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  • 披露声明
  • 致谢
  • 材料
  • 参考文献
  • 转载和许可

摘要

本协议描述了一种从使用低剂量异黄酮与低剂量脱氧多米丁结合的大鼠获得稳定静息状态功能磁共振成像 （rs-fMRI） 数据的方法。

摘要

静态功能磁共振成像 （rs-fMRI） 已成为一种越来越流行的方法，以研究处于休息状态、非任务状态的大脑功能。此协议描述了获取 rs-fMRI 数据的临床前生存方法。将低剂量异黄酮与连续输注α 2 肾上腺素受体激动剂脱氧核糖核酸相结合，为稳定、高质量的数据采集提供了强有力的选择，同时保留了大脑网络功能。此外，这个程序允许自发呼吸和接近正常的生理在大鼠。使用此方法，其他成像序列可与静态采集相结合，创建麻醉稳定性高达 5 h 的实验协议。本协议描述了设备的设置、麻醉四个不同阶段对大鼠生理学的监测、获得休息状态扫描、数据质量评估、动物恢复以及处理后数据分析的简短讨论。此协议可用于多种临床前啮齿动物模型，以帮助揭示在休息时发生的大脑网络变化。

引言

静止状态功能磁共振成像 （rs-fMRI） 是衡量大脑处于静止状态且不从事任何特定任务时血氧水平依赖 （BOLD） 信号的指标。这些信号可用于测量大脑区域之间的相关性，以确定神经网络中的功能连接。rs-fMRI 广泛应用于临床研究，因为它具有非侵入性，并且患者所需的努力量较低（与基于任务的 fMRI 相比），因此最适合不同的患者群体1。

技术进步使rs-fMRI能够适应啮齿动物模型，以揭示疾病状态背后的机制（参见参考2 供审查）。临床前动物模型，包括疾病或淘汰模型，允许广泛的实验操作不适用于人类，研究还可以利用验尸样本，以进一步加强实验2。然而，由于限制运动和减轻压力的困难，啮齿动物的MRI采集传统上是在麻醉下进行的。麻醉剂，取决于他们的药理动力学，药理动力学和分子靶点，影响脑血流，大脑新陈代谢，并可能影响神经血管耦合通路。

有许多努力，以开发麻醉方案，以保持神经血管耦合和大脑网络功能3，4，5，6，7，8。我们之前报告了麻醉系统，应用低剂量异黄酮以及低剂量的α 2肾上腺素受体激动剂脱氧丙酮9。根据这种麻醉方法，大鼠在与既定投影通路（腹腔和腹腔胸腔核、原发和二级胸膜感官皮层）相一致的区域对胡须刺激表现出强大的BOLD反应:大规模静态脑网络，包括默认模式网络10、11和显着网络12也一直被检测到。此外，这种麻醉方案允许在同一种动物上重复成像，这对纵向监测疾病进展和实验操作的效果非常重要。

在本研究中，我们详细介绍了实验设置、动物准备和生理监测程序。我们特别描述了每个阶段的特定麻醉阶段和扫描采集。每次休息状态扫描后都会评估数据质量。讨论中还包括扫描后分析的简要摘要。有兴趣发现在老鼠身上使用rs-fMRI潜力的实验室会发现这个协议很有用。

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研究方案

所有实验均使用 9.4 T MRI 扫描仪进行，并得到了达特茅斯学院机构动物护理和使用委员会的批准。获得额外批准，以记录和显示视频中使用的动物和下面的数字。

1. 扫描前的准备工作

  1. 皮下输液管
    1. 部分从包装中取出 23 G 针头，使针点保持无菌。
    2. 牢固地握住针头的轮毂，并使用剃须刀刀片在针轴与针头接合的地方得分。
    3. 将针架夹在得分正下方的轴周围，轻轻地将轴从轴中折断。
    4. 将 1/3 的针轴（模糊端）插入先前消毒的 PE50 线中，线长足以从药物泵延伸到磁孔内的动物。
  2. 脱氧多米丁和阿提帕梅索莱的稀释
    1. 使用 0.5 mL 的 0.5 毫克/毫升库存与 9.5 毫升无菌盐水混合，在透明无菌玻璃瓶中（稀释浓度 = 0.025 毫克/毫升）准备稀释的盐酸去氨基甲酰胺溶液。
    2. 使用 0.1 mL 的 5 毫克/毫升库存，在透明无菌玻璃瓶中混合 9.9 毫升无菌盐水（稀释浓度 = 0.05 毫克/毫升），准备稀释的阿提帕梅佐尔溶液。
  3. 扫描参数
    1. 使用 表 1 中提供的参数准备扫描序列。

2. 第一阶段麻醉:动物诱导和准备

  1. 设置
    1. 确保所有设备正常运转，包括氧气和空气搅拌机、加热垫和活动清理系统（见图1）。
    2. 将加热系统的温度设定点设置为 37.5 °C。
  2. 动物诱导
    1. 将动物（90天大，雄性斯普拉格道利大鼠）放在诱导室，在30%的富氧空气中诱导麻醉，2.5%的异黄素。
      注:可以使用多种动物年龄和性别。
    2. 一旦动物麻醉，从室内取出，称量动物，并把它放在准备空间的加热垫上（2.5%异黄素）。
  3. 动物准备
    1. 将眼部润滑软膏涂在每只眼睛上，以防止干燥。
    2. 确认麻醉的深度，缺乏脚趾捏反应。
    3. 使用剪子在动物背部下腰部区域（即尾巴正上方）剃掉 2" 乘 2" 平方区域。
    4. 使用腹腔内注射（即p.p.）注射（例如，300克大鼠将获得0.18 mL）进入腹部右下象限，使用25G针将德克美多米丁溶液的0.015毫克/千克管理。
    5. 开关异黄素从准备空间流向动物摇篮。
    6. 把动物移到动物的摇篮里。将老鼠的门牙牢牢地放在咬栏上。将鼻锥压在鼻子上，以确保紧贴。
      注意:如果鼻锥不覆盖下颚，请使用石蜡薄膜轻轻地将下颚紧闭，同时密封在鼻锥周围。
    7. 将呼吸垫放在肋骨笼下方的鼠腹部下方，并重新定位，直到呼吸波形显示以每次呼吸为中心的深槽（见 图2中的呼吸波形）。
    8. 使用生理监测软件监测动物的呼吸。呼吸小于40次/分钟（bpm;注射脱氧多米素后约5分钟）时，进入麻醉的下一阶段。

3. 第二阶段麻醉:动物设置

  1. 将耳塞插入耳道，使鼠头稳定在动物摇篮中。一旦定位，向前拉在咬杆上，并确认头部不动。根据需要重新调整鼻锥和石蜡薄膜（见图3a）。
  2. 将温度探头插入预润滑的一次性探头盖中。轻轻地将温度探针插入直肠，然后用医用胶带将其胶带贴在尾部底部。
  3. 将脉冲氧计夹放在后脚的骨质区域，确保光源位于脚底（手掌）。
    注:剪辑的旋转会影响信号:因此，创建一个支架，以保持爪子和夹直立将导致更大的稳定性。还要注意，直到大鼠处于正常体温，氧气饱和度可能很低（<95%）。
  4. 使用大鼠的重量计算输液率，以排出0.015毫克/千克/小时的去克肌氨酸（300克大鼠接收0.18 mL/h）。
  5. 设置药物泵以弹出计算的输液率。
  6. 将 3 mL 注射器填充无菌、稀释的去皮切除素溶液，并将针尖插入消毒输液管的开端（从药物泵延伸到动物摇篮，之前附有皮下针）。填充线并固定药物泵的注射器支架中的注射器。
  7. 将推手块向前移动，直到它接触柱塞，药物在针头被排出，确保输液管完全充满。
  8. 使用酒精擦拭，清洁剃须区，去除任何杂乱的头发。
  9. 将皮肤捏在尾巴底部上方大约两个手指宽度。将1/3的输液线针插入帐篷皮肤。
  10. 用一块3"宽的医用胶带将针头固定在皮肤上。将第二块宽的医疗胶带放在第一块，穿过老鼠，并附着在动物摇篮的两侧（见图4）。
    注:铁磁针必须密封好，以防止扫描过程中的运动。
  11. 开始输液皮下去克西霉素。
  12. 将一块纱布放在老鼠鼻桥上，为线圈创建一个水平表面。使用不干扰 MRI 信号的纸胶带将线圈固定在鼠头上，将其集中在大脑上（见图 3b，c）。
  13. 用实验室胶带固定动物摇篮内的所有线和电缆，并检查所有生理信号是否稳定（见图2）。
  14. 将纸巾放在动物身上，用实验室胶带将它们固定在动物摇篮上。如果使用空气加热系统，将塑料布包裹在整个摇篮周围以容纳暖空气。
  15. 将动物移入孔中并调谐磁铁。

4. 第三阶段麻醉:解剖扫描采集

  1. 将异黄素降低到 1.5%，导致呼吸量稳步增长到大约 45-50 bpm。在解剖扫描期间保持在此级别。
  2. 使用 FLASH 定位扫描，确保大脑与磁体等中心对齐（图 5a）。重新定位动物，并在必要时重复。
  3. 运行更高分辨率的 RARE 定位扫描，并使用此扫描输出对齐以大脑为中心的 15 个下垂切片（从左到右，图 5b）。
  4. 使用中间下垂切片，将中心轴向切片对齐到前部切口的凹口，该切片显示为暗点（图 5c）。请注意切片偏移，以便稍后在休息状态扫描中使用。
  5. 使用 FLASH 和 RARE 轴向协议获取 23 片，以帮助在扫描后分析期间注册到公共空间。
  6. 使用按压序列在整个大脑中闪闪发光。

5. 第 4 阶段:休息状态扫描采集

  1. 完成解剖扫描后，将异黄素降至0.5%至0.75%，调整使动物的呼吸为每分钟60-65次呼吸。在此级别上至少停留 10 分钟，然后开始静态扫描以确保稳定性。
  2. 当生理稳定（呼吸范围为 60-75 bpm 且无喘气或异常时，核心体温为 37.5 ± 1.0 °C，氧饱和度为 95% 或更高），则使用与解剖轴向系列相同的切片偏移获得 15 片 EPI 扫描。
  3. 每次休息状态扫描完成后，使用独立的组件分析 （ICA） 检查质量，将数据分解为空间和时间组件。
  4. 获得至少三次高质量的休息状态扫描。

6. 扫描后恢复

  1. 扫描完成后，将异黄素增加到2%，并停止皮下去皮除虫素输注。
  2. 从磁孔中取出动物摇篮，拆开动物的外皮，取出耳塞、温度探头、脉冲氧计夹和去氧霉素针。
  3. 使用 1 mL 注射器和 25 G 针（即 300 克大鼠将接收 0.09 mL）将稀释的阿提帕梅索尔溶液注入大鼠的后腿肌肉中 0.015 毫克/千克。
  4. 将鼠子放回加热垫顶部的家庭笼子中，并监视，直到动物流动。

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结果

每次休息状态扫描后，使用独立的组件分析（ICA; 补充文件中包含的示例脚本）评估稳定性。 图 6 显示了休息状态扫描的组件输出示例。 图 6a 显示了高稳定性扫描中的信号组件。请注意，从空间上讲，该组件具有很高的区域性。在空间组件下方的时间过程中，信号是稳定的，不可预测的，表明大脑活动的真实性。底部的功率频谱显示的频...

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讨论

动物的稳定性，无论是身体还是生理，都是获得高质量的休息状态数据的关键。本协议通过通过四个不同的麻醉阶段实现稳定性。在进入麻醉的下一阶段之前，动物必须达到设定的生理阈值:由于这种方法依赖于生理自调节机制，个别动物在每个麻醉阶段可能需要的时间略有不同。我们的经验是，在每个阶段花更多的时间比匆忙通过早期阶段，而不给老鼠的生理学足够的时间来解决更有效。允许稳...

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披露声明

作者没有什么可透露的。

致谢

这项工作得到了国家卫生研究所国家药物滥用研究所（NIDA）的资金支持。 EDKS 和 EMB 得到了授予艾伦 I. 格林和 DJW 的格兰特 R21DA044501 的支持，格兰特 T32DA037202 授予艾伦 J. Budney] 和国家酒精滥用和酒精中毒研究所 （NIAAA） [授予艾米丽 D. K. 沙利文 F31AA028413] 。作为达特茅斯精神病学教授雷蒙德·索贝尔教授，艾伦·格林的基金提供了额外的支持。

陆汉兵得到了国家药物滥用研究所耳内研究项目国家卫生研究院的支持。

作者要感谢和感谢已故的艾伦·格林。他对共同发生的疾病领域的坚定不移的奉献有助于建立作者之间的协作。我们感谢他的指导和指导，这将非常怀念他。

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材料

NameCompanyCatalog NumberComments
9.4T MRIVarian/BrukerVarian upgraded with Bruker console running Paravision 6.0.1 software
Air-Oxygen MixerSechristModel 3500CP-G
Analysis of Functional NeuroImages (AFNI)NIMH/NIHVersion AFNI_18.3.03Freely available at: https://afni.nimh.nih.gov/
Animal CradleRAPID BiomedicalLHRXGS-00563rat holder with bite bar, nose cone and ear bars
Animal Physiology Monitoring & Gating SystemSAIIModel 1025MR-compatible system including oxygen saturation, temperature, respiration and fiber optic pulse oximetry add-on
Antisedan (atipamezole hydrochloride)Patterson Veterinary07-867-7097Zoetis, Manufacturer Item #10000449
Ceramic MRI-Safe ScissorsMRIequip.comMT-6003
ClippersPatterson Veterinary07-882-1032Wahl touch-up trimmer combo kit, Manufacturer Item #09990-1201
Dexmedesed (dexmedetomidine hydrochloride)Patterson Veterinary07-893-1801Dechra Veterinary Products, Manufacturer Item#17033-005-10
Digital Rectal Thermometer CoversMedlineMDS9608
FMRIB Software LibraryFMRIBMELODIC Version 3.15Freely available at: https://fsl.fmrib.ox.ac.uk/fsl/fslwiki
Heating PadCara Inc.Model 50
Hemostat forceps, straightKent ScientificINS750451-2
IsofluranePatterson Veterinary07-893-1389Patterson Private Label, Manufacturer Item #14043-0704-06
Isoflurane VaporizerVetEquip Inc.911103
Lab Tape, 3/4"VWR International89097-990
Needles, 23 gaugeBD305145plastic hub removed
Parafilm Laboratory FilmPatterson Veterinary07-893-0260Medline Industries Inc., Manufacturer Item #HSFHS234526A
Planar Surface CoilBrukerT126092cm
Polyethylene TubingBraintree ScientificPE50 50FT0.023" (inner diameter), 0.038" (outer diameter)
Puralube Ophthalmic OintmentPatterson Veterinary07-888-2572Dechra Veterinary Products, Manufacturer Item #211-38
Sprague Dawley RatsCharles River400 SAS SD
Sterile 0.9% Saline SolutionPatterson Veterinary07-892-4348Aspen Vet, Manufacturer Item #14208186
Sterile Alcohol Prep PadsMedlineMDS090735
Surgical Tape, 1" (3M Durapore)MedlineMMM15381Z3M Healthcare, "wide medical tape"
Surgical White Paper Tape, 1/2" (3M Micropore)MedlineMMM153003M Healthcare
Syringes, 1 mL w/ 25 gauge needleBD309626
Syringes, 3 mLBD309657
Vented induction and scavenging systemVetEquip Inc.9421022 liter induction chamber with active scavenging
411724omega flowmeter
931600scavenging cube, "vacuum"
921616nose cone, non-rebreathing

参考文献

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