JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Данный протокол описывает способ получения данных функциональной магнитно-резонансной томографии (rs-fMRI) в состоянии покоя от крысы с использованием низкой дозы изофлурана в сочетании с низкой дозой дексмедетомидина.

Аннотация

Функциональная магнитно-резонансная томография в состоянии покоя (rs-fMRI) становится все более популярным методом изучения функции мозга в состоянии покоя, без задачи. Этот протокол описывает доклинический метод выживания для получения данных rs-fMRI. Сочетание низких доз изофлурана с непрерывной инфузией агониста адренергических рецепторов α2 дексмедетомидина обеспечивает надежный вариант для стабильного, высококачественного сбора данных при сохранении функции сети мозга. Кроме того, эта процедура позволяет спонтанно дышать и почти нормальную физиологию у крыс. Дополнительные последовательности визуализации могут быть объединены с получением состояния покоя, создавая экспериментальные протоколы с анестезирующей стабильностью до 5 ч с использованием этого метода. Этот протокол описывает настройку оборудования, мониторинг физиологии крыс во время четырех различных фаз анестезии, получение сканов состояния покоя, оценку качества данных, восстановление животного и краткое обсуждение анализа данных после обработки. Этот протокол может быть использован в широком спектре доклинических моделей грызунов, чтобы помочь выявить результирующие изменения сети мозга, которые происходят в состоянии покоя.

Введение

Функциональная магнитно-резонансная томография в состоянии покоя (rs-fMRI) является мерой сигнала, зависящего от уровня кислорода в крови (BOLD), когда мозг находится в состоянии покоя и не занимается какой-либо конкретной задачей. Эти сигналы могут быть использованы для измерения корреляций между областями мозга для определения функциональной связности в нейронных сетях. rs-fMRI широко используется в клинических исследованиях из-за ее неинвазивности и низкого количества усилий, требуемых от пациентов (по сравнению с фМРТ на основе задач), что делает ее оптимальной для различных групп пациентов1.

Технологические достижения позволили адаптировать rs-fMRI для использования в моделях грызунов для выявления механизмов, лежащих в основе болезненных состояний (см. ссылку2 для обзора). Доклинические модели на животных, включая модели болезней или нокаутов, допускают широкий спектр экспериментальных манипуляций, не применимых к людям, и исследования могут также использовать посмертные образцы для дальнейшего улучшения экспериментов2. Тем не менее, из-за сложности как в ограничении движения, так и в смягчении стресса, МРТ-сбор у грызунов традиционно выполняется под наркозом. Анестетики, в зависимости от их фармакокинетики, фармакодинамики и молекулярных мишеней, влияют на мозговой кровоток, метаболизм мозга и потенциально влияют на пути нервно-сосудистой связи.

Были предприняты многочисленные усилия по разработке анестезирующих протоколов, которые сохраняют нейрососудистую связь и функцию сети мозга3,4,5,6,7,8. Ранее мы сообщали об анестезирующей схеме, в котором применялась низкая доза изофлурана вместе с низкой дозой агониста адренергических рецепторовα 2 дексмедетомидина9. Крысы при этом методе анестезии демонстрировали устойчивые bold-ответы на стимуляцию усов в областях, согласующихся с установленными проекционными путями (вентролатеральные и вентромедиальные таламические ядра, первичная и вторичная соматосенсорная кора); также последовательно обнаруживали крупномасштабные сети мозга с состоянием покоя, включая сети10,11 режима по умолчанию и сеть12 в режиме покоя. Кроме того, этот протокол анестетика позволяет проводить повторную визуализацию на одном и том же животном, что важно для мониторинга прогрессирования заболевания и эффекта экспериментальных манипуляций продольно.

В настоящем исследовании мы подробно описываем экспериментальную установку, подготовку животных и процедуры физиологического мониторинга. В частности, мы описываем конкретные фазы анестезии и получение сканов во время каждой фазы. Качество данных оценивается после каждого сканирования состояния покоя. Краткое резюме анализа после сканирования также включено в обсуждение. Лаборатории, заинтересованные в раскрытии потенциала использования rs-fMRI у крыс, сочтят этот протокол полезным.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Все эксперименты проводились на 9,4-тотном МРТ-сканере и были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию в Дартмутском колледже. Было получено дополнительное разрешение на запись и показ животных, используемых на видео и рисунках ниже.

1. Подготовка перед сканированием

  1. Линия подкожной инфузии
    1. Частично извлеките иглу 23 г из упаковки, чтобы точка иглы оставалось стерильной.
    2. Надежно удерживайте ступицу иглы и используйте лезвие бритвы, чтобы забить вал иглы там, где он встречается со ступицей.
    3. Зажмите держатель иглы вокруг вала непосредственно под забивкой и осторожно отломить вал от ступицы.
    4. Вставьте 1/3 вала иглы (тупой конец) в ранее стерилизованную линию PE50 с достаточной длиной линии, чтобы простираться от насоса для лекарств до животного внутри магнитного отверстия.
  2. Разведение дексмедетомидина и атипамезола
    1. Готовят раствор разбавленного дексмедетомидина гидрохлорида, используя 0,5 мл 0,5 мг/мл бульона, смешанного с 9,5 мл стерильного физиологического раствора в прозрачном стерильном стеклянном флаконе (разбавленная концентрация = 0,025 мг/мл).
    2. Готовят раствор разбавленного атипамезола, используя 0,1 мл 5 мг/мл бульона, смешанного с 9,9 мл стерильного физиологического раствора в прозрачном стерильном стеклянном флаконе (разбавленная концентрация = 0,05 мг/мл).
  3. Параметры сканирования
    1. Используйте параметры, представленные в таблице 1, для подготовки последовательностей сканирования.

2. Фаза 1 анестезии: Индукция и подготовка животных

  1. Настройка
    1. Убедитесь, что все оборудование включено и работает должным образом, включая смеситель кислорода и воздуха, грелку и активную систему мусора (см. Рисунок 1).
    2. Установите температуру системы отопления на 37,5 °C.
  2. Индукция животных
    1. Поместите животное (90-дневная, самец крысы Sprague Dawley) в индукционную камеру и индуцировать анестезию с 2,5% изофлурана в 30% обогащенном кислородом воздухе.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Может быть использован широкий диапазон возрастов животных и обоих полов.
    2. После того, как животное обезболивается, извлеките его из камеры, взвесьте животное и поместите в носовой конус (на 2,5% изофлурана) на грелку в помещении для приготовления.
  3. Подготовка животных
    1. Нанесите офтальмологическую смазочную мазь на каждый глаз, чтобы предотвратить пересыхание.
    2. Подтвердите глубину анестезии отсутствием реакции на ущемление ногой.
    3. Используйте кусачки, чтобы сбрить квадратную область 2 на 2 дюйма в нижней поясничной области спины животного (то есть непосредственно над хвостом).
    4. Вводят 0,015 мг/кг раствора дексмедетомидина внутрибрюшинной (т.п.) инъекцией (например, крыса 300 г получит 0,18 мл) в нижний правый квадрант живота с помощью иглы 25 г.
    5. Выключите поток изофлурана из подготовительного пространства в колыбель животного.
    6. Переместите животное в колыбель для животных. Надежно поместите передние зубы крысы в перекладиной. Нажмите носовой конус на нос, чтобы обеспечить плотное прилегать.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если носовой конус не покрывает нижнюю челюсть, используйте парафиновую пленку, чтобы осторожно удерживать челюсть закрытой, а также запечатывать вокруг носового конуса.
    7. Расположите дыхательную прокладку под брюшком крысы ниже грудной клетки и переместите ее до тех пор, пока форма сигнала дыхания не покажет глубокую впадину, центрированную на каждом вдохе (см. форму волны дыхания на рисунке 2).
    8. Следите за дыханием животного с помощью программного обеспечения для мониторинга физиологии. Переход к следующей фазе анестезии при дыхании менее 40 вдохов/мин (ут/мин; примерно через 5 мин после инъекции дексмедетомидина).

3. Фаза 2 анестезии: Установка животных

  1. Вставьте ушные перекладиски в ушной канал, чтобы стабилизировать голову крысы в колыбели животного. После того, как вы расположились, потяните вперед на перекладине укуса и убедитесь, что голова не двигается. При необходимости отрегулируйте носовой конус и парафиновую пленку (см. Рисунок 3а).
  2. Вставьте датчик температуры в предварительно смазанный одноразовый чехол для зонда. Аккуратно вставьте температурный зонд примерно на 1/2 дюйма в прямую кишку и приклейте его к основанию хвоста медицинской лентой.
  3. Поместите зажим пульсоксиметра на плюсневую область задней ноги, убедив, что источник света находится на нижней части стопы (ладони).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Вращение клипа может повлиять на сигнал; таким образом, создание держателя для удержания лапы и зажима в вертикальном положении приведет к большей стабильности. Также обратите внимание, что пока крыса не находится при нормальной температуре тела, насыщение кислородом может быть низким (<95%).
  4. Используйте вес крысы для расчета скорости инфузии для выброса 0,015 мг / кг / ч дексмедетомидина (крыса с 300 г получает 0,18 мл / ч).
  5. Установите насос препарата для извлечения расчетной скорости инфузии.
  6. Заполните шприц 3 мл стерильным, разбавленным раствором дексмедетомидина и вставьте кончик иглы в открытый конец стерилизованной инфузионной линии (простирающейся от насоса препарата до колыбели животного с предварительно прикрепленной подкожной иглой). Заполните линию и закрепите шприц в держателе шприца насоса для лекарств.
  7. Переместите блок толкателя вперед, пока он не коснется плунжера, и препарат будет выведен на иглу, гарантируя, что линия инфузии полностью заполнена.
  8. Используя спиртовую салфетку, очистите выбритую область, чтобы удалить любые блуждающих волос.
  9. Защемляем кожу примерно на два пальца шириной выше основания хвоста. Вставьте 1/3 иглы линии инфузии в шатровую кожу.
  10. Прикрепите иглу к коже с помощью 3-дюймового куска широкой медицинской ленты. Поместите второй кусок широкой медицинской ленты поверх первой, поперек крысы, и прикрепите к обеим сторонам колыбели животного (см. Рисунок 4).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Критически важно, чтобы ферромагнитная игла была хорошо закреплена для предотвращения движения во время сканирования.
  11. Начинают инфузию подкожного дексмедетомидина.
  12. Поместите кусок марли на переносицу крысы, чтобы создать ровную поверхность для катушки. Используйте бумажную ленту, которая не мешает сигналу МРТ, чтобы закрепить катушку на голове крысы, центрируя ее над мозгом (см. Рисунок 3b,c).
  13. Закрепите все линии и кабели в колыбели животного с помощью лабораторной ленты и проверьте, стабильны ли все физиологические сигналы (см. Рисунок 2).
  14. Положите бумажные полотенца поверх животного, прикрепив их к колыбели животного лабораторной лентой. Если используется система воздушного отопления, оберните пластиковый лист вокруг всей люльки, чтобы вместить теплый воздух.
  15. Переместите животное в отверстие и настройте магнит.

4. Анестезия фазы 3: получение анатомического сканирования

  1. Снижают изофлуран до 1,5%, в результате чего происходит устойчивое увеличение дыхания примерно до 45-50 ут/мин. Оставайтесь на этом уровне в течение всего времени анатомического сканирования.
  2. Используйте сканирование локализатора FLASH, чтобы убедиться, что мозг выровнен с изоцентроммагнита (рисунок 5a). Перепозиционирование животного и повторите при необходимости.
  3. Запустите сканирование ЛОКАЛИЗАТОРА RARE с более высоким разрешением и используйте этот результат сканирования, чтобы выровнять 15 сагиттальных срезов, центрированных по всему мозгу (слева направо, рисунок 5b).
  4. Используя средний сагиттальный срез, выровняйте центральный осевой срез до декуссации передней комиссуры, которая выглядит как темное пятно(рисунок 5c). Обратите внимание на смещение фрагмента, которое будет использоваться позже при сканировании состояния покоя.
  5. Приобретите 23 среза, используя осевые протоколы FLASH и RARE, чтобы помочь в регистрации в общем пространстве во время анализа после сканирования.
  6. Прокладка по всему мозгу с помощью последовательности PRESS.

5. Этап 4: Получение сканирования в состоянии покоя

  1. После завершения анатомического сканирования уменьшают изофлуран до 0,5-0,75%, корректируя так, чтобы дыхание животного было 60-65 вдохов в минуту. Оставайтесь на этом уровне не менее 10 минут, прежде чем начать сканирование в состоянии покоя, чтобы обеспечить стабильность.
  2. Когда физиология стабильна (диапазон дыхания составляет 60-75 бр/мин без задыхания или неровностей, температура тела ядра составляет 37,5 ± 1,0 °C, а насыщение кислородом составляет 95% или более), приобретите 15-срезовое сканирование EPI, используя то же смещение среза, что и анатомический осевой ряд.
  3. После завершения каждого сканирования состояния покоя проверяйте качество с помощью независимого компонентного анализа (ICA) для разложения данных на пространственные и временные компоненты.
  4. Получите не менее трех высококачественных сканирований состояния покоя.

6. Восстановление после сканирования

  1. Когда сканирование завершено, увеличивают изофлуран до 2% и прекращают подкожную инфузию дексмедетомидина.
  2. Снимите колыбель животного из магнитного отверстия, разверните животное и снимите ушные перекладинки, датчик температуры, зажим пульсоксиметра и иглу дексмедетомидина.
  3. Ввести 0,015 мг/кг разбавленного раствора атипамезола в мышцу задней ноги крысы с помощью шприца 1 мл с иглой 25 г (т.е. крыса с 300 г получит 0,09 мл).
  4. Поместите крысу обратно в домашнюю клетку поверх грелки и следите за тем, пока животное не будет амбулаторным.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

После каждого сканирования состояния покоя стабильность оценивается с помощью независимого анализа компонентов (ICA; пример сценария, включенного в дополнительные файлы). На рисунке 6 показаны примеры выходных данных компонентов сканирования в состоянии покоя...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Стабильность животного, как физически, так и физиологически, является ключом к получению высококачественных данных о состоянии покоя. Этот протокол достигает стабильности, проходя через четыре различные фазы анестезии. Крайне важно, чтобы животное соответствовало установленным физи?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была поддержана финансированием Национального института здравоохранения (NIH) Национального института здравоохранения (NIH) по борьбе со злоупотреблением наркотиками (NIDA) [DJW, EDKS и EMB были поддержаны грантом R21DA044501, присужденным Алану И. Грину, а DJW был поддержан грантом T32DA037202 Алану Дж. Дополнительная поддержка была оказана через фонд Алана И. Грина в качестве профессора психиатрии Раймонда Собеля в Дартмуте.

Hanbing Lu поддерживается Национальным институтом по борьбе со злоупотреблением наркотиками Intramural Research Program, NIH.

Авторы хотели бы выразить признательность и благодарность покойному Алану И. Грину. Его непоколебимая преданность области сопутствующих расстройств помогла наладить сотрудничество между авторами. Мы благодарим его за наставничество и руководство, которых будет очень не хватать.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
9.4T MRIVarian/BrukerVarian upgraded with Bruker console running Paravision 6.0.1 software
Air-Oxygen MixerSechristModel 3500CP-G
Analysis of Functional NeuroImages (AFNI)NIMH/NIHVersion AFNI_18.3.03Freely available at: https://afni.nimh.nih.gov/
Animal CradleRAPID BiomedicalLHRXGS-00563rat holder with bite bar, nose cone and ear bars
Animal Physiology Monitoring & Gating SystemSAIIModel 1025MR-compatible system including oxygen saturation, temperature, respiration and fiber optic pulse oximetry add-on
Antisedan (atipamezole hydrochloride)Patterson Veterinary07-867-7097Zoetis, Manufacturer Item #10000449
Ceramic MRI-Safe ScissorsMRIequip.comMT-6003
ClippersPatterson Veterinary07-882-1032Wahl touch-up trimmer combo kit, Manufacturer Item #09990-1201
Dexmedesed (dexmedetomidine hydrochloride)Patterson Veterinary07-893-1801Dechra Veterinary Products, Manufacturer Item#17033-005-10
Digital Rectal Thermometer CoversMedlineMDS9608
FMRIB Software LibraryFMRIBMELODIC Version 3.15Freely available at: https://fsl.fmrib.ox.ac.uk/fsl/fslwiki
Heating PadCara Inc.Model 50
Hemostat forceps, straightKent ScientificINS750451-2
IsofluranePatterson Veterinary07-893-1389Patterson Private Label, Manufacturer Item #14043-0704-06
Isoflurane VaporizerVetEquip Inc.911103
Lab Tape, 3/4"VWR International89097-990
Needles, 23 gaugeBD305145plastic hub removed
Parafilm Laboratory FilmPatterson Veterinary07-893-0260Medline Industries Inc., Manufacturer Item #HSFHS234526A
Planar Surface CoilBrukerT126092cm
Polyethylene TubingBraintree ScientificPE50 50FT0.023" (inner diameter), 0.038" (outer diameter)
Puralube Ophthalmic OintmentPatterson Veterinary07-888-2572Dechra Veterinary Products, Manufacturer Item #211-38
Sprague Dawley RatsCharles River400 SAS SD
Sterile 0.9% Saline SolutionPatterson Veterinary07-892-4348Aspen Vet, Manufacturer Item #14208186
Sterile Alcohol Prep PadsMedlineMDS090735
Surgical Tape, 1" (3M Durapore)MedlineMMM15381Z3M Healthcare, "wide medical tape"
Surgical White Paper Tape, 1/2" (3M Micropore)MedlineMMM153003M Healthcare
Syringes, 1 mL w/ 25 gauge needleBD309626
Syringes, 3 mLBD309657
Vented induction and scavenging systemVetEquip Inc.9421022 liter induction chamber with active scavenging
411724omega flowmeter
931600scavenging cube, "vacuum"
921616nose cone, non-rebreathing

Ссылки

  1. Smitha, K. A., et al. Resting state fMRI: A review on methods in resting state connectivity analysis and resting state networks. The Neuroradiology Journal. 30 (4), 305-317 (2017).
  2. Gorges, M., et al. Functional connectivity mapping in the animal model: Principles and applications of resting-state fMRI. Frontiers in Neurology. 8, (2017).
  3. Paasonen, J., Stenroos, P., Salo, R. A., Kiviniemi, V., Gröhn, O. Functional connectivity under six anesthesia protocols and the awake condition in rat brain. NeuroImage. 172, 9-20 (2018).
  4. Pawela, C. P., et al. A protocol for use of medetomidine anesthesia in rats for extended studies using task-induced BOLD contrast and resting-state functional connectivity. NeuroImage. 46 (4), 1137-1147 (2009).
  5. Jonckers, E., et al. Different anesthesia regimes modulate the functional connectivity outcome in mice. Magnetic Resonance in Medicine. 72 (4), 1103-1112 (2014).
  6. Williams, K. A., et al. Comparison of alpha-chloralose, medetomidine and isoflurane anesthesia for functional connectivity mapping in the rat. Magnetic Resonance Imaging. 28 (7), 995-1003 (2010).
  7. Zhurakovskaya, E., et al. Global functional connectivity differences between sleep-like states in urethane anesthetized rats measured by fMRI. PloS One. 11 (5), 0155343(2016).
  8. Fukuda, M., Vazquez, A. L., Zong, X., Kim, S. -G. Effects of the α2-adrenergic receptor agonist dexmedetomidine on neural, vascular and BOLD fMRI responses in the somatosensory cortex. The European Journal of Neuroscience. 37 (1), 80-95 (2013).
  9. Brynildsen, J. K., et al. Physiological characterization of a robust survival rodent fMRI method. Magnetic Resonance Imaging. 35, 54-60 (2017).
  10. Lu, H., et al. Rat brains also have a default mode network. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (10), 3979-3984 (2012).
  11. Lu, H., et al. Low- but not high-frequency LFP correlates with spontaneous BOLD fluctuations in rat whisker barrel cortex. Cerebral Cortex. 26 (2), 683-694 (2016).
  12. Tsai, P. -J., et al. Converging structural and functional evidence for a rat salience network. Biological Psychiatry. 88 (11), 867-878 (2020).
  13. Murphy, K., Bodurka, J., Bandettini, P. A. How long to scan? The relationship between fMRI temporal signal to noise ratio and necessary scan duration. NeuroImage. 34 (2), 565-574 (2007).
  14. Birn, R. M., et al. The effect of scan length on the reliability of resting-state fMRI connectivity estimates. NeuroImage. 83, 550-558 (2013).
  15. Lu, H., et al. Synchronized delta oscillations correlate with the resting-state functional MRI signal. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (46), 18265-18269 (2007).
  16. Lu, H., et al. Registering and analyzing rat fMRI data in the stereotaxic framework by exploiting intrinsic anatomical features. Magnetic Resonance Imaging. 28 (1), 146-152 (2010).
  17. Cox, R. W. AFNI: software for analysis and visualization of functional magnetic resonance neuroimages. Computers and Biomedical Research. 29 (3), 162-173 (1996).
  18. Ash, J. A., et al. Functional connectivity with the retrosplenial cortex predicts cognitive aging in rats. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (43), 12286-12291 (2016).
  19. Hsu, L. -M., et al. Intrinsic insular-frontal networks predict future nicotine dependence severity. The Journal of Neuroscience. 39 (25), 5028-5037 (2019).
  20. Li, Q., et al. Resting-state functional MRI reveals altered brain connectivity and its correlation with motor dysfunction in a mouse model of Huntington's disease. Scientific Reports. 7, (2017).
  21. Lu, H., et al. Abstinence from cocaine and sucrose self-administration reveals altered mesocorticolimbic circuit connectivity by resting state MRI. Brain Connectivity. 4 (7), 499-510 (2014).
  22. Seewoo, B. J., Joos, A. C., Feindel, K. W. An analytical workflow for seed-based correlation and independent component analysis in interventional resting-state fMRI studies. Neuroscience Research. 165, 26-37 (2021).
  23. Broadwater, M. A., et al. Adolescent alcohol exposure decreases frontostriatal resting-state functional connectivity in adulthood. Addiction Biology. 23 (2), 810-823 (2018).
  24. Jaime, S., Cavazos, J. E., Yang, Y., Lu, H. Longitudinal observations using simultaneous fMRI, multiple channel electrophysiology recording, and chemical microiontophoresis in the rat brain. Journal of Neuroscience Methods. 306, 68-76 (2018).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

174

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены