Acquisition de données d’imagerie par résonance magnétique fonctionnelle à l’état de repos chez le rat

Résumé

Ce protocole décrit une méthode permettant d’obtenir des données d’imagerie par résonance magnétique fonctionnelle (IRMf- rs) stables à l’état de repos d’un rat en utilisant de l’isoflurane à faible dose en association avec de la dexmèdetomidine à faible dose.

Résumé

L’imagerie par résonance magnétique fonctionnelle à l’état de repos (IRMf-rs) est devenue une méthode de plus en plus populaire pour étudier le fonctionnement du cerveau dans un état de repos et de non-tâche. Ce protocole décrit une méthode de survie préclinique pour obtenir des données rs-IRMf. La combinaison d’isoflurane à faible dose avec une perfusion continue de la dexmététomidine, agoniste des récepteurs adrénergiques α_2, offre une option robuste pour une acquisition de données stable et de haute qualité tout en préservant la fonction du réseau cérébral. De plus, cette procédure permet une respiration spontanée et une physiologie presque normale chez le rat. Des séquences d’imagerie supplémentaires peuvent être combinées avec l’acquisition à l’état de repos, créant des protocoles expérimentaux avec une stabilité anesthésique allant jusqu’à 5 h en utilisant cette méthode. Ce protocole décrit la configuration de l’équipement, la surveillance de la physiologie du rat pendant quatre phases distinctes de l’anesthésie, l’acquisition de scans à l’état de repos, l’évaluation de la qualité des données, la récupération de l’animal et une brève discussion sur l’analyse des données post-traitement. Ce protocole peut être utilisé dans une grande variété de modèles précliniques de rongeurs pour aider à révéler les changements du réseau cérébral qui en résultent et qui se produisent au repos.

Introduction

L’imagerie par résonance magnétique fonctionnelle à l’état de repos (IRMf rs) est une mesure du signal BOLD (blood-oxygen-level-dependent) lorsque le cerveau est au repos et n’est engagé dans aucune tâche particulière. Ces signaux peuvent être utilisés pour mesurer les corrélations entre les régions du cerveau afin de déterminer la connectivité fonctionnelle au sein des réseaux neuronaux. L’IRMf rs est largement utilisée dans les études cliniques en raison de son caractère non invasif et du faible effort requis des patients (par rapport à l’IRMf basée sur les tâches), ce qui la rend optimale pour diverses populations de patients¹.

Les progrès technologiques ont permis d’adapter l’IRMf-rs pour une utilisation dans des modèles de rongeurs afin de découvrir les mécanismes sous-jacents aux états pathologiques (voir la référence² pour la revue). Les modèles animaux précliniques, y compris les modèles de maladie ou de knockout, permettent un large éventail de manipulations expérimentales non applicables chez l’homme, et les études peuvent également utiliser des échantillons post-mortem pour améliorer davantage les expériences². Néanmoins, en raison de la difficulté à limiter le mouvement et à atténuer le stress, l’acquisition d’IRM chez les rongeurs est traditionnellement réalisée sous anesthésie. Les agents anesthésiques, en fonction de leur pharmacocinétique, de leur pharmacodynamique et de leurs cibles moléculaires, influencent le flux sanguin cérébral, le métabolisme cérébral et affectent potentiellement les voies de couplage neurovasculaire.

Il y a eu de nombreux efforts pour développer des protocoles anesthésiques qui préservent le couplage neurovasculaire et la fonction du réseau cérébral^3,4,^5,6,7,8. Nous avons précédemment rapporté un régime anesthésique qui appliquait une faible dose d’isoflurane ainsi qu’une faible dose de l’agoniste des récepteurs adrénergiques α₂ dexmèdetomidine⁹. Les rats sous cette méthode d’anesthésie ont présenté des réponses BOLD robustes à la stimulation des moustaches dans des régions compatibles avec les voies de projection établies (noyaux thalamiques ventrolatéral et ventromédian, cortex somatosensoriel primaire et secondaire); les réseaux cérébraux à l’état de repos à grande échelle, y compris le réseau de mode par défaut^10,11 et le réseau de saillance¹² ont également été systématiquement détectés. De plus, ce protocole anesthésique permet une imagerie répétée sur le même animal, ce qui est important pour surveiller longitudinalement la progression de la maladie et l’effet des manipulations expérimentales.

Dans la présente étude, nous détaillons la configuration expérimentale, la préparation des animaux et les procédures de surveillance physiologique impliquées. En particulier, nous décrivons les phases anesthésiques spécifiques et l’acquisition de scans au cours de chaque phase. La qualité des données est évaluée après chaque analyse de l’état de repos. Un bref résumé de l’analyse post-balayage est également inclus dans la discussion. Les laboratoires intéressés à découvrir le potentiel de l’utilisation de l’IRMf chez le rat trouveront ce protocole utile.

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Protocole

Toutes les expériences ont été réalisées sur un scanner IRM de 9,4 T et ont été approuvées par le comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux du Dartmouth College. Une approbation supplémentaire a été obtenue pour enregistrer et montrer les animaux utilisés dans la vidéo et les figures ci-dessous.

1. Préparations avant la numérisation

1. Ligne de perfusion sous-cutanée
   1. Retirez partiellement une aiguille de 23 G de son emballage afin que le point de l’aiguille reste stérile.
   2. Tenez solidement le moyeu de l’aiguille et utilisez une lame de rasoir pour marquer l’arbre de l’aiguille à l’endroit où il rencontre le moyeu.
   3. Serrez un porte-aiguille autour de l’arbre directement sous le scoring et cassez doucement l’arbre du moyeu.
   4. Insérez 1/3 de l’arbre de l’aiguille (extrémité émoussée) dans une ligne PE50 préalablement stérilisée avec une longueur de ligne suffisante pour s’étendre de la pompe à médicament à l’animal à l’intérieur de l’alésage de l’aimant.
2. Dilution de la dexmététomidine et de l’atipamezole
   1. Préparer une solution de chlorhydrate de dexmédétomidine dilué en utilisant 0,5 mL de 0,5 mg/mL de bouillon mélangé à 9,5 mL de solution saline stérile dans un flacon en verre clair et stérile (concentration diluée = 0,025 mg/mL).
   2. Préparer une solution d’atipamézole dilué en utilisant 0,1 mL de bouillon de 5 mg/mL mélangé à 9,9 mL de solution saline stérile dans un flacon en verre clair et stérile (concentration diluée = 0,05 mg/mL).
3. Paramètres d’analyse
   1. Utilisez les paramètres présentés dans le tableau 1 pour préparer les séquences de numérisation.

2. Anesthésie de phase 1 : Induction et préparation des animaux

1. Coup monté
   1. Assurez-vous que tout l’équipement est allumé et fonctionne correctement, y compris le mélangeur d’oxygène et d’air, le coussin chauffant et le système de récupération actif (voir la figure 1).
   2. Réglez le point de consigne de température du système de chauffage à 37,5 °C.
2. Induction animale
   1. Placer l’animal (rat Sprague Dawley mâle de 90 jours) dans la chambre d’induction et induire une anesthésie avec 2,5% d’isoflurane dans un air enrichi en oxygène à 30%.
      REMARQUE: Un large éventail d’âges d’animaux et les deux sexes peuvent être utilisés.
   2. Une fois l’animal anesthésié, retirez-le de la chambre, pesez-le et placez-le dans le cône du nez (à 2,5% d’isoflurane) sur le coussin chauffant dans l’espace de préparation.
3. Préparation des animaux
   1. Appliquez une pommade lubrifiante ophtalmique sur chaque œil pour éviter le dessèchement.
   2. Confirmez la profondeur de l’anesthésie par un manque de réponse au pincement des orteils.
   3. Utilisez des tondeuses pour raser une zone carrée de 2 po sur 2 po sur la région lombaire inférieure du dos de l’animal (c.-à-d. directement au-dessus de la queue).
   4. Administrer 0,015 mg/kg de la solution de dexmédétomidine avec une injection intrapéritonéale (p.i.) (p.ex., un rat de 300 g recevrait 0,18 mL) dans le quadrant inférieur droit de l’abdomen à l’aide d’une aiguille de 25 G.
   5. Basculez le flux d’isoflurane de l’espace de préparation vers le berceau de l’animal.
   6. Déplacez l’animal dans le berceau de l’animal. Placez les dents de devant du rat en toute sécurité sur et dans la barre de morsure. Poussez le cône de nez sur le nez pour assurer un ajustement serré.
      REMARQUE: Si le cône de nez ne recouvre pas la mâchoire inférieure, utilisez un film de paraffine pour maintenir doucement la mâchoire fermée tout en scellant autour du cône de nez.
   7. Placez le coussinet respiratoire sous l’abdomen du rat sous la cage thoracique et re positionnez-le jusqu’à ce que la forme d’onde respiratoire montre un creux profond centré sur chaque respiration (voir la forme d’onde respiratoire à la figure 2).
   8. Surveillez la respiration de l’animal à l’aide du logiciel de surveillance physiologique. Passer à la phase suivante de l’anesthésie lorsque la respiration est inférieure à 40 respirations / min (bpm; environ 5 min après l’injection de dexmététomidine).

3. Anesthésie de phase 2 : Configuration animale

1. Insérez des barres auriculaires dans le conduit auditif pour stabiliser la tête du rat dans le berceau de l’animal. Une fois positionné, tirez vers l’avant sur la barre de morsure et confirmez que la tête ne bouge pas. Réajustez le cône de nez et le film de paraffine au besoin (voir La figure 3a).
2. Insérez la sonde de température dans un couvercle de sonde jetable prélubrifié. Insérez doucement la sonde de température d’environ 1/2 » dans le rectum et collez-la à la base de la queue avec du ruban adhésif médical.
3. Placez le clip de l’oxymètre de pouls sur la zone métatarsienne du pied postérieur, en vous assurant que la source de lumière se trouve au bas du pied (paume).
   REMARQUE: La rotation du clip peut affecter le signal; ainsi, la création d’un support pour garder la patte et le clip droits conduira à une plus grande stabilité. Notez également que jusqu’à ce que le rat soit à la température corporelle normale, la saturation en oxygène peut être faible (<95%).
4. Utilisez le poids du rat pour calculer le débit de perfusion afin d’éjecter 0,015 mg/kg/h de dexmététomidine (un rat de 300 g reçoit 0,18 mL/h).
5. Réglez la pompe à médicament pour éjecter le débit de perfusion calculé.
6. Remplissez une seringue de 3 mL avec la solution stérile et diluée de dexmététomidine et insérez l’extrémité de l’aiguille dans l’extrémité ouverte de la ligne de perfusion stérilisée (s’étendant de la pompe à médicament au berceau de l’animal avec l’aiguille sous-cutanée préalablement attachée). Remplissez la ligne et fixez la seringue dans le porte-seringue de la pompe à médicaments.
7. Déplacez le bloc poussoir vers l’avant jusqu’à ce qu’il touche le piston et que le médicament soit expulsé à l’aiguille, en veillant à ce que la ligne de perfusion soit complètement remplie.
8. À l’aide d’une lingette alcoolisée, nettoyez la zone rasée pour éliminer les poils errants.
9. Pincez la peau à environ deux largeurs de doigts au-dessus de la base de la queue. Insérez 1/3 de l’aiguille de la ligne de perfusion dans la peau de la tente.
10. Fixez l’aiguille à la peau avec un morceau de ruban médical large de 3 pouces. Placez un deuxième morceau de ruban adhésif médical large sur le premier, à travers le rat, et attaché aux deux côtés du berceau de l’animal (voir la figure 4).
    REMARQUE: Il est extrêmement important que l’aiguille ferromagnétique soit bien fixée pour empêcher tout mouvement pendant l’analyse.
11. Commencer la perfusion de dexmététomidine sous-cutanée.
12. Placez un morceau de gaze sur l’arête du nez du rat pour créer une surface plane pour la bobine. Utilisez du ruban adhésif en papier, qui n’interfère pas avec le signal IRM, pour fixer la bobine à la tête du rat, en la centrant sur le cerveau (voir Figure 3b,c).
13. Fixez toutes les lignes et tous les câbles à l’intérieur du berceau de l’animal avec du ruban adhésif de laboratoire et vérifiez si tous les signaux physiologiques sont stables (voir la figure 2).
14. Placez des serviettes en papier sur l’animal, en les fixant au berceau de l’animal avec du ruban adhésif de laboratoire. Si vous utilisez un système de chauffage de l’air, enroulez une feuille de plastique autour de tout le berceau pour contenir l’air chaud.
15. Déplacez l’animal dans l’alésage et accordez l’aimant.

4. Anesthésie de phase 3 : acquisition d’un scanner anatomique

1. Réduire l’isoflurane à 1,5%, ce qui entraîne une augmentation constante de la respiration à environ 45-50 bpm. Rester à ce niveau pendant toute la durée du balayage anatomique.
2. Utilisez le scan du localisateur FLASH pour vous assurer que le cerveau est aligné avec l’isocentre de l’aimant (Figure 5a). Repositionnez l’animal et répétez si nécessaire.
3. Exécutez l’analyse de localisation RARE à plus haute résolution et utilisez cette sortie de numérisation pour aligner 15 tranches sagnitales centrées sur le cerveau (de gauche à droite, Figure 5b).
4. À l’aide de la tranche sagittale moyenne, alignez la tranche axiale centrale sur la décussation de la commissure antérieure, qui apparaît comme une tache sombre (Figure 5c). Notez le décalage de tranche à utiliser ultérieurement dans les analyses à l’état de repos.
5. Acquérir 23 tranches en utilisant les protocoles axiaux FLASH et RARE pour faciliter l’enregistrement dans un espace commun lors de l’analyse post-scan.
6. Parcourez tout le cerveau à l’aide de la séquence PRESS.

5. Phase 4 : Acquisition de l’analyse à l’état de repos

1. Après avoir terminé les examens anatomiques, réduisez l’isoflurane à 0,5% à 0,75%, en ajustant de sorte que la respiration de l’animal soit de 60 à 65 respirations par minute. Restez à ce niveau pendant au moins 10 minutes avant de commencer l’analyse à l’état de repos pour assurer la stabilité.
2. Lorsque la physiologie est stable (la plage de respiration est de 60 à 75 bpm sans halètement ni irrégularités, la température corporelle centrale est de 37,5 ± 1,0 ° C et la saturation en oxygène est de 95% ou plus), acquérir un EPI scan de 15 tranches en utilisant le même décalage de tranche que la série axiale anatomique.
3. Une fois chaque analyse à l’état de repos terminée, vérifiez la qualité à l’aide d’une analyse de composants indépendante (ICA) pour décomposer les données en composants spatiaux et temporels.
4. Obtenez au moins trois analyses de l’état de repos de haute qualité.

6. Récupération post-analyse

1. Lorsque le balayage est terminé, augmenter l’isoflurane à 2% et arrêter la perfusion sous-cutanée de dexmététomidine.
2. Retirez le berceau de l’animal de l’alésage de l’aimant, déballez l’animal et retirez les barres d’oreille, la sonde de température, le clip de l’oxymètre de pouls et l’aiguille de dexmététomidine.
3. Injecter 0,015 mg/kg de la solution diluée d’atipamezole dans le muscle de la patte postérieure du rat à l’aide d’une seringue de 1 mL avec une aiguille de 25 G (c.-à-d. qu’un rat de 300 g recevrait 0,09 mL).
4. Replacez le rat dans la cage de la maison sur un coussin chauffant et surveillez jusqu’à ce que l’animal soit ambulatoire.

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Résultats

Après chaque analyse à l’état de repos, la stabilité est évaluée à l’aide d’une analyse de composants indépendante (ICA; exemple de script inclus dans les fichiers supplémentaires). La figure 6 montre des exemples de sorties de composants provenant d’analyses à l’état de repos. La figure 6a montre un composant de signal provenant d’un balayage avec une grande stabilité. Notez que spatialement, la composante a une grande r...

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Discussion

La stabilité de l’animal, à la fois physiquement et physiologiquement, est essentielle pour obtenir des données de haute qualité sur l’état de repos. Ce protocole atteint la stabilité en passant par quatre phases distinctes de l’anesthésie. Il est impératif que l’animal ait atteint les seuils physiologiques fixés avant de passer à la phase suivante de l’anesthésie; étant donné que cette méthode repose sur des mécanismes physiologiques d’autorégulation, les animaux individuels peuvent nécessit...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
9.4T MRI	Varian/Bruker		Varian upgraded with Bruker console running Paravision 6.0.1 software
Air-Oxygen Mixer	Sechrist	Model 3500CP-G
Analysis of Functional NeuroImages (AFNI)	NIMH/NIH	Version AFNI_18.3.03	Freely available at: https://afni.nimh.nih.gov/
Animal Cradle	RAPID Biomedical	LHRXGS-00563	rat holder with bite bar, nose cone and ear bars
Animal Physiology Monitoring & Gating System	SAII	Model 1025	MR-compatible system including oxygen saturation, temperature, respiration and fiber optic pulse oximetry add-on
Antisedan (atipamezole hydrochloride)	Patterson Veterinary	07-867-7097	Zoetis, Manufacturer Item #10000449
Ceramic MRI-Safe Scissors	MRIequip.com	MT-6003
Clippers	Patterson Veterinary	07-882-1032	Wahl touch-up trimmer combo kit, Manufacturer Item #09990-1201
Dexmedesed (dexmedetomidine hydrochloride)	Patterson Veterinary	07-893-1801	Dechra Veterinary Products, Manufacturer Item#17033-005-10
Digital Rectal Thermometer Covers	Medline	MDS9608
FMRIB Software Library	FMRIB	MELODIC Version 3.15	Freely available at: https://fsl.fmrib.ox.ac.uk/fsl/fslwiki
Heating Pad	Cara Inc.	Model 50
Hemostat forceps, straight	Kent Scientific	INS750451-2
Isoflurane	Patterson Veterinary	07-893-1389	Patterson Private Label, Manufacturer Item #14043-0704-06
Isoflurane Vaporizer	VetEquip Inc.	911103
Lab Tape, 3/4"	VWR International	89097-990
Needles, 23 gauge	BD	305145	plastic hub removed
Parafilm Laboratory Film	Patterson Veterinary	07-893-0260	Medline Industries Inc., Manufacturer Item #HSFHS234526A
Planar Surface Coil	Bruker	T12609	2cm
Polyethylene Tubing	Braintree Scientific	PE50 50FT	0.023" (inner diameter), 0.038" (outer diameter)
Puralube Ophthalmic Ointment	Patterson Veterinary	07-888-2572	Dechra Veterinary Products, Manufacturer Item #211-38
Sprague Dawley Rats	Charles River	400 SAS SD
Sterile 0.9% Saline Solution	Patterson Veterinary	07-892-4348	Aspen Vet, Manufacturer Item #14208186
Sterile Alcohol Prep Pads	Medline	MDS090735
Surgical Tape, 1" (3M Durapore)	Medline	MMM15381Z	3M Healthcare, "wide medical tape"
Surgical White Paper Tape, 1/2" (3M Micropore)	Medline	MMM15300	3M Healthcare
Syringes, 1 mL w/ 25 gauge needle	BD	309626
Syringes, 3 mL	BD	309657
Vented induction and scavenging system	VetEquip Inc.	942102	2 liter induction chamber with active scavenging
		411724	omega flowmeter
		931600	scavenging cube, "vacuum"
		921616	nose cone, non-rebreathing