蛍光タンパク質yEGFP3を6ヒスチジンアフィニティー精製タグに融合)の開発と使用について説明し、目的のタンパク質とのタグの干渉を避け、ニッケル樹脂親和性への彼のタグの結合効率を高めるために設計された。mGFPHisを膜タンパク質ORF(オープンリーディングフレーム)に融合させることにより、ポリアクリルアミドゲルの検査や、mGFPHisタグを保持する分解物の検出により、タンパク質の定量が容易になります。この機能が膜タンパク質可溶化のための洗剤スクリーニングを促進する方法を示す。C末端にタグ付けされた カンジダ・アルビカンス 多剤流出トランスポーターCdr1の効率よく、迅速かつ信頼性の高い分離のためのプロトコルが 、S.cerevisiae ADΔで過剰発現して提示される。この小規模なプラズマ膜絶縁プロトコルは、1営業日以内に高品質の形質のプラズマ膜を生成します。血漿膜製剤は、Cdr1およびCdr1変異体変異体の酵素活性を決定するために使用することができる。

概要

その本来の脂質環境からのインテグラル膜タンパク質の抽出は、その構造と機能1、2、3、4に劇的に影響を与える可能性があります。生物学的膜5の複雑な脂質組成は、極めて重要なタンパク質と脂質相互作用が6に起こり得る。脂質は膜タンパク質の構造的完全性を維持し、膜コンパートメントの宛先7,8で正しく機能することを可能にする。したがって、膜タンパク質精製における重要な第一歩は、その構造および/または機能に影響を与えることなく、その天然環境からのタンパク質の抽出である。

膜タンパク質の構造を特徴付けるには多くの障害があり、そのほとんどが疎水性に関連しており、X線結晶学やクライオ電子顕微鏡(cryo-EM)9、10、11、12に必要な量で適切に折り畳まれた機能性膜タンパク質を発現しにくい。膜タンパク質発現系には、相同9、異種13、14、15、およびインビトロ発現系16,17の3種類があります。多くの発現系の発現レベル、または非常に低いコストは、膜タンパク質を産生するための好ましい選択肢として少数の宿主しか残さない。それらは、細菌宿主、大腸菌、酵母S.セレビシエおよびピキアパストリス、およびSf9昆虫細胞または哺乳動物細胞株18のような高等の真核生物を含む。すべての膜タンパク質発現技術には長所と短所があります。しかし、S.セレビシエは、おそらく膜タンパク質産生に適した最も研究された真核生物である。遺伝子工学、創薬、合成生物学、真核細胞膜タンパク質14、19、20、21の発現の用途で非常に汎用性が高い。

本研究では、特許取得済みのS.セレビシエ膜タンパク発現技術21を使用し、S.セレビシエADΔ14およびADΔ2を好ましい宿主として(図1A)、主要なC.アルビカンス多剤流出ポンプCdr1を過剰発現および研究した。S.セレビシエ株はいずれも、ウラ3(ADΔ)またはura3およびhis1(ADΔ)遺伝子の両方を有するAD1-8u-23の誘導体であり、URA3またはHIS1ゲノム座遺伝子で望ましくない統合を通じて生じる偽陽性ウラシルまたはヒスチジン原発性形質転換体を排除するために削除される。 図1Aに示されている7つの主要な多剤流出ポンプ23の欠失は、ADΔΔを最も異種生物に絶妙に敏感にする。機能の得る変異型転写因子Pdr1-3は、2つの相同性の変異体を介して、異種-ORF含有変換カセット(図1A)の異種-ORF含有変換カセット(図1A)を統合した後、Cdr1(図1Aの赤い八角形)のような異種膜タンパク質の構成過剰発現を引き起こす。C末端mGFPの適切な原形質膜局在化タグ付きタンパク質は共焦点顕微鏡(図1A)によって確認することができ、Hisタグはタグ付きタンパク質のニッケル親和性精製に使用することができる。いくつかの真菌性ABCトランスポーター(例えば、カンジダ・クルセイABC1)をpABC3由来プラスミドにクローニングすることは、細胞毒性のために大腸菌に伝播することができなかったため不可能であった。これにより、膜タンパク質14、24のワンステップクローニングの開発を促し、様々な親和性、エピトープ、またはレポータータグをS.cerevisiae ADΔに直接タグ付けしたN末端またはC末端のいずれかでタグ付けされた(図1C)。S.セレビシエ種々のCDR1変異体を過剰発現するADΔ株も、25bpで重複する最大5個の個別PCR断片を用いることで効率的に作成することができる(図1C)。このプロトコルを採用することで、対象となる多くのORFを、非常に短い期間内で低コストで高効率でクローン化、表現、および特徴付けることができます。変換効率は、PCRフラグメントを追加するたびに〜2倍にしか減少しません。 

必要であれば、発現レベルは、通常高い構成式レベル25の0.1%~50%の間の任意の場所まで予測可能に発現レベルを調整するために、プライマー設計によって容易に操作することもできる。最適化された多機能pABC314誘導クローニングベクター、pABC3-XLmGFPHis26(図1B)にはHRV-3Cプロテアーゼ切断部位(X;レフフ|GP)、頻繁に使用されるタバコエッチウイルス(TEV)プロテアーゼ27よりも4°Cで優れたパフォーマンスを発揮するプロテアーゼである。Lは5アミノ酸(GSGGS)リンカーであり、mGFPは、単量体変異体(A206K)28、29バージョンの酵母強化された緑色蛍光タンパク質変異体yEGFP330であり、Hisは3つのアミノ酸リンカー(GGS)であり、続いて6-ヒスチジン(HHHHHH)ニッケル親和性タンパク質精製タグである。

この発現技術は、創薬や膜タンパク質の研究に成功しています。真菌アゾール薬標的の最初の構造であるS.セレビシエErg1131は、この技術を用いて解決された。また、C.アルビカンスCdr132、33、34の詳細な特徴付けと、システイン架橋研究に適したシステイン欠損Cdr1分子35の作成を可能にし、将来の高解像度構造を検証した。主要なヒト真菌病原体からの他の多くのABC輸送者(すなわち、 C.アルビカンス、カンジダ・グラブラタ、カンジダ・オーリス、カンジダ・クルセイ、カンジダ・ユティリス、クリプトコッカス・ネオフォルマンス、アスペルギルス・フミガトゥス、ペニシリウム・マルネッフェイ、フザリウム・ソラニ族群)もこの発現プラットフォーム24、36、37、38を用いて詳細に研究されている。これにより、ハイスループットスクリーンで使用されている流出ポンプを過剰発現するS.cerevisiae株のパネルを生成し、新しい蛍光流出ポンプ基板ナイルレッド40と特定の41と広域スペクトル14、33、42、43、44の流出ポンプ阻害剤を発見することができました。 このシステムの使用はまた、その種の広域スペクトル真菌多剤流出ポンプ阻害剤42の最初としてclorgylineの発見を可能にした。

膜タンパク質の完全な可溶化と、内因性脂質を欠いた均質な膜タンパク質ミセル調製物の作成には、高い洗剤濃度45が必要である。しかし、残念ながら、これはまた、多くの場合、膜タンパク質5、8、45、46を不活性化します。溶液中の洗浄剤モノマーの特性およびそれらの凝集は、疎水性尾部の物理的性質、アルキル鎖の長さおよび分岐、芳香核またはフルオロアルキル側鎖の存在、またはポリオキシエチレン単位の数によって影響される。したがって、洗浄剤スクリーニングは、膜タンパク質の可溶化および精製に最も適した洗剤を決定するための重要な第一歩である。

C. アルビカンスは、深刻な、生命を脅かす侵襲性感染症47を引き起こす可能性がある免疫不全個体の主要なヒト真菌病原体であり、そして、それは、アゾール抗真菌薬48、49に耐性を持つことができる。C.アルビカンス多剤耐性の主なメカニズムの1つは、Cdr150の過剰発現であり、これは、原形質膜に位置するABCGサブファミリーのII型ATP結合カセット(ABC)トランスポーター51である。フルサイズの真菌性ABCGトランスポーター(2つのヌクレオチド結合ドメイン[NBD]および2つの膜貫通ドメイン[TMD]からなる)は、より一般的に多発性薬物耐性(PDR)トランスポーターとして知られており、そのユニークな逆ドメイントポロジ[NBD-TMD]2によって特徴付けられる。PDRトランスポーターは、植物52、53および真菌54にのみ見られる。その重要性にもかかわらず、PDRトランスポーターのための構造はありませんが、人間のハーフサイズのABCGトランスポーターの構造は最近解決され、Cdr133の最初の仮モデルを作成するのに役立ちました。しかし、我々の最近の実験的証拠は、真菌PDRトランスポーターが特徴的な非対称NBDを有し、おそらくユニークな輸送メカニズムをもたらすため、このモデルに欠陥があることを示唆している。したがって、Cdr1の高解像度構造は、流出媒介性を克服するのに役立つ可能性のある新規排出ポンプ阻害剤の合理的設計と、この重要なABCトランスポーターファミリーの作用機序に関する洞察を提供するために必要とされる。

本研究の目的は、Cdr1の高解像度構造を得ることを究極の目的とし、遺伝子組み換え S.セレビシエ 発現宿主におけるCdr1の発現、可溶化、精製のための信頼できるプロトコルを開発することであった。このプロセスの一環として、プロテアーゼ切開可能なmGFPHisダブルタグ(図1B)は、Cdr1のC末端からタグを分離する16残基リンカーで設計され、ニッケル親和性樹脂への6x Hisアフィニティタグの結合を改善し、生細胞および精製プロセス全体におけるCdr1発現レベルのモニタリングを可能にした。約 10%C.アルビカン Cdr1(SDS-PAGE後のクマシー染色によって推定される)を含む小規模酵母血漿膜タンパク質調製物の再現性プロトコルも開発され、Cdr1の生化学的特性解析に使用できる。

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プロトコル

1. 変換能力ADΔおよびADΔΔセルの新鮮または凍結されたストックの調製

  1. 2x YPCDの25 mLを接種する[すなわち、 2x YPD;2%(w/v)酵母エキス、2%(w/v)ペプトン、4%(w/v)デキストロース、0.079%(w/v)CSM(完全なサプリメント混合物)を含む35 培地(o/n)を1回の酵母コロニーで16時間インキュベートし、1分間に200回転で16時間(rpm)で16時間インキュベートする。
  2. 25 mL o/n培養で2x YPCD培地の225 mLを接種し、600 nm(OD600)で細胞光学密度を確認する。OD600 は通常 0.5~1.0 です。
    注: この段階で、次の変換実験に必要なすべての材料がすぐに利用できることを確認してください。
  3. 細胞密度が〜6-8のOD600に達するまで、200rpmで振盪してさらに〜6〜8時間30°C で培養を成長させます。
    注: 特に明記されていない限り、以下の手順は室温(RT)で実行されます。
  4. 3,000 x g で遠心分離してこれらの対数相細胞を 3 分間収穫します。
  5. 細胞を再懸濁し、滅菌二重蒸留水(ddH2O;すなわち、200 mLと20 mL)でそれらを2回洗います。
  6. 3,000 x g で 3 分間収穫します。
  7. ゆっくりと(すなわち、30分間に30分間凍結された有限細胞(FCC)溶液の30等分のアリコートを加える)FCC[5%(w/v)グリセロール』のXmL中の細胞ペレットを再懸濁し、 氷上の10%(v/v)ジメチルスルホキシド(DMSO))(ここで、X= OD600;例えば、OD600= 6が6mLで再懸濁した場合、またはOD600=3 が3mLで再懸濁した場合)。
    注: 正しい FCC 構成は、変換の成功に不可欠です。
  8. 細胞を2時間氷上に保ってから変換するか、必要になるまでアリコートを-80°Cに保存します。
    注: ADΔおよびADΔΔ細胞は凍結に非常に敏感です。したがって、細胞は-80°Cにゆっくりと冷却する必要があります:50-600 μL細胞アリコートを含む氷冷マイクロ遠心チューブをプラスチック貯蔵箱(RT)に入れます。箱を大きなポリスチレン容器(RT)に入れ、フィッティングポリスチレン蓋で容器を閉めます。その後、容器を-80°Cの冷凍庫に入れます。
    注意:ゆっくりとした凍結は細胞の生存にとって重要です。

2. CACDR1-XLmGFPHisによるADΔとADΔの変換と、コロニーPCRおよびDNAシーケンシングによる正しい形質転換体の確認

注: プラスミド pABC3-CDR1-mGFPHis は、Lamping ら、 201055で詳細に説明されている従来のクローニング戦略を使用して作成され、図 1Bに示されています。野生型C.アルビカンスCDR1は、プラスミドpABC3-CaCDR1A-GFP14からPABC3-CaCDR1A-GFP 14からフラグメント化し、pABC3-XLmGFPHis26にクローン化したPacI/NotIフラグメントとして単離した。

  1. PCR は、1-10 ng の pABC3-CaCDR1-XLmGFPHis を DNA テンプレートとして使用して、高忠実度 DNA ポリメラーゼとプライマー ペア PDR5 プロ/PDR5 ter35を使用してCDR1変換カセット全体を増幅します。 あるいは、pABC3-CaCDR1-XLmGFPHisの2μgを37°Cで10 U制限酵素AscIで完了させる(図1A、B)。
    注:CDR1変換カセット(図1A)はPDR5プロモーター-CaCDR1-mGFPHis-PGK1ターミネーター -URA3選択マーカー -PDR5下流領域を含む。
  2. アガロースゲル電気泳動を行い、約8kbの変換カセットをゲル抽出します。
    注:約8kbの CaCDR1 変換カセットのゲル精製は、ゲノム PDR5 遺伝子座に統合された線形変換カセットではなく、プラスミド全体を有する誤った形質転換体につながる可能性のある未消化のプラスミドDNAを除去する。
  3. 必要量のサケ精子キャリアDNA(2mg/mL;10 mM Tris,1 mM EDTA;pH 7.5)を沸騰水浴中で10分間変性し、氷の上に置きます。蓋の開封を避けるために、サケの精子DNAを沸騰させるためにねじ込みチューブを使用してください。
  4. 変性したサケの精子DNA50 μLと14 μLの変換カセット(500-2,000 ng)を混合し、さらに使用するまで64μLのDNA混合物を氷上に保持します。
    注:正の変換制御として大腸菌-酵母シャトルプラスミド(例えば、pYES2)の10 ngを使用してください(図2B)。
  5. 新鮮なまたは凍結したコンピテントセルを30°Cの水浴で5分間素早く解凍し、1.5 mLマイクロ遠心分離管で50μLアリコートに分けます。
  6. 最高速度(18,000 x g)でマイクロフュージで1分間遠心分離して細胞を収穫する。
  7. 上清を取り除き、細胞ペレットをRTに保管します。
  8. 変換ごとに、260 μL の組み合わせ 290 μL のポリエチレングリコール (PEG 3350) と 1 M 酢酸リチウム (LiAc) の 36 μL を混合し、ピペット処理を繰り返し、適切な 64 μLの氷冷DNA混合物と混合します。
  9. 適切な混合物を50μLのコンピテントセルペレットアリコートにすぐに加えます。
  10. PEG-LiAc-DNA混合物の360 μLの細胞ペレットを約30秒の十分にボルテックスで再懸濁させる。
  11. 30°Cの水浴で細胞混合物を1時間インキュベートする。
    注: ADΔおよびADΔΔ細胞は、42°C35よりも30°Cで変換が良い。
  12. 18,000 x g で細胞を収穫します。上清を捨て、80 μLのddH2Oで細胞ペレットを再懸濁します。
  13. 細胞をCSM-URA寒天板35 に広げる[すなわち、0.67%(w/v)酵母窒素塩基アミノ酸なし、0.077%(w/v)CSMマイナスウラシル、2%(w/v)グルコース、2%(w/v)寒天]。
  14. ウラシル原発性形質転換体がはっきりと見えるまで、30°Cで2〜3日間プレートをインキュベートします。
    注: 線形~8 kb の CaCDR1 変換カセットおよび μg pYES2 あたり約 4 x 104 変換 剤の μg あたり約 100 個の変換剤を期待してください。
  15. 5つの独立した形質転換体を選び、新鮮なCSM-URAプレートに広げて、ウラシル原始眼の形質転換体を非形質宿主細胞の残骸から分離する。
  16. YPG寒天プレート上の形質転換体を成長させることで、可能な小柄変異体を除去する [1%(w/v)酵母エキス, 2%(w/v) ペプトン, 2%(v/v) グリセロール, 2% (w/v) 寒天] (図 2D).
    注:小柄変異体はミトコンドリアに欠陥があり、したがって、非発酵性炭素源で成長することはできません。彼らは S.セレビシエ56で非常に一般的です。 S.セレビシエ ADΔおよびADΔΔは特に小柄表現型を獲得する傾向がある。
  17. 酵母コロニーPCRを実行し、不純なDNAテンプレート源からPCR産物を増幅するために最適化された特定のDNAポリメラーゼで、約8kbのCaCDR1変換カセット全体を増幅することにより、少なくとも3つの独立した形質転換体をゲノムPDR5遺伝子座(図1C)に正しく統合することを確認します。DNAテンプレートとして、統合部位のすぐ外側に結合するプライマーのセットと、単一コロニーから得られた細胞懸濁液(ddH2 O)の1μLアリコートを使用します。
    注:この特定のDNAポリメラーゼは、無傷の酵母細胞から約8kbのPCR断片を確実に増幅します。しかし、確実な増幅のためには45のPCRサイクルが必要であり、酵母細胞はddH2OのOD600 1-10で再懸濁されなければならない。
  18. PCR反応の1μL部分のDNAアガロースゲル電気泳動により、正確な〜8kbのPCR増幅産物を確認します。
  19. 適切なプライマーを使用して処理されたDNAサンプルの部分を使用してORF全体をシーケンシングする前に、メーカーの指示に従って一本鎖DNAエキソヌクレアーゼとホスファターゼの酵素混合物を用いてPCR反応の10 μL部分から過剰な増幅プライマーを除去します。

3. 小規模酵母プラズマ膜分離プロトコル

  1. 酵母細胞の増殖
    1. 10mLのYPDで10mLのYPDで200rpmで振盪して〜7〜8時間培養する前培養を行った。
    2. 10 mL前培養で40mLのYPD培地を接種し、細胞密度が1-3のOD600 に達するまで200rpmで振盪して30°C o/n(〜16時間)で細胞をインキュベートする。
  2. 酵母細胞の収穫
    1. 40のOD単位(ODU;例えば、1 = 1 ODUのOD600 で1 mL)の対数相細胞を4,200 x g で収穫し、5分4°Cで5分間収穫する。
    2. 氷冷無菌ddH2O(すなわち、40mLおよび1 mL)で細胞を再懸濁し、洗浄する(すなわち、40mL、その後1mL;4.200 x g で遠心分離によってステップ間の細胞を4°Cで5分間収穫する)。
    3. 氷冷滅菌ddH2Oの1mLにペレットを再懸濁し、細胞懸濁液を予冷(氷上)1.5 mLマイクロ遠心チューブに移します。
    4. 4°Cで3分間3,300xgで細胞を収穫する。
    5. 上清を吸引する。
    6. 細胞ペレットを0.5 mL均一化緩衝液中に再懸濁する [HB; 50 mM トリス, 0.5 mM EDTA, 20%(v/v) グリセロール; pH 7.5] フッ化物 1 mM フェニルメチルスルホニルを補充したばかりの (PMSF).
      注: PMSF は水に暴露されるとすぐに不活性化されるため、常に新鮮な PMSF を追加します。
      注意:PMSFはセリンプロテアーゼ阻害剤であり、非常に腐食性であり、組織に破壊的です。それは不可逆的な目の損傷を引き起こす可能性があります。
    7. 細胞懸濁液を-80°Cで保管するか、すぐに使用してください。
  3. 血漿膜の分離
    1. 凍結した場合は、氷上の細胞を約1時間解凍する。
    2. 直径0.5mmのシリカビーズを0.5mLのセルサスペンションに加え、全容量1mLに達します。
    3. 氷上に3分の冷却期間が散在し、最大揺れ強度で6サイクルのボルテックスを持つ細胞を破ります。
    4. 加熱されたメスの刃でチューブの底に薄い穴を作ります。
    5. 壊れた細胞ホモテージをチューブの底を通して、10 sの低速(〜200rpm)のスピンで別の氷冷1.5 mLマイクロ遠心管に取り付けて集めます。
      注: これにより、シリカビーズが元のチューブに残ります。
    6. 遠心分離細胞は、細胞デブリ、切れ目のない細胞、および核を除去するために、4°Cで5分間5分間、5,156 x g でホモゲネートを形成します。
    7. 450 μL の上清を氷冷1.5 mLマイクロ遠心チューブに移し、新鮮なPMSF(1 mM)を加えた氷冷HBを1 mL追加します。
      注:この希釈ステップは、高品質の血漿膜タンパク質の回復に不可欠です。
    8. 17,968 x g で4°Cで1hの血漿膜を収穫し、1mM PMSFで補充されたHBの100 μLで、繰り返しピペット処理を繰り返して、血漿膜ペレットを再懸濁します。HBと上下ピペットの100 μLを放出する前に、100 μL ピペットチップで細胞ペレットを攪拌することにより、適切な形質膜均質化のために細胞ペレットをゆるめます。
    9. 還元剤および洗剤を含むバッファーと互換性のあるタンパク質アッセイキットを用いて、血漿膜調製物のタンパク質濃度を測定します。
    10. 80°Cでプラズマ膜を保管するか、すぐに使用するために氷の上に保管してください。

4. ドデシル硫酸塩ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)

  1. ポリアクリルアミドゲルを調製するための装置を組み立てます。
  2. 2つの分離ゲル(7%ポリアクリルアミド)に対して、2.1 mLのアクリルアミド/ビスアクリルアミドを40%混合し、 4x分離バッファーの 3 mL (1.5 M トリス, 0.4% ドデシル硫酸ナトリウム [SDS] (w/v); pH 8.8), ddH2O. 6.9 mL テトラメチルエチレンアミンの 8 μL (TEMED) と 60 μL 10% アンモンアン硫酸 (APS) ポリマー化開始に開始します。
    注意:アクリルアミド/ビスアクリルアミドは非常に有毒です。それは皮膚刺激、末梢神経障害を引き起こし、発がん性物質である。TEMEDは、飲み込んだり吸入したりすると有害です。APSは飲み込むと有害です。それは深刻な目と皮膚の刺激を引き起こします。
  3. この混合物の約4〜5mLを組み立てたゲル装置に注ぎ、上から〜2cmまで注ぎます。
  4. 慎重に0.1%SDSの1〜2 mLを上に重ね、平面半月板を作成します。
  5. ポリアクリルアミドをRTで〜60分間設定します。
  6. 40%アクリルアミド/ビスアクリルアミドの0.5 mLを混合することにより、2つのゲルのための積層ゲル混合物を調製し、 4xスタッキングバッファーの1 mL(0.5 Mトリス、0.4%SDS(w/v)、pH 6.8)、およびdDH2O. 6.9 mL に2 μLの TEMED と 30 μL の 10% APS を加えてアクリルアミドの重合を開始します。
  7. 重合分離ゲルから0.1%のSDS層を取り出し、DDH2OでリンスしてSDSの痕跡を取り除きます。
  8. 積み重ねゲルミックスを分離ゲルに注ぎます。
  9. 積み重ねゲルに櫛を入れ、櫛の周りから気泡を取り除きます。
  10. 積み重ねゲルをRTで約60分間セットします。
  11. くしを取り出し、水でゲルスロットをすすきます。ゲルタンクにゲルを入れ、ゲルタンクを1xランニングバッファ(24.8 mMトリス、190 mMグリシン、0.1%SDS)で上部に充填します。
    注: RT に格納されている 10x バッファ ストック (248 mM トリス、1.9 M グリシン、1% SDS (w/v) から 1x のバッファを準備します。
  12. 5-10 μLの形質膜サンプル(すなわち、10-20 μgタンパク質)を2xタンパク質負荷染料の等量[120 mM Tris-HCl(pH 6.8)、20%グリセロール、0.02%ブロモフェノールブルー、4%SDS、200 mMジチオトライトール(DT)を混合し、すぐに液状に流れ込む)
    注意:DTTは飲み込むと有害です。それは深刻な目と皮膚の刺激を引き起こします。
    注:2倍のタンパク質ローディング染料、アリコート、-20°Cで保管して10mLのストックを作ってください。 混合サンプルを加熱せず、GFPタグが変性しないように、すぐに個々のゲルスロットにロードし、ゲル内蛍光シグナルを検出することができます。
  13. タンパク質の分子量マーカー(10-245 kDa範囲)を別のスロットにロードして、個々のタンパク質フラグメントのサイズ推定を可能にします。
  14. 青い負荷染料がゲルの底部(通常45〜55分)に達するまで、200Vでゲル電気泳動を行います。
  15. ゲルイメージングシステムを用いてインゲルGFP-蛍光のゲルを調べます(励起波長と発光波長はそれぞれ475-485 nm、520 nm)。
  16. インゲル蛍光イメージングに続き、RTで15分間、ゲルのゲルを穏やかに攪拌して約10〜20mLプロテインゲル固定液(40%エタノール、10%酢酸)でタンパク質を固定します。
  17. 10 mLのddH2Oで10分間2回ゲルをリンスし、RTで10mLコロイドクマシー染色液にゲルを入れ、RTで〜1時間穏やかに揺れ動かしてタンパク質バンドを可視化します。
  18. タンパク質バンドの可視化を改善するために、ゲルイメージングシステムで画像を記録する前に、ddH 2 Oの〜20 mL〜20mL〜1時間でゲルを1回または2回脱染色する。

5. Cdr1 ATPase活動の決定57

  1. 希薄な原形質膜サンプル>HBで1〜2mg/mLに2.2mg/mL。
  2. ATPaseアッセイカクテル(75 mM MES-Tris、 75 mM 硝酸カリウム、0.3 mMモリブデン酸アンモニウム、7.5 mMナトリウムアジド、pH 7.5)およびMg-ATP(28.8 mM ATP二ナトリウム塩、28.8 mMMgCl 2;pH 7.0)から30°Cの30°C
    注意:アジドナトリウムは非常に有毒です。
    注:すべてのバッファストックとボトルがリン酸フリーであることを確認してください。すなわち、1%(vol/vol)HClでガラス製品を洗浄し、ddH2Oで数回洗い流します。また、ガラス製品の洗浄に使用される洗剤に一般的に存在するリン酸塩の痕跡を含む可能性が高い他のガラス製品とは別に保管してください。
  3. Cdr1-ATPase阻害剤(オリゴマイシンの20 μM)の有無にかかわらず、90 μLのアッセイカクテルを96ウェルマイクロチタープレートの個々のウェルに加えます。
    注:アッセイは三重で行われます。
  4. マイクロチタープレートの適切なウェルに、5 μLの単離された原形質膜(〜5〜10 μgタンパク質)またはリン酸標準(0-100 nmoles Pi)を加えます。
    注: リン酸塩標準の 2 つの別々のセットの最初と最後の列を保持します。
  5. マルチチャンネルピペットを用いた25μLのプリウォーム28.8 mM Mg-ATP(最終濃度)を個々のウェルに加え、30°Cで30分間インキュベートします。
  6. 130 μLの現像試薬(1.6%L-アスコルビン酸ナトリウム、1%SDS、6 M硫酸中のモリブデン酸12%)を添加して反応を停止します。
    注意:濃縮硫酸は水と激しく反応します。それは腐食性であり、皮膚および肺の損傷を引き起こす可能性があります。
  7. RTで10分間インキュベートします。
  8. マイクロティタープレートリーダーで750 nmのマイクロティタープレートウェルの吸光度をお読みください。
    注:青色染料の発達は時間とともに続くため、青色の色素の開発(すなわち、還元された蛍光モリブデン複合体)の10分のインキュベーション時間に固執することは、アッセイの精度にとって重要です。
  9. オリゴマイシンの不在時の総ATPase活性からオリゴマイシン存在下でのATPase活性を差し引くことによってCdr1特異的ATPase活性(すなわち、オリゴマイシン感受性ATPase活性)を得る。

6. 小型洗剤スクリーン

  1. 血漿膜製剤を組み合わせる(すなわち、 Cdr1-mGFPHisをGTED-20バッファーで過剰発現する細胞の2.5mgの血漿膜タンパク質)[10 mMトリス、0.5 mM EDTA、20%(w/v)グリセロール;pH 7.5;試験用洗剤5mgを含む1mM PMSFで補充し、合計0.5mL(w%)に達する
  2. 4~8°Cで回転装置で2時間回転させます。
  3. 4°Cで141,000xgで混合物を遠心分離する。
  4. 可溶化した材料を含む上清を新鮮なマイクロ遠心チューブに移します。
  5. 不溶性ペレット分画に2%(w/v)SDSを添加したGTED-20バッファーの0.5 mLを加え、30°Co/nで振るインキュベーターでインキュベートし、すべての界面活性剤不溶性膜タンパク質を抽出します。
  6. SDS-PAGEによる上清および可溶化されたペレットの分率を分析し、比較します。
  7. イメージングシステムでの発現レベルの定量化およびクーマシー染色前のインゲルGFP蛍光用GFPタグ付きタンパク質を含むゲルを撮影します。
  8. 蛍光サイズ排除クロマトグラフィー(FSEC)58などの下流用途に可溶性膜タンパク質画分を使用して、適切な洗剤を同定する。

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結果

PYES2(図2B)でS.セレヴィシエADΔΔ(〜4 x104形質転換体/μg)の高周波変換が達成された。予想通り、無DNA(すなわち、ddH2 Oのみ)制御は形質転換体を与えず、かつ1μgの線形CDR1-mGFPHis変換カセット(図1A)は、最適化されたADΔΔ変換プロトコルで〜50個の変換剤(図2C)を与えた。CDR1-mGFPHis形質...

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ディスカッション

膜タンパク質の構造解析の最近の進歩にもかかわらず、Cdr1または他のPDRトランスポーターの3D構造は現在利用できません。したがって、Cdr1構造とその生化学的特徴に関する知識を得ることは重要であり、流出媒介性を克服するための新薬の合理的な設計に関する洞察を提供するだけでなく、ABCタンパク質の重要なサブファミリーの機能のメカニズムにも洞察を提供する。

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開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

著者らは、ニュージーランド・マースデン基金(グラントUOO1305)からの資金援助と、タイのバンコクにあるチュラロンコン大学医学部からのブロック補助金(M.Niimi)を感謝しています。彼らは、G.マダニに博士課程の奨学金を提供してくれたオタゴ大学に感謝したいと考えています。著者らはまた、ステファン・ラウンサー教授と同僚のアミール・アペルバウム博士とデイヴァナヤガバラシー・ヴィナヤガム博士が、ドイツのマックス・プランク分子生理学研究所(MPIMP)で6ヶ月間のG.マダニ訪問の支援と監督に感謝したいと考えている。著者らはまた、MpIMPを訪問するための研究助成金(57381332)をG.マダニに提供してくれたドイツ学術交流サービス(DAAD)に感謝しています。

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資料

NameCompanyCatalog NumberComments
2-(N-Morpholino)ethane-sulphonic acid (MES)Sigma-AldrichM3671
2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol (Tris base; ultra-pure)Merck77-86-1
2,2-Didecylpropane-1,3-bis-β-D-maltopyranosideAnatraceNG310SLMNG
2,2-Dihexylpropane-1,3-bis-β-D-glucopyranosideAnatraceNG311SOGNG (MNG-OG)
2,2-Dioctylpropane-1,3-bis-β-D-maltopyranosideAnatraceNG322SDMNG
4-Trans-(4-trans-propylcyclohexyl)-cyclohexyl α-D-maltopyranosideGlycon Biochemicals GmbHD99019-CPCC-α-M
40% Acrylamide/Bis-acrylamide (37.5:1)Bio-Rad1610148
Acetic acid (glacial)Merck64-19-7
AgarFormedium 009002-18-0
Ammonium molybdateSigma-Aldrich13106-76-8
Ammonium persulphate (APS)Bio-Rad1610700
ATP disodium saltsigma-AldrichA-6419
Bromophenol blueSERVA Electrophoresis GmbH34725-61-6
CHAPSAnatraceC316S
CHAPSOAnatraceC317S
CSMFormediumDCS0019
CSM minus uracilFormediumDCS0161
Cyclohexyl-1-butyl-β-D-maltopyranosideAnatraceC324SCYMAL-4
Cyclohexyl-1-heptyl-β-D-maltopyranosideAnatraceC327SCYMAL-7
Cyclohexyl-methyl-β-D-maltopyranosideAnatraceC321SCYMAL-1
DigitoninSigma-Aldrich11024-24-1
Dithiothreitol (DTT)Roche Diagnostics10197785103
DMSOMerck67-68-5
EthanolMerck459836
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA; Titriplex III)Merck6381-92-6
ExoSAP-IT PCR Product Cleanup ReagentApplied Biosystems78205A blend of exonuclease and phosphatase
GlucoseFormedium50-99-7
GlycerolMerck56-81-5
GlycineMerckG8898
HEPESFormedium7365-45-9
Hydrochloric acidMerck1003172510
KOD Fx NeoTOYOBO CoKFX-201Use for reliable colony PCR
lithium acetate (LiAc)Sigma-Aldrich546-89-4
Magnesium chloride hexa-hydratesigma-AldrichM2393
MESFormedium145224-94-8
n-Decanoyl-N-hydroxyethyl-glucamideAnatraceH110SHEGA-10
n-Decanoyl-N-methyl-glucamideAnatraceM320SMEGA-10
n-Decyl-phosphocholineAnatraceF304SFos-choline-10
n-Decyl-β-D-maltopyranosideAnatraceD322SDM
n-Dodecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulphonateAnatraceAZ312SAnzergent 3-12
n-Dodecyl-N,N-dimethylamine-N-oxideAnatraceD360SLDAO
n-Dodecyl-α-D-maltopyranosideAnatraceD310HAα-DDM
n-Dodecyl-β-D-maltopyranosideAnatraceD310Sβ-DDM
n-Nonyl-β-D-glucopyranosideAnatraceN324SNG
n-Nonyl-β-D-maltopyranosideAnatraceN330SNM
n-Octadecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulphonateAnatraceAZ318SAnzergent 3-18
n-Octyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulphonateAnatraceAZ308SAnzergent 3-8
n-Octyl-phosphocholineAnatraceF300SFos-choline-8
n-Octyl-β-D-glucopyranosideAnatraceO311SOG
n-Tetradecyl-phosphocholineAnatraceF312SFos-choline-14
n-Tetradecyl-β-D-maltopyranosideAnatraceT315STDM
n-Tridecyl-phosphocholineAnatraceF310SFos-choline-13
n-Tridecyl-β-D-maltopyranosideAnatraceT323S-
n-Undecyl-β-D-maltopyranosideAnatraceU300SUM (UDM)
N,N,N’,N’-tetramethyl-ethylenediamine (TEMED)Sigma-AldrichT9281
OctylphenoxypolyethoxyethanolSigma-Aldrich9002-93-1TRITON X-100
OligomycinSigma-Aldrich75351
PeptoneFormedium3049-73-7
phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)Roche Diagnostics329-98-6
Phusion Hot Start Flex DNA PolymeraseNew England BiolabsM0535SHigh-fidelity DNA polymerase
polyethylene glycol (PEG 3350)Sigma-Aldrich25322-68-3
polyoxyethylenesorbitan monooleateSigma-Aldrich9005-65-6TWEEN 80
Potassium nitrateSigma-AldrichP8394
Protein Assay KitBio-Rad5000122RC DC Protein Assay Kit II
QC Colloidal Coomassie StainBio-Rad1610803
Prism Ultra Protein Ladder (10-245 kDa)AbcamAB116028
Sodium azideSigma-Aldrich71289
Sodium dodecyl sulphateSigma-Aldrich151-21-3SDS
Sodium L-ascorbate BioXtraSigma-Aldrich11140
Sucrose MonododecanoateAnatraceS350SDDS
Sulphuric acidSigma-Aldrich339741
Yeast extractFormedium008013-01-2
Yeast nitrogen base without amino acidsFormediumCYN0402
 Equipment (type)
Centrifuge  (Eppendorf 5804)Eppendorf
Centrifuge (Beckman Ultra)Beckman
Centrifuge (Sorvall RC6)Sorvall
FSEC apparatus (NGC Chromatography Medium Pressure system equipped with a fluorescence detector, an autosampler, a fractionator)Bio-Rad
Gel imaging (GelDoc EZ Imager)Bio-Rad
Microplate reader (Synergy 2 Multi-Detection)BioTek Instruments
PCR thermal cycler (C1000 Touch)Bio-Rad
Power supply (PowerPac)Bio-Rad
SDS PAGE (Mini-PROTEAN Tetra)Bio-Rad
Shaking incubator (Multitron)Infors HT, Bottmingen
Superose 6 Increase 10/300 GLGE Healthcare Life SciencesGE17-5172-01
UV/Visible spectrophotometer (Ultraspec 6300 pro)Amersham BioSciences UK Ltd

参考文献

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