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  • Riepilogo
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  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Questo articolo presenta un protocollo di isolamento della membrana plasmatica su piccola scala per la caratterizzazione della proteina Cdr1 della Candida albicans ABC (ATP-binding cassette), sovraespressa in Saccharomyces cerevisiae. Un doppio tag mGFPHis C-terminale scisso con un linker a 16 residui tra Cdr1 e il tag è stato progettato per facilitare la purificazione e lo screening detergente di Cdr1.

Abstract

Il successo della caratterizzazione biochimica e biofisica dei trasportatori ABC dipende fortemente dalla scelta del sistema di espressione eterologa. Negli ultimi due decenni, abbiamo sviluppato una piattaforma di espressione proteica della membrana del lievito che è stata utilizzata per studiare molte importanti proteine di membrana fungina. L'espressione ospite Saccharomyces cerevisiae ADΔΔ viene cancellata in sette principali trasportatori ABC endogeni e contiene il fattore di trascrizione Pdr1-3 con una mutazione gain-of-function che consente la sovraespressione costitutiva di geni proteici di membrana eterologhi stabilmente integrati come copie singole nel locus genomico PDR5. La creazione di vettori plasmidici versatili e l'ottimizzazione di strategie di clonazione in un'unica fase consente la clonazione, la mutagenesi e l'espressione rapide e accurate dei trasportatori ABC eterologhi. Qui, descriviamo lo sviluppo e l'uso di un nuovo tag mGFPHis a cleavable per la proteasi (cioè, la proteina fluorescente verde potenziata dal lievito monomerico yEGFP3 fusa a un tag di purificazione dell'affinità a sei istidine) che è stato progettato per evitare possibili interferenze del tag con la proteina di interesse e per aumentare l'efficienza di legame del tag His alle resine di affinità al nichel. La fusione di mGFPHis alla proteina di membrana ORF (open reading frame) consente una facile quantificazione della proteina mediante l'ispezione dei gel di poliacrilammide e il rilevamento dei prodotti di degradazione che conservano il tag mGFPHis. Dimostriamo come questa caratteristica faciliti lo screening dei detergenti per la solubilizzazione delle proteine di membrana. Viene presentato un protocollo per l'isolamento efficiente, veloce e affidabile dei preparati di membrana plasmatica su piccola scala del trasportatore multiplo di efflusso Cdr1 marcato C-terminalmente etichettato come Candida albicans Cdr1 sovraespresso in S. cerevisiae ADΔΔ. Questo protocollo di isolamento della membrana plasmatica su piccola scala genera membrane plasmatiche di alta qualità in un solo giorno lavorativo. I preparati di membrana plasmatica possono essere utilizzati per determinare le attività enzimatiche delle varianti mutanti Cdr1 e Cdr1.

Introduzione

L'estrazione di proteine di membrana integrali dal loro ambiente lipidico nativo può influenzare notevolmente la loro struttura e funzione1,2,3,4. La complessa composizione lipidica delle membrane biologiche5 assicura che possano verificarsi interazioni proteina-lipidi di importanza critica6. I lipidi mantengono l'integrità strutturale delle proteine di membrana, consentendo loro di funzionare correttamente nelle loro destinazioni del compartimento di membrana7,8. Pertanto, un primo passo fondamentale nella purificazione delle proteine di membrana è l'estrazione della proteina dal suo ambiente nativo senza influenzarne la struttura e / o la funzione.

Ci sono molti ostacoli alla caratterizzazione della struttura delle proteine di membrana, la maggior parte delle quali sono legate alla loro natura idrofoba, e alle difficoltà di esprimere proteine di membrana correttamente piegate e funzionali nelle quantità richieste per la cristallografia a raggi X o la crio-microscopia elettronica (crio-EM)9,10,11,12. Esistono tre tipi di sistemi di espressione proteica di membrana:omologhi 9,eterologhi13,14,15e sistemi di espressione in vitro 16,17. I livelli di espressione spesso bassi, o i costi proibitivi, di molti sistemi di espressione lasciano solo pochi ospiti come opzione preferita per produrre proteine di membrana. Includono l'ospite batterico, Escherichia coli, i lieviti S. cerevisiae e Pichia pastorise eucarioti superiori come le cellule di insetti Sf9 o le linee cellulari di mammiferi18. Tutte le tecnologie di espressione proteica di membrana presentano vantaggi e svantaggi; tuttavia, S. cerevisiae è forse l'organismo modello eucariotico meglio studiato adatto alla produzione di proteine di membrana. È altamente versatile con applicazioni in ingegneria genetica, scoperta di farmaci, biologia sintetica ed espressione delle proteine di membrana eucariotiche14,19,20,21.

In questo studio, è stata utilizzata una tecnologia brevettata di espressione proteica di membrana S. cerevisiae 21, con S. cerevisiae ADΔ14 e ADΔΔ22 come ospiti preferiti (Figura 1A), per sovraesprimere e studiare la principale pompa di efflusso multifarmaco Cdr1 di C. albicans. Entrambi i ceppi di S. cerevisiae sono derivati di AD1-8u- 23 che hanno i geni ura3 (ADΔ) o entrambi i geni ura3 e his1 (ADΔΔ) cancellati per eliminare eventuali falsi positivi uracile o prototrofio istidina trasformanti derivanti dall'integrazione indesiderata nei loci genomici URA3 o HIS1. La delezione delle 7 principali pompe di efflusso multifarmaco23, indicate nella Figura 1A, rende ADΔΔ squisitamente sensibile alla maggior parte degli xenobiotici. Il fattore di trascrizione mutante gain-of-function Pdr1-3 provoca la sovraespressione costitutiva di proteine di membrana eterologhe come Cdr1 (ottagoni rossi in Figura 1A)dopo l'integrazione della cassetta di trasformazione eterologa-contenente ORF (Figura 1A) nel locus genomico PDR5 (rettangolo blu in Figura 1A) tramite due eventi di ricombinazione omologhi. La corretta localizzazione della membrana plasmatica delle proteine marcate con mGFPHis C-terminale può essere confermata mediante microscopia confocale (Figura 1A) e il tag His può essere utilizzato per la purificazione dell'affinità al nichel della proteina marcata. La clonazione di alcuni trasportatori abc fungini (ad esempio, Candida krusei ABC1) in plasmidi derivati da pABC3 non era, tuttavia, possibile perché non potevano essere propagati in Escherichia coli a causa della tossicità cellulare. Ciò ha spinto lo sviluppo della clonazione in un'unica fase delle proteine di membrana14,24 etichettate al loro N- o C-terminus con vari tag di affinità, epitopo o reporter direttamente in S. cerevisiae ADΔΔ (Figura 1C). S. cerevisiae I ceppi ADΔΔ che sovraesprimono vari mutanti CDR1 possono anche essere creati in modo efficiente in questo modo utilizzando fino a cinque singoli frammenti di PCR che si sovrappongono di 25 bp (Figura 1C). Utilizzando questo protocollo, molti ORF di interesse possono essere clonati, espressi e caratterizzati a basso costo e ad alta efficienza in un arco di tempo molto breve. L'efficienza di trasformazione riduce solo di circa 2 volte ogni frammento pcr aggiuntivo.

Se lo si desidera, i livelli di espressione possono anche essere facilmente manipolati dal design del primer per ottimizzare prevedibilmente i livelli di espressione fino a un punto compreso tra lo 0,1% e il 50% dei livelli di espressione costitutiva solitamente elevati25. Il vettore di clonazione derivato pABC314 ottimizzato e multifunzionale, pABC3-XLmGFPHis26 (Figura 1B) contiene un sito di scissione della proteasi HRV-3C (X; LEVLFQ| GP), una proteasi che si comporta meglio a 4 °C rispetto alla proteasi del virus dell'incisione del tabacco (TEV) frequentemente utilizzata27. L è un linker a cinque aminoacidi (GSGGS), mGFP è un mutante monomerico (A206K)28,29 versione della variante proteica a fluorescenza verde potenziata dal lievito yEGFP330e His è un linker di tre aminoacidi (GGS) seguito dal tag di purificazione della proteina a sei istidine (HHHHHH).

Questa tecnologia di espressione è stata utilizzata con successo nella scoperta di farmaci e nello studio delle proteine di membrana. La prima struttura per un bersaglio farmacologico azolico fungino, S. cerevisiae Erg1131, è stata risolta utilizzando questa tecnologia. Ha inoltre permesso la caratterizzazione dettagliata di C. albicans Cdr132,33,34 e la creazione di una molecola Cdr135 carente di cisteina adatta per studi di reticolazione della cisteina per verificare qualsiasi futura struttura ad alta risoluzione. Molti altri trasportatori ABC dai principali patogeni fungini umani (ad es. C. albicans, Candida glabrata, Candida auris, Candida krusei, Candida utilis, Cryptococcus neoformans, Aspergillus fumigatus, Penicillium marneffei e il complesso di specie Fusarium solani) sono stati studiati in dettaglio utilizzando questa piattaforma di espressione24,36,37,38,39. Ciò ha permesso la generazione di un pannello di filtri S. cerevisiae che sovraesprimono pompe di efflusso che è stato utilizzato in schermi ad alto rendimento per scoprire il nuovo substrato della pompa di efflusso fluorescente rosso Nilo40 e specifico41 e ad ampio spettro14,33,42,43,44 inibitori della pompa di efflusso. L'uso di questo sistema ha anche permesso la scoperta della clorgilina come il primo inibitore della pompa di efflusso multifarmaco fungino ad ampio spettro ad ampio spettro42.

La completa solubilizzazione delle proteine di membrana e la creazione di una preparazione omogenea di membrana proteina-micelle priva di lipidi endogeni, richiede elevate concentrazioni di detergente45. Ma sfortunatamente, questo spesso inattiva anche la proteina di membrana5,8,45,46. Le proprietà dei monomeri detergenti e la loro aggregazione in soluzione sono influenzate dalle proprietà fisiche della coda idrofoba, dalla lunghezza e dalla ramificazione della catena alchilica, dalla presenza di un nucleo aromatico o di una catena laterale fluoroalchilica o dal numero di unità di poliossietilene. Pertanto, lo screening del detergente è un primo passo importante per determinare il detergente più adatto per la solubilizzazione e la purificazione delle proteine di membrana.

C. albicans è un importante patogeno fungino umano di individui immunocompromessi che può causare infezioni invasive gravi e potenzialmente letali47e può diventare resistente ai farmaci antifungini azolici48,49. Uno dei principali meccanismi di resistenza multifarmaco di C. albicans è la sovraespressione di Cdr150, che è un trasportatore di cassette (ABC) di tipo II APdella sottofamiglia ABCG situato nella membrana plasmatica. I trasportatori ABCG fungini a grandezza naturale (costituiti da due domini di legame nucleotidico [NBD] e due domini transmembrana [TMD]) sono più comunemente noti come trasportatori di resistenza ai farmaci pleiotropici (PDR) e sono caratterizzati dalla loro unica topologia di dominio invertito [NBD-TMD]2. I trasportatori PDR si trovano solo nelle piante52,53 e nei funghi54. Nonostante la loro importanza, non ci sono strutture per i trasportatori PDR, anche se le strutture per i trasportatori ABCG a mezza dimensione umana sono state recentemente risolte che hanno contribuito a creare il primo modello provvisorio per Cdr133. Le nostre recenti prove sperimentali suggeriscono, tuttavia, che questo modello è difettoso probabilmente perché i trasportatori PDR fungini hanno caratteristiche NBD asimmetriche che risultano molto probabilmente in un meccanismo di trasporto unico. Una struttura ad alta risoluzione di Cdr1 è, quindi, necessaria sia per la progettazione razionale di nuovi inibitori della pompa di efflusso che possono aiutare a superare la resistenza ai farmaci mediata dall'efflusso, sia per fornire informazioni sul meccanismo d'azione di questa importante famiglia di trasportatori ABC.

L'obiettivo di questo studio è stato quello di sviluppare protocolli affidabili per l'espressione, la solubilizzazione e la purificazione di Cdr1 nell'ospite di espressione geneticamente modificato di S. cerevisiae, con l'obiettivo finale di ottenere una struttura ad alta risoluzione per Cdr1. Come parte di questo processo, è stato progettato un doppio tag mGFPHis scisso dalla proteasi (Figura 1B) con un linker a 16 residui che separa il tag dal C-terminus di Cdr1, che ha migliorato il legame del tag 6x His affinity allegato alla resina di affinità al nichel e ha permesso il monitoraggio dei livelli di espressione di Cdr1 nelle cellule viventi e durante l'intero processo di purificazione. È stato inoltre sviluppato un protocollo riproducibile per preparati proteici a membrana plasmatica di lievito su piccola scala contenenti circa il 10% di C. albicans Cdr1 (come stimato dalla colorazione di Coomassie dopo SDS-PAGE), che potrebbe essere utilizzato per la caratterizzazione biochimica di Cdr1.

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Protocollo

1. Preparazione di scorte fresche o congelate di celle ADΔ e ADΔΔ competenti per la trasformazione

  1. Inoculare 25 mL di 2x YPCD [cioè 2x YPD; 2% (p/v) estratto di lievito, 2% (p/v) peptone, 4% (p/v) destrosio), 0,079% (p/v) CSM (miscela completa di integratori)]35 medium con una singola colonia di lievito e incubare durante la notte (o/n) per 16 ore a 30 °C con agitazione a 200 giri al minuto (rpm).
  2. Inoculare 225 mL di 2x mezzo YPCD con la coltura o/n da 25 mL e controllare la densità ottica cellulare a 600 nm (OD600); l'OD600 è di solito ~ 0,5-1,0.
    NOTA: in questa fase assicurarsi che tutti i materiali necessari per il seguente esperimento di trasformazione siano prontamente disponibili.
  3. Far crescere la coltura a 30 °C per ulteriori ~6-8 h con agitazione a 200 rpm fino a quando la densità cellulare raggiunge un OD600 di ~6-8.
    NOTA: i seguenti passaggi vengono eseguiti a temperatura ambiente (RT) se non diversamente specificato.
  4. Raccogli queste cellule in fase logaritmica per centrifugazione a 3.000 x g per 3 min.
  5. Risuscilare le cellule e lavarle due volte con acqua sterile a doppio distillato (ddH2O; cioè 200 ml e poi 20 ml).
  6. Raccogli le cellule a 3.000 x g per 3 min.
  7. Lentamente (cioè, aggiungere 30 aliquote uguali di soluzione di cellule competenti congelate (FCC) ogni minuto per 30 minuti) risusciscere il pellet cellulare in X mL di FCC [5% (p / v) glicerolo, 10% (v / v) dimetilsolfossido (DMSO)] su ghiaccio (dove X = OD600; ad esempio, se OD600 = 6 ricasuscid in 6 mL, o se OD600 = 3 sosuscindi in 3 mL).
    NOTA: la corretta composizione FCC è fondamentale per il successo della trasformazione.
  8. Tenere le celle sul ghiaccio per 2 ore prima della trasformazione o conservare le aliquote a -80 °C fino a quando non è necessario.
    NOTA: le celle ADΔ e ADΔΔ sono molto sensibili al congelamento. Pertanto, le celle devono essere raffreddate lentamente fino a -80 °C: posizionare tubi microcentrifuga ghiacciati contenenti aliquote cellulari da 50-600 μL in una scatola di stoccaggio di plastica (RT). Posizionare la scatola in un contenitore di polistirene più grande (RT) e chiudere il contenitore con un coperchio di polistirolo adatto. Quindi, mettere il contenitore nel congelatore a -80 °C.
    ATTENZIONE: Il congelamento lento è fondamentale per la sopravvivenza cellulare.

2. Trasformazione di ADΔ e ADΔΔ con CaCDR1-XLmGFPHis e conferma dei corretti trasformanti mediante PCR di colonia e sequenziamento del DNA

NOTA: Plasmid pABC3-CDR1-mGFPHis è stato creato utilizzando strategie di clonazione convenzionali descritte in dettaglio in Lamping et al., 201055 ed è illustrato nella Figura 1B. Wild-type C. albicans CDR1 è stato isolato come frammento pacI/NotI dal plasmide pABC3-CaCDR1A-GFP14 e clonato in pABC3-XLmGFPHis26.

  1. La PCR amplifica l'intera cassetta di trasformazione CDR1 con una dna polimerasi ad alta fedeltà e una coppia di primer PDR5-pro/PDR5-ter35 utilizzando 1-10 ng di pABC3-CaCDR1-XLmGFPHis come modello di DNA o, in alternativa, digerire 2 μg di pABC3-CaCDR1-XLmGFPHis fino al completamento con 10 U enzima di restrizione AscI a 37 °C (Figura 1A,B).
    NOTA: La cassetta di trasformazione CDR1 (Figura 1A) comprende il promotore PDR5 - CaCDR1-mGFPHis - terminatore PGK1 - marcatore di selezione URA3 - regione a valle PDR5.
  2. Eseguire l'elettroforesi su gel di agarose ed estrarre il gel dalla cassetta di trasformazione ~8 kb.
    NOTA: La purificazione su gel della cassetta di trasformazione CaCDR1 da ~8 kb rimuove ogni possibile DNA plasmidico non digerito, il che potrebbe portare a trasformanti errati che hanno l'intero plasmide, piuttosto che la cassetta di trasformazione lineare, integrata nel locus genomico PDR5.
  3. Denaturare la quantità richiesta di DNA portatore di spermatozoi di salmone (2 mg/mL; 10 mM Tris, 1 mM EDTA; pH 7,5) per 10 minuti a bagnomaria bollente e conservare sul ghiaccio. Utilizzare tubi con tappo a vite per far bollire il DNA dello sperma di salmone per evitare l'apertura del coperchio.
  4. Mescolare 50 μL di DNA di spermatozoi di salmone denaturato con 14 μL della cassetta di trasformazione (500-2.000 ng) e mantenere i 64 μL di miscela di DNA sul ghiaccio fino a nuovo utilizzo.
    NOTA: Utilizzare 10 ng di un plasmide E. coli-yeast shuttle (ad esempio, pYES2) come controllo di trasformazione positiva (Figura 2B).
  5. Riassumare le cellule competenti fresche o congelate rapidamente scongelate per 5 minuti a bagnomaria a 30 °C e dividerle in aliquote da 50 μL in tubi microcentrifuga da 1,5 mL.
  6. Raccogliere le cellule mediante centrifugazione per 1 minuto in un microfugio alla massima velocità (18.000 x g).
  7. Rimuovere il surnatante e mantenere il pellet cellulare a RT.
  8. Per ogni trasformazione, mescolare 296 μL di combinazioni (RT) di 260 μL di 50% (p/v) polietilenglicole (PEG 3350) e 36 μL di 1 M di acetato di litio (LiAc), mediante pipettaggio ripetuto, con gli opportuni 64 μL di miscele di DNA ghiacciato-freddo.
  9. Aggiungere immediatamente la miscela appropriata a un'aliquota di pellet di cella competente da 50 μL.
  10. Sospendare il pellet cellulare nei 360 μL della miscela PEG-LiAc-DNA mediante vortice completo per circa 30 s.
  11. Incubare la miscela cellulare a bagnomaria a 30 °C per 1 ora.
    NOTA: le celle ADΔ e ADΔΔ si trasformano meglio a 30 °C che a 42 °C35.
  12. Raccogli le cellule a 18.000 x g per 10 s. Scartare il surnatante e risusenziare il pellet cellulare in 80 μL di ddH2O.
  13. Distribuire le cellule su una piastra di agar CSM-URA35 [cioè, 0,67% (p / v) base di azoto di lievito senza amminoacidi, 0,077% (p / v) CSM meno uracile, 2% (p / v) glucosio e 2% (p / v) agar].
  14. Incubare le piastre per 2-3 giorni a 30 °C fino a quando i trasformanti prototrofi uracili sono chiaramente visibili.
    NOTA: Aspettatevi ~100 trasformanti per μg della cassetta di trasformazione caCDR1 lineare ~8 kb e ~4 x 104 trasformanti per μg pYES2.
  15. Scegli cinque trasformanti indipendenti e distribuiscili su una piastra CSM-URA fresca per separare i trasformanti prototrofi dell'uracile dai resti di cellule ospiti non trasformate.
  16. Rimuovere eventuali piccoli mutanti coltivando i trasformanti su piastre di agar YPG [1% (p / v) estratto di lievito, 2% (p / v) peptone, 2% (v / v) glicerolo e 2% (p / v) agar] (Figura 2D).
    NOTA: i piccoli mutanti hanno mitocondri difettosi e, quindi, non possono crescere su fonti di carbonio non fermentabili. Sono abbastanza comuni in S. cerevisiae56. S. cerevisiae ADΔ e ADΔΔ sono particolarmente inclini ad acquisire il fenotipo petite.
  17. Eseguire la PCR della colonia di lieviti e confermare che almeno tre trasformatori indipendenti siano correttamente integrati nel locus genomico PDR5 (Figura 1C) amplificando l'intera cassetta di trasformazione CaCDR1 da ~ 8 kb con una DNA polimerasi specifica ottimizzata per amplificare i prodotti PCR da fonti di modello di DNA impuro. Utilizzare una serie di primer che si legano appena fuori dal sito di integrazione e aliquote da 1 μL di sospensioni cellulari (in ddH2O) derivate da singole colonie come modelli di DNA.
    NOTA: Questa particolare DNA polimerasi amplifica in modo affidabile frammenti di PCR ~ 8 kb da cellule di lievito intatte. Tuttavia, per un'amplificazione affidabile, sono necessari 45 cicli di PCR e le cellule di lievito devono essere risospese a OD600 1-10 in ddH2O.
  18. Confermare il corretto prodotto di amplificazione PCR ~8 kb mediante elettroforesi su gel di acarosio DNA di una porzione di 1 μL della reazione PCR.
  19. Rimuovere i primer di amplificazione in eccesso da una porzione di 10 μL della reazione PCR con una miscela enzimatica di un'esonucleasi del DNA a singolo filamento e una fosfatasi seguendo le istruzioni del produttore prima di sequenziare l'intero ORF utilizzando porzioni del campione di DNA trattato con primer appropriati.

3. Protocollo di isolamento della membrana plasmatica del lievito su piccola scala

  1. Cellule di lievito in crescita
    1. Pre-coltura una singola colonia di lievito in 10 ml di YPD a 30 °C per ~ 7-8 ore con agitazione a 200 giri / min.
    2. Inoculare 40 mL di terreno YPD con i 10 mL di pre-coltura e incubare le cellule a 30 °C o/n (~16 h) con agitazione a 200 rpm fino a quando la densità cellulare raggiunge un OD600 di 1-3.
  2. Raccolta delle cellule di lievito
    1. Raccogliere 40 unità OD (ODU; ad esempio, 1 mL a un OD600 di 1 = 1 ODU) di cellule in fase logaritmica a 4.200 x g per 5 min a 4 °C.
    2. Risospendare e lavare le cellule due volte con ddHsterile ghiacciato 2O (cioè 40 mL e poi 1 mL; raccogliere le cellule tra i passaggi mediante centrifugazione a 4.200 x g per 5 minuti a 4 °C).
    3. Risuscimere il pellet in 1 mL di ddH2O sterile ghiacciato e trasferire la sospensione cellulare in un tubo microcentrifuga da 1,5 mL pre-raffreddato (su ghiaccio).
    4. Raccogliere celle a 3.300 x g per 3 minuti a 4 °C.
    5. Aspirare il surnatante.
    6. Spese di stoccaggio del pellet cellulare in tampone omogeneizzante da 0,5 mL [HB; 50 mM Tris, 0,5 mM EDTA, 20% (v/v) glicerolo; pH 7,5] appena integrato con 1 mM fenilmetilsulfonil fluoruro (PMSF).
      NOTA: Aggiungere sempre PMSF fresco perché PMSF viene inattivato rapidamente dopo l'esposizione all'acqua.
      ATTENZIONE: PMSF è un inibitore della serina proteasi, che è estremamente corrosivo e distruttivo per i tessuti. Può causare danni irreversibili agli occhi.
    7. Conservare la sospensione cellulare a -80 °C o utilizzare immediatamente.
  3. Isolamento delle membrane plasmatiche
    1. Se congelato, scongelare le cellule sul ghiaccio per ~ 1 ora.
    2. Aggiungere perle di silice ghiacciate da 0,5 mm di diametro alla sospensione cellulare da 0,5 mL per raggiungere un volume totale di 1 mL.
    3. Rompere le celle con 6 cicli di vortice alla massima intensità di scuotimento per 1 min intervallati da periodi di raffreddamento di 3 min sul ghiaccio.
    4. Fai un foro sottile nella parte inferiore del tubo con una lama di bisturi riscaldata.
    5. Raccogliere l'omogeneità cellulare rotta attraverso il fondo del tubo montato in un altro tubo microcentrifuga da 1,5 mL ghiacciato con una rotazione a bassa velocità di 10 s (~ 200 giri / min).
      NOTA: questo assicura che le pere di silice rimangano nel tubo originale.
    6. Centrifugare l'omogeneo cellulare a 5.156 x g per 5 minuti a 4 °C per rimuovere detriti cellulari, cellule ininterrotte e nuclei.
    7. Trasferire 450 μL di surnatante in un tubo microcentrifuga ghiacciato da 1,5 mL e aggiungere un ulteriore 1 mL di HB ghiacciato integrato con PMSF fresco (1 mM).
      NOTA: questa fase di diluizione è fondamentale per il recupero delle proteine di membrana plasmatiche di alta qualità.
    8. Raccogliere le membrane plasmatiche a 17.968 x g per 1 ora a 4 °C e risospenare il pellet di membrana plasmatica, mediante pipettaggio ripetuto, in 100 μL di HB appena integrato con 1 mM PMSF. Allentare il pellet cellulare per una corretta omogeneizzazione della membrana plasmatica mescolando il pellet cellulare con la punta della pipetta da 100 μL prima di rilasciare i 100 μL di HB e il pipettaggio su e giù.
    9. Misurare la concentrazione proteica della preparazione della membrana plasmatica con un kit di analisi delle proteine compatibile con tamponi contenenti agente riducente e detergente.
    10. Conservare le membrane plasmatiche a -80 °C o tenerle sul ghiaccio per un uso immediato.

4. Elettroforesi su gel di poliacrilammide dodecilsolfato di sodio (SDS-PAGE)

  1. Assemblare l'apparecchio per la preparazione di gel di poliacrilammide.
  2. Per due gel di separazione (7% poliacrilammide), mescolare 2,1 mL di acrilammide/bis-acrilammide al 40%, 3 mL di tampone separatore 4x (1,5 M Tris, 0,4% sodio dodecilsolfato [SDS] (p/v); pH 8,8) e 6,9 mL di ddH2O. Aggiungere 8 μL di tetrametiletilendiammina (TEMED) e 60 μL di 10% di persolfato di ammonio (APS) per avviare la polimerizzazione dell'acrilammide.
    ATTENZIONE: L'acrilammide/bis-acrilammide è molto tossica. Provoca irritazione cutanea, neuropatia periferica ed è cancerogeno. TEMED è dannoso se ingerito o inalato. L'APS è dannoso se ingerito. Provoca gravi irritazioni agli occhi e alla pelle.
  3. Versare ~ 4-5 ml di questa miscela nell'apparato gel assemblato, fino a ~ 2 cm dall'alto.
  4. Sovrapporre con attenzione ~ 1-2 ml di SDS allo 0,1% sulla parte superiore per creare un menisco planare.
  5. Lasciare che la poliacrilammide si imposti per ~ 60 minuti a RT.
  6. Preparare una miscela di gel impilante per due gel mescolando 0,5 mL di acrilammide/bis-acrilammide al 40%, 1 mL di tampone impilante 4x (0,5 M Tris, 0,4% SDS (p/v); pH 6,8) e 6,9 mL di ddH2O. Aggiungere 2 μL di TEMED e 30 μL di 10% APS per avviare la polimerizzazione dell'acrilammide.
  7. Rimuovere lo strato SDS allo 0,1% dal gel separatore polimerizzato e risciacquare con ddH2O per rimuovere tracce di SDS.
  8. Versare la miscela di gel impilante sul gel separatore.
  9. Metti un pettine nel gel impilante e rimuovi eventuali bolle d'aria intorno al pettine.
  10. Lasciare che il gel impilante si imposti per ~ 60 minuti a RT.
  11. Rimuovere il pettine e risciacquare le fessure del gel con acqua. Mettere il gel nel serbatoio del gel e riempire il serbatoio del gel verso l'alto con 1x tampone di corsa (24,8 mM Tris, 190 mM glicina, 0,1% SDS).
    NOTA: Preparare 1x buffer in esecuzione da una scorta tampone 10x (248 mM Tris, 1,9 M glicina, 1% SDS (p/v) in ddH2O) conservata presso RT.
  12. Mescolare campioni di membrana plasmatica da 5-10 μL (cioè 10-20 μg di proteine) con volumi uguali di 2x colorante a carico proteico [120 mM Tris-HCl (pH 6,8), 20% glicerolo, 0,02% blu bromofenolo, 4% SDS, 200 mM ditiotreitolo (DTT)] e caricare immediatamente in singoli slot di gel immersi nel buffer di corsa.
    ATTENZIONE: la DTT è dannosa se ingerita. Provoca gravi irritazioni agli occhi e alla pelle.
    NOTA: Fare una scorta di 10 mL di 2x colorante a carico proteico, aliquota e conservare a -20 °C. Non riscaldare i campioni misti, ma caricarli immediatamente in singoli slot di gel in modo che il tag GFP non sia denaturato e i segnali di fluorescenza in-gel possano essere rilevati.
  13. Caricare i marcatori di peso molecolare delle proteine (intervallo 10-245 kDa) in uno slot separato per consentire la stima delle dimensioni dei singoli frammenti proteici.
  14. Eseguire l'elettroforesi su gel a 200 V fino a quando il colorante di carico blu raggiunge il fondo del gel (di solito 45-55 min).
  15. Esaminare il gel per la fluorescenza GFP in-gel con un sistema di imaging su gel (le lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione sono rispettivamente 475-485 nm e 520 nm).
  16. Dopo l'imaging a fluorescenza in-gel, fissare le proteine mediante una delicata agitazione del gel in ~ 10-20 mL protein gel fixing solution (40% etanolo, 10% acido acetico) per 15 minuti a RT.
  17. Risciacquare il gel due volte per 10 minuti con 10 mL di ddH2O e visualizzare le bande proteiche posizionando il gel in 10 mL di soluzione colloidale di Coomassie con un delicato scuotimento per ~ 1 ora a RT.
  18. Per una migliore visualizzazione delle bande proteiche, demacchiare il gel una o due volte in ~ 20 ml di ddH2O per ~ 1 ora prima di registrare le immagini con il sistema di imaging del gel.

5. Determinazione delle attività di Cdr1 ATPasi 57

  1. I campioni di membrana plasmatica diluita >2,2 mg/mL a 1-2 mg/mL in HB.
  2. Equilibrare il cocktail di dosaggio ATPasi (75 mM MES-Tris, 75 mM di nitrato di potassio, 0,3 mM di molibdato di ammonio, 7,5 mM di sodio azide; pH 7,5) e Mg-ATP (28,8 mM di sale disodico ATP, 28,8 mM MgCl2;pH 7,0) a 30 °C in un incubatore a 30 °C.
    ATTENZIONE: L'azide di sodio è altamente tossico.
    NOTA: assicurarsi che tutte le scorte tampone e le bottiglie siano prive di fosfati; cioè, lavare la vetreria con 1% (vol/ vol) HCl e risciacquarla più volte con ddH2O. Inoltre, tenerlo separato da altri oggetti in vetro che probabilmente contengono tracce di fosfato comunemente presenti nei detergenti usati per lavare i bicchieri.
  3. Aggiungere 90 μL di cocktail di analisi con o senza inibitore della Cdr1-ATPasi (20 μM di oligomicina) in singoli pozzetti di una piastra di microtitolato a 96 pozzetti.
    NOTA: Il test viene eseguito in triplice copia.
  4. Aggiungere 5 μL delle membrane plasmatiche isolate (~5-10 μg di proteine) o degli standard fosfatici (0-100 nmoles Pi) nei appositi pozzi della piastra di microtitolazione.
    NOTA: mantenere la prima e l'ultima colonna per due serie separate di standard sui fosfati.
  5. Iniziare il test aggiungendo 25 μL di Mg-ATP preriscaldato da 28,8 mM (concentrazione finale di 6 mM) con una pipetta multicanale in singoli pozzeggi e incubare a 30 °C per 30 minuti.
  6. Interrompere la reazione aggiungendo 130 μL di reagente di sviluppo (1,6% sodio L-ascorbato, 1% SDS, 12% molibdato di ammonio in acido solforico 6 M).
    ATTENZIONE: L'acido solforico concentrato reagisce violentemente con l'acqua. È corrosivo e può causare danni alla pelle e ai polmoni.
  7. Incubare a RT per 10 min.
  8. Leggere l'assorbanza dei pozzetti a piastre di microtitoli a 750 nm con un lettore di piastre di microtitoli.
    NOTA: Attenersi al tempo di incubazione di 10 minuti per lo sviluppo del colorante blu (cioè un complesso fosforo-molibdeno ridotto) è fondamentale per l'accuratezza del test perché lo sviluppo del colorante blu continua con il tempo.
  9. Ottenere l'attività ATPasi specifica di Cdr1 (cioè l'attività dell'ATPasi oligomicina-sensibile) sottraendo l'attività dell'ATPasi in presenza di oligomicina dall'attività totale dell'ATPasi in assenza di oligomicina.

6. Schermo detergente su piccola scala

  1. Combinare i preparati di membrana plasmatica (cioè 2,5 mg di proteina della membrana plasmatica) di cellule che sovraesprimono Cdr1-mGFPHis con tampone GTED-20 [10 mM Tris, 0,5 mM EDTA, 20 % (p/v) glicerolo; pH 7,5; appena integrato con 1 mM PMSF] contenente 5 mg del detergente in esame, per raggiungere un volume totale di 0,5 mL integrato con detergente all'1% (p/v).
  2. Ruotare la miscela a 4-8 °C per 2 ore, con un dispositivo di rotazione.
  3. Centrifugare la miscela a 141.000 x g a 4 °C per 1 ora.
  4. Trasferire il surnatante contenente materiale solubilizzato in un tubo microcentrifuga fresco.
  5. Aggiungere 0,5 mL di tampone GTED-20 integrato con SDS al 2% (p/v) alla frazione di pellet insolubile e incubare a 30 °C o/n in un incubatore vibrante per estrarre tutte le proteine di membrana insolubili detergenti.
  6. Analizzare e confrontare le frazioni di pellet surnatante e solubilizzato di SDS-PAGE.
  7. Fotografare gel contenenti proteine marcate con GFP per la fluorescenza GFP in-gel prima della colorazione Coomassie e quantificare i livelli di espressione con il sistema di imaging.
  8. Utilizzare la frazione proteica di membrana solubile per applicazioni a valle come la cromatografia di esclusione delle dimensioni di fluorescenza (FSEC)58 per identificare i detergenti adatti.

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Risultati

Un'alta frequenza di trasformazione di S. cerevisiae ADΔΔ (~4 x 104 trasformanti/μg) è stata ottenuta con pYES2 (Figura 2B). Come previsto, il controllo senza DNA(cioèsolo ddH 2 O) non ha dato trasformatori, e 1 μg della cassetta di trasformazione lineare CDR1-mGFPHis (Figura 1A) ha dato ~ 50 trasformanti (Figura 2C) con il protocollo di trasformazione ADΔΔ ottimizzato. I tras...

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Discussione

Nonostante i recenti progressi nell'analisi strutturale delle proteine di membrana, non è attualmente disponibile alcuna struttura 3D per Cdr1 o qualsiasi altro trasportatore PDR. Quindi, acquisire conoscenza della struttura Cdr1 e delle sue caratteristiche biochimiche è importante, in quanto ciò non solo fornirà informazioni sulla progettazione razionale di nuovi farmaci per superare la resistenza ai farmaci mediata dall'efflusso, ma anche sul meccanismo di funzione di un'importante sottofamiglia di proteine ABC.

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Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Riconoscimenti

Gli autori riconoscono con gratitudine il finanziamento del New Zealand Marsden Fund (Grant UOO1305) e una sovvenzione di blocco dalla Facoltà di Medicina, Chulalongkorn University, Bangkok, Thailandia (M. Niimi). Desiderano ringraziare l'Università di Otago per aver fornito a G. Madani una borsa di studio di dottorato. Gli autori desiderano anche esprimere la loro gratitudine al professor Stefan Raunser e ai suoi colleghi, il dottor Amir Apelbaum e il dottor Deivanayagabarathy Vinayagam, per il loro supporto e supervisione durante una visita di 6 mesi di G. Madani presso il Max Planck Institute of Molecular Physiology (MPIMP), Dortmund, Germania. Gli autori ringraziano anche il German Academic Exchange Service (DAAD) per aver fornito a G. Madani una borsa di ricerca (57381332) per visitare l'MPIMP.

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Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
2-(N-Morpholino)ethane-sulphonic acid (MES)Sigma-AldrichM3671
2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol (Tris base; ultra-pure)Merck77-86-1
2,2-Didecylpropane-1,3-bis-β-D-maltopyranosideAnatraceNG310SLMNG
2,2-Dihexylpropane-1,3-bis-β-D-glucopyranosideAnatraceNG311SOGNG (MNG-OG)
2,2-Dioctylpropane-1,3-bis-β-D-maltopyranosideAnatraceNG322SDMNG
4-Trans-(4-trans-propylcyclohexyl)-cyclohexyl α-D-maltopyranosideGlycon Biochemicals GmbHD99019-CPCC-α-M
40% Acrylamide/Bis-acrylamide (37.5:1)Bio-Rad1610148
Acetic acid (glacial)Merck64-19-7
AgarFormedium 009002-18-0
Ammonium molybdateSigma-Aldrich13106-76-8
Ammonium persulphate (APS)Bio-Rad1610700
ATP disodium saltsigma-AldrichA-6419
Bromophenol blueSERVA Electrophoresis GmbH34725-61-6
CHAPSAnatraceC316S
CHAPSOAnatraceC317S
CSMFormediumDCS0019
CSM minus uracilFormediumDCS0161
Cyclohexyl-1-butyl-β-D-maltopyranosideAnatraceC324SCYMAL-4
Cyclohexyl-1-heptyl-β-D-maltopyranosideAnatraceC327SCYMAL-7
Cyclohexyl-methyl-β-D-maltopyranosideAnatraceC321SCYMAL-1
DigitoninSigma-Aldrich11024-24-1
Dithiothreitol (DTT)Roche Diagnostics10197785103
DMSOMerck67-68-5
EthanolMerck459836
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA; Titriplex III)Merck6381-92-6
ExoSAP-IT PCR Product Cleanup ReagentApplied Biosystems78205A blend of exonuclease and phosphatase
GlucoseFormedium50-99-7
GlycerolMerck56-81-5
GlycineMerckG8898
HEPESFormedium7365-45-9
Hydrochloric acidMerck1003172510
KOD Fx NeoTOYOBO CoKFX-201Use for reliable colony PCR
lithium acetate (LiAc)Sigma-Aldrich546-89-4
Magnesium chloride hexa-hydratesigma-AldrichM2393
MESFormedium145224-94-8
n-Decanoyl-N-hydroxyethyl-glucamideAnatraceH110SHEGA-10
n-Decanoyl-N-methyl-glucamideAnatraceM320SMEGA-10
n-Decyl-phosphocholineAnatraceF304SFos-choline-10
n-Decyl-β-D-maltopyranosideAnatraceD322SDM
n-Dodecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulphonateAnatraceAZ312SAnzergent 3-12
n-Dodecyl-N,N-dimethylamine-N-oxideAnatraceD360SLDAO
n-Dodecyl-α-D-maltopyranosideAnatraceD310HAα-DDM
n-Dodecyl-β-D-maltopyranosideAnatraceD310Sβ-DDM
n-Nonyl-β-D-glucopyranosideAnatraceN324SNG
n-Nonyl-β-D-maltopyranosideAnatraceN330SNM
n-Octadecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulphonateAnatraceAZ318SAnzergent 3-18
n-Octyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulphonateAnatraceAZ308SAnzergent 3-8
n-Octyl-phosphocholineAnatraceF300SFos-choline-8
n-Octyl-β-D-glucopyranosideAnatraceO311SOG
n-Tetradecyl-phosphocholineAnatraceF312SFos-choline-14
n-Tetradecyl-β-D-maltopyranosideAnatraceT315STDM
n-Tridecyl-phosphocholineAnatraceF310SFos-choline-13
n-Tridecyl-β-D-maltopyranosideAnatraceT323S-
n-Undecyl-β-D-maltopyranosideAnatraceU300SUM (UDM)
N,N,N’,N’-tetramethyl-ethylenediamine (TEMED)Sigma-AldrichT9281
OctylphenoxypolyethoxyethanolSigma-Aldrich9002-93-1TRITON X-100
OligomycinSigma-Aldrich75351
PeptoneFormedium3049-73-7
phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)Roche Diagnostics329-98-6
Phusion Hot Start Flex DNA PolymeraseNew England BiolabsM0535SHigh-fidelity DNA polymerase
polyethylene glycol (PEG 3350)Sigma-Aldrich25322-68-3
polyoxyethylenesorbitan monooleateSigma-Aldrich9005-65-6TWEEN 80
Potassium nitrateSigma-AldrichP8394
Protein Assay KitBio-Rad5000122RC DC Protein Assay Kit II
QC Colloidal Coomassie StainBio-Rad1610803
Prism Ultra Protein Ladder (10-245 kDa)AbcamAB116028
Sodium azideSigma-Aldrich71289
Sodium dodecyl sulphateSigma-Aldrich151-21-3SDS
Sodium L-ascorbate BioXtraSigma-Aldrich11140
Sucrose MonododecanoateAnatraceS350SDDS
Sulphuric acidSigma-Aldrich339741
Yeast extractFormedium008013-01-2
Yeast nitrogen base without amino acidsFormediumCYN0402
 Equipment (type)
Centrifuge  (Eppendorf 5804)Eppendorf
Centrifuge (Beckman Ultra)Beckman
Centrifuge (Sorvall RC6)Sorvall
FSEC apparatus (NGC Chromatography Medium Pressure system equipped with a fluorescence detector, an autosampler, a fractionator)Bio-Rad
Gel imaging (GelDoc EZ Imager)Bio-Rad
Microplate reader (Synergy 2 Multi-Detection)BioTek Instruments
PCR thermal cycler (C1000 Touch)Bio-Rad
Power supply (PowerPac)Bio-Rad
SDS PAGE (Mini-PROTEAN Tetra)Bio-Rad
Shaking incubator (Multitron)Infors HT, Bottmingen
Superose 6 Increase 10/300 GLGE Healthcare Life SciencesGE17-5172-01
UV/Visible spectrophotometer (Ultraspec 6300 pro)Amersham BioSciences UK Ltd

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