רכישת נתוני הדמיית תהודה מגנטית תפקודית של מצב מנוחה בחולדה

Summary

פרוטוקול זה מתאר שיטה לקבלת נתוני הדמיית תהודה מגנטית תפקודית יציבה של מצב מנוחה (rs-fMRI) מעכברוש המשתמש באיזופלוראן במינון נמוך בשילוב עם dexmedetomidine במינון נמוך.

Abstract

הדמיית תהודה מגנטית תפקודית של מצב מנוחה (rs-fMRI) הפכה לשיטה פופולרית יותר ויותר לחקר תפקוד המוח במצב מנוחה ולא משימה. פרוטוקול זה מתאר שיטת הישרדות פרה-אקלינית לקבלת נתוני rs-fMRI. שילוב איזופלוראן במינון נמוך עם עירוי מתמשך של אגוניסט אגוניסט קולטן adrenergic α₂ dexmedetomidine מספק אפשרות חזקה לרכישת נתונים יציבה ואיכותית תוך שמירה על תפקוד רשת המוח. יתר על כן, הליך זה מאפשר נשימה ספונטנית ופיזיולוגיה כמעט נורמלית בחולדה. רצפי הדמיה נוספים יכולים להיות משולבים עם רכישת מצב מנוחה יצירת פרוטוקולים ניסיוניים עם יציבות הרדמה של עד 5 שעות בשיטה זו. פרוטוקול זה מתאר את ההתקנה של ציוד, ניטור של פיזיולוגיה חולדה במהלך ארבעה שלבים נפרדים של הרדמה, רכישת סריקות מצב מנוחה, הערכת איכות של נתונים, שחזור של החיה, ודיון קצר של ניתוח נתונים לאחר עיבוד. פרוטוקול זה יכול לשמש על פני מגוון רחב של מודלים מכרסמים פרה-קליניים כדי לעזור לחשוף את השינויים ברשת המוח המתקבלים המתרחשים במנוחה.

Introduction

הדמיית תהודה מגנטית תפקודית של מצב מנוחה (rs-fMRI) היא מדד לאות תלוי רמת החמצן בדם (BOLD) כאשר המוח נמצא במנוחה ואינו עוסק בשום משימה מסוימת. אותות אלה יכולים לשמש למדידת מתאם בין אזורי המוח כדי לקבוע את הקישוריות התפקודית בתוך רשתות עצביות. rs-fMRI נמצא בשימוש נרחב במחקרים קליניים בשל אי פולשניותו וכמות המאמץ הנמוכה הנדרשת מחולים (בהשוואה ל- fMRI מבוסס משימה) מה שהופך אותו לאופטימלי עבור אוכלוסיות חולים מגוונות¹.

ההתקדמות הטכנולוגית אפשרה rs-fMRI להיות מותאם לשימוש במודלים מכרסמים כדי לחשוף מנגנונים שבבסיס מצבי המחלה (ראה התייחסות² לבדיקה). מודלים פרה-קליניים של בעלי חיים, כולל מודלים של מחלות או נוקאאוט, מאפשרים מגוון רחב של מניפולציות ניסיוניות שאינן ישימות בבני אדם, ומחקרים יכולים גם לעשות שימוש בדגימות שלאחר המוות כדי לשפר עוד יותר את הניסויים². עם זאת, בשל הקושי הן להגביל את התנועה והן להקל על הלחץ, רכישת MRI במכרסמים מבוצעת באופן מסורתי תחת הרדמה. חומרי הרדמה, בהתאם לפרמקוקינטיקה שלהם, פרמקודינמיקה, ויעדים מולקולריים, להשפיע על זרימת הדם במוח, חילוף החומרים במוח, ועלול להשפיע על מסלולי צימוד נוירווסקולרי.

היו מאמצים רבים לפתח פרוטוקולים הרדמה המשמרים צימוד נוירווסקולרי ותפקוד רשת המוח^3,4,5,6,7,8. דיווחנו בעבר משטר הרדמה שהפעיל מינון נמוך של איזופלוראן יחד עם מינון נמוך של α₂ אגוניסט קולטן adrenergic dexmedetomidine⁹. חולדות בשיטה זו של הרדמה הציגו תגובות BOLD חזקות לגירוי שפם באזורים התואמים את מסלולי ההקרנה הוקמה (גרעינים תלמיים גחוניים וגחוניים, קליפת המוח הסומטו-סנסורית העיקרית והמשנית); רשתות מוח במצב מנוחה בקנה מידה גדול, כולל רשת מצב ברירת המחדל^10,11 ורשת salience¹² זוהו גם הם בעקביות. יתר על כן, פרוטוקול הרדמה זה מאפשר הדמיה חוזרת על אותה חיה, אשר חשוב לניטור התקדמות המחלה ואת ההשפעה של מניפולציות ניסיוניות לאורך.

במחקר הנוכחי אנו מפרטים את ההתקנה הניסיונית, הכנת בעלי החיים והליכי הניטור הפיזיולוגי המעורבים. בפרט, אנו מתארים את השלבים ההרדמה הספציפיים ורכישת סריקות במהלך כל שלב. איכות הנתונים מוערכת לאחר כל סריקה של מצב מנוחה. סיכום קצר של ניתוח לאחר הסריקה נכלל גם הוא בדיון. מעבדות המעוניינות לחשוף את הפוטנציאל של שימוש rs-fMRI בחולדות ימצאו פרוטוקול זה שימושי.

Protocol

כל הניסויים בוצעו בסורק MRI 9.4 T, ואושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש במכללת דארטמות'. אישור נוסף הושג כדי להקליט ולהציג את בעלי החיים המשמשים בסרטון ובדמויות להלן.

1. הכנות לפני הסריקה

1. קו עירוי תת עורי
   1. הסר חלקית מחט 23 G מהחבילה שלה, כך נקודת המחט נשאר סטרילי.
   2. החזק בבטחה את רכזת המחט והשתמש בסכין גילוח כדי להבקיע את פיר המחט שבו הוא פוגש את הרכזת.
   3. מהדק מחזיק מחט סביב הפיר ישירות מתחת לניקוד ולשבור בעדינות את הפיר מהרכזת.
   4. הכנס 1/3 של פיר המחט (קצה קהה) לתוך קו PE50 מעוקר בעבר עם אורך קו מספיק כדי להרחיב ממשאבת הסמים לחיה בתוך המגנט משעמם.
2. דילול של דקסמדטומידין ואטיפמזול
   1. הכן פתרון של הידרוכלוריד dexmedetomidine מדולל באמצעות 0.5 מ"ל של 0.5 מ"ג / מ"ל מלאי מעורבב עם 9.5 מ"ל של תמיסת מלח סטרילית בבקבוק זכוכית ברור, סטרילי (ריכוז מדולל = 0.025 מ"ג / מ"ל).
   2. הכן פתרון של atipamezole מדולל באמצעות 0.1 מ"ל של 5 מ"ג / מ"ל מלאי מעורבב עם 9.9 מ"ל של מלוחים סטריליים בבקבוק זכוכית ברור, סטרילי (ריכוז מדולל = 0.05 מ"ג / מ"ל).
3. פרמטרי סריקה
   1. השתמש בפרמטרים המוצגים בטבלה 1 כדי להכין רצפי סריקה.

2. הרדמה שלב 1: אינדוקציה והכנה של בעלי חיים

1. ההתקנה
   1. ודאו שכל הציוד פועל ופועל כראוי, כולל מערבל החמצן והאוויר, כרית החימום ומערכת ניקוי אקטיבית (ראו איור 1).
   2. הגדר את נקודת סט הטמפרטורה של מערכת החימום ל 37 °C (5 °F).
2. אינדוקציה של בעלי חיים
   1. מניחים את החיה (חולדת ספראג דולי זכר בת 90 יום) בתא האינדוקציה ומעוררים הרדמה עם 2.5% איזופלוראן ב-30% אוויר מועשר בחמצן.
      הערה: ניתן להשתמש במגוון רחב של גילאים של בעלי חיים ושני המינים.
   2. לאחר החיה הוא מרדים, להסיר אותו מהתא, לשקול את החיה, ומניחים אותו חרוט האף (ב 2.5% איזופלוראן) על כרית החימום בחלל ההכנה.
3. הכנת בעלי חיים
   1. יש למרוח משחת סיכה עיניים על כל עין כדי למנוע ייבוש.
   2. אשר את עומק ההרדמה על ידי חוסר תגובה צביטת בוהן.
   3. השתמש בקוצץ כדי לגלח שטח מרובע בגודל 2 אינץ' על 2 אינץ' על החלק התחתון של גב החיה (כלומר, ישירות מעל הזנב).
   4. לנהל 0.015 מ"ג/ק"ג של תמיסה dexmedetomidine עם הזרקה intraperitoneal (i.p.) (למשל, חולדה 300 גרם יקבל 0.18 מ"ל) לתוך הרביע הימני התחתון של הבטן באמצעות מחט 25 G.
   5. החלף את זרימת האיזופלוראן מחלל ההכנה לעריסת בעלי החיים.
   6. תזיז את החיה לעריסת החיות. מניחים את השיניים הקדמיות של החולדה בבטחה מעל לתוך מוט הנשיכה. לדחוף את חרוט האף מעל האף כדי להבטיח התאמה הדוקה.
      הערה: אם חרוט האף אינו מכסה את הלסת התחתונה, השתמש בסרט פרפין כדי להחזיק בעדינות את הלסת סגורה תוך איטום סביב חרוט האף.
   7. מקמו את משטח הנשימה מתחת לבטן החולדה מתחת לכלוב הצלעות ומיקמו אותו מחדש עד שצורת גל הנשימה מראה שוקת עמוקה שבמרכזה כל נשימה (ראו צורת גל נשימה באיור 2).
   8. נטר את נשימת החיה באמצעות תוכנת ניטור פיזיולוגיה. לעבור לשלב הבא של הרדמה כאשר הנשימה היא פחות מ 40 נשימות / דקה (bpm; כ 5 דקות לאחר הזרקת dexmedetomidine).

3. שלב 2 הרדמה: הגדרת בעלי חיים

1. הכנס מוטות אוזניים לתוך תעלת האוזן כדי לייצב את ראשו של החולדה בעריסת החיה. לאחר מיקום, למשוך קדימה על מוט הנשיכה ולאשר את הראש לא זז. כווננו מחדש את קונוס האף ואת סרט הפרפין לפי הצורך (ראו איור 3a).
2. הכנס את בדיקת הטמפרטורה לכיסוי בדיקה חד פעמי משומן מראש. מכניסים בעדינות את בדיקת הטמפרטורה כ-1/2 אינץ' לפי הטבעת, ומדביקים אותה לבסיס הזנב עם סרט רפואי.
3. מניחים את קליפ האוקסימטר הדופק על אזור metatarsal של כף הרגל האחורית, להבטיח את מקור האור הוא על החלק התחתון של כף הרגל (כף היד).
   הערה: סיבוב של הקליפ יכול להשפיע על האות; לכן, יצירת מחזיק כדי לשמור על כף רגל קליפ זקוף יוביל ליציבות רבה יותר. כמו כן, שים לב כי עד החולדה היא בטמפרטורת גוף נורמלית, רוויית החמצן עשויה להיות נמוכה (<95%).
4. השתמש במשקל של החולדה כדי לחשב את קצב עירוי כדי להוציא 0.015 מ"ג / קילוגרם / שעה של dexmedetomidine (חולדה 300 גרם מקבל 0.18 מ"ל / שעה).
5. הגדר את משאבת התרופה כדי להוציא את שיעור עירוי מחושב.
6. מלא מזרק 3 מ"ל עם פתרון dexmedetomidine סטרילי, מדולל ולהכניס את קצה המחט לתוך הקצה הפתוח של קו עירוי מעוקר (המשתרע ממשאבת הסמים לעריסת החיה עם המחט התת עורית שחוברה בעבר). מלא את הקו ואבטח את המזרק במחזיק המזרק של משאבת הסמים.
7. הזז את בלוק דוחף קדימה עד שהוא נוגע הבוכנה, ואת התרופה מסולקת על המחט, להבטיח את קו עירוי הוא מלא לחלוטין.
8. באמצעות מגבון אלכוהול, לנקות את האזור המגולח כדי להסיר כל שיער תועה.
9. צבוט את העור כשתי אצבעות רוחב מעל בסיס הזנב. הכנס 1/3 של מחט קו עירוי לתוך העור אוהל.
10. אבטחו את המחט לעור עם פיסת סרט רפואי רחבה של 3". הניחו חתיכה שנייה של סרט רפואי רחב מעל הראשון, על פני החולדה, ומחוברים לשני צידי עריסת החיות (ראו איור 4).
    הערה: חשוב מאוד שהמחט הפרומגנטית מאובטחת היטב כדי למנוע תנועה במהלך הסריקה.
11. התחל עירוי של dexmedetomidine תת עורי.
12. מניחים חתיכת גזה על גשר האף של החולדה כדי ליצור משטח רמה ל סליל. השתמשו בסרט נייר, שאינו מפריע לאות ה-MRI, כדי לאבטח את סליל לראש החולדה, ולרכז אותו מעל המוח (ראו איור 3b, c).
13. אבטחו את כל הקווים והכבלים בתוך עריסת החיות עם סרט מעבדה ובדקו אם כל אותות הפיזיולוגיה יציבים (ראו איור 2).
14. מניחים מגבות נייר מעל החיה, מאבטחים אותם לעריסת החיות עם סרט מעבדה. אם משתמשים במערכת חימום אוויר, עוטפים יריעת פלסטיק סביב העריסה כולה כדי להכיל את האוויר החם.
15. תזיזו את החיה לתוך השעמום ותכוונו את המגנט.

4. הרדמה שלב 3: רכישת סריקה אנטומית

1. להפחית איזופלוראן ל 1.5%, וכתוצאה מכך עלייה מתמדת בנשימה כ 45-50 bpm. הישאר ברמה זו למשך הסריקה האנטומית.
2. השתמש בסריקת לוקליזציה של FLASH כדי להבטיח שהמוח מיושר עם איזו-מרכז המגנט(איור 5a). מקם מחדש את החיה וחוזר על הפעולה במידת הצורך.
3. הפעל את סריקת התזרים הנדיר ברזולוציה גבוהה יותר והשתמש בפלט הסריקה הזה כדי ליישר 15 פרוסות קשת ממורכזות במוח (משמאל לימין, איור 5b).
4. בעזרת פרוסת הקשת האמצעית, יישרו את הפרוסה צירית מרכזית לפירוק של הקומיסור החלקירי, המופיע כנקודה כהה(איור 5c). שים לב להיסט הפרוסה לשימוש מאוחר יותר בסריקות מצב המנוחה.
5. רכוש 23 פרוסות באמצעות הפרוטוקולים ציריים FLASH ו- RARE כדי לסייע ברישום למרחב משותף במהלך ניתוח שלאחר הסריקה.
6. שיים על פני כל המוח באמצעות רצף PRESS.

5. שלב 4: רכישת סריקת מצב מנוחה

1. לאחר השלמת סריקות אנטומיות, להפחית איזופלוראן ל 0.5% עד 0.75%, התאמה כך הנשימה של החיה היא 60-65 נשימות לדקה. הישאר ברמה זו לפחות 10 דקות לפני תחילת סריקת מצב המנוחה כדי להבטיח יציבות.
2. כאשר הפיזיולוגיה יציבה (טווח הנשימה הוא 60-75 bpm ללא התנשפות או אי סדרים, טמפרטורת גוף הליבה היא 37.5 ± 1.0 מעלות צלזיוס, ורוויה חמצן היא 95% ומעלה), לרכוש 15 פרוסות EPI סריקה באמצעות אותו פרוסה היסט כמו סדרת ציר אנטומית.
3. לאחר השלמת כל סריקת מצב מנוחה, בדוק את האיכות באמצעות ניתוח רכיבים עצמאי (ICA) כדי לפרק את הנתונים לרכיבים מרחביים וטמפורליים.
4. השג לפחות שלוש סריקות מצב מנוחה באיכות גבוהה.

6. שחזור לאחר הסריקה

1. לאחר השלמת הסריקה, להגדיל איזופלוראן ל 2% ולעצור את עירוי dexmedetomidine תת עורי.
2. הסר את עריסת החיה מן המגנט נשא, לפרוק את החיה, ולהסיר מוטות אוזניים, בדיקת טמפרטורה, קליפ אוקסימטר דופק, ואת מחט dexmedetomidine.
3. הזריק 0.015 מ"ג/ק"ג של פתרון atipamezole מדולל לתוך שריר הרגל האחורית של החולדה באמצעות מזרק 1 מ"ל עם מחט 25 G (כלומר, חולדה 300 גרם יקבל 0.09 מ"ל).
4. מניחים את החולדה בחזרה בכלוב הביתי על גבי כרית חימום ומפקחים עד שהחיה אמבולטורית.

תוצאות

לאחר כל סריקה של מצב מנוחה, היציבות מוערכת באמצעות ניתוח רכיבים עצמאי (ICA; סקריפט לדוגמה הכלול בקבצים משלימים). איור 6 מציג דוגמאות לפלט רכיבים מסריקות במצב מנוחה. איור 6a מציג רכיב אות מסריקה עם יציבות גבוהה. שימו לב כי מרחבית, לרכיב יש אזוריות גבוהה. ...

Discussion

יציבות החיה, הן פיזית והן מבחינה פיזיולוגית, היא המפתח להשגת נתוני מצב מנוחה באיכות גבוהה. פרוטוקול זה משיג יציבות על ידי מעבר דרך ארבעה שלבים נפרדים של הרדמה. זה הכרחי כי החיה פגשה את הסף הפיזיולוגי להגדיר לפני המעבר לשלב הבא של הרדמה; מאז שיטה זו מסתמכת על מנגנוני autoregulatory פיזיולוגיים, בעל?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
9.4T MRI	Varian/Bruker		Varian upgraded with Bruker console running Paravision 6.0.1 software
Air-Oxygen Mixer	Sechrist	Model 3500CP-G
Analysis of Functional NeuroImages (AFNI)	NIMH/NIH	Version AFNI_18.3.03	Freely available at: https://afni.nimh.nih.gov/
Animal Cradle	RAPID Biomedical	LHRXGS-00563	rat holder with bite bar, nose cone and ear bars
Animal Physiology Monitoring & Gating System	SAII	Model 1025	MR-compatible system including oxygen saturation, temperature, respiration and fiber optic pulse oximetry add-on
Antisedan (atipamezole hydrochloride)	Patterson Veterinary	07-867-7097	Zoetis, Manufacturer Item #10000449
Ceramic MRI-Safe Scissors	MRIequip.com	MT-6003
Clippers	Patterson Veterinary	07-882-1032	Wahl touch-up trimmer combo kit, Manufacturer Item #09990-1201
Dexmedesed (dexmedetomidine hydrochloride)	Patterson Veterinary	07-893-1801	Dechra Veterinary Products, Manufacturer Item#17033-005-10
Digital Rectal Thermometer Covers	Medline	MDS9608
FMRIB Software Library	FMRIB	MELODIC Version 3.15	Freely available at: https://fsl.fmrib.ox.ac.uk/fsl/fslwiki
Heating Pad	Cara Inc.	Model 50
Hemostat forceps, straight	Kent Scientific	INS750451-2
Isoflurane	Patterson Veterinary	07-893-1389	Patterson Private Label, Manufacturer Item #14043-0704-06
Isoflurane Vaporizer	VetEquip Inc.	911103
Lab Tape, 3/4"	VWR International	89097-990
Needles, 23 gauge	BD	305145	plastic hub removed
Parafilm Laboratory Film	Patterson Veterinary	07-893-0260	Medline Industries Inc., Manufacturer Item #HSFHS234526A
Planar Surface Coil	Bruker	T12609	2cm
Polyethylene Tubing	Braintree Scientific	PE50 50FT	0.023" (inner diameter), 0.038" (outer diameter)
Puralube Ophthalmic Ointment	Patterson Veterinary	07-888-2572	Dechra Veterinary Products, Manufacturer Item #211-38
Sprague Dawley Rats	Charles River	400 SAS SD
Sterile 0.9% Saline Solution	Patterson Veterinary	07-892-4348	Aspen Vet, Manufacturer Item #14208186
Sterile Alcohol Prep Pads	Medline	MDS090735
Surgical Tape, 1" (3M Durapore)	Medline	MMM15381Z	3M Healthcare, "wide medical tape"
Surgical White Paper Tape, 1/2" (3M Micropore)	Medline	MMM15300	3M Healthcare
Syringes, 1 mL w/ 25 gauge needle	BD	309626
Syringes, 3 mL	BD	309657
Vented induction and scavenging system	VetEquip Inc.	942102	2 liter induction chamber with active scavenging
		411724	omega flowmeter
		931600	scavenging cube, "vacuum"
		921616	nose cone, non-rebreathing