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要約

本プロトコルは、低用量のイソフルランを用いたラットから安定した安静状態機能的磁気共鳴画像法(rs−fMRI)データを得るための方法を、低用量デクスメデトミジンと組み合わせて説明する。

要約

安静状態の機能的磁気共鳴画像法(rs-fMRI)は、休息、非タスク状態で脳機能を研究するためにますます一般的な方法となっています。本プロトコルは、rs-fMRIデータを得るための前臨床生存法を記述する。低用量イソフルランとα 2 アドレナリン受容体アゴニストデキスメデトミジンの連続注入を組み合わせることで、脳ネットワーク機能を維持しながら安定した高品質のデータ取得のための堅牢なオプションを提供します。さらに、この手順は、ラットの自然呼吸およびほぼ正常な生理学を可能にする。追加のイメージングシーケンスは、この方法を使用して最大5時間の麻酔安定性を有する実験プロトコルを作成する安静状態取得と組み合わせることができます。このプロトコルは、装置の設定、麻酔の4つの異なる段階におけるラット生理学のモニタリング、静止状態スキャンの取得、データの品質評価、動物の回復、および後処理データ分析の簡単な議論を記述する。このプロトコルは、休息中に発生する結果として生じる脳ネットワークの変化を明らかにするために、臨床前げっ歯類モデルの多種多様にわたって使用することができます。

概要

安静状態機能磁気共鳴画像法(rs-fMRI)は、脳が安静で特定のタスクに従事していない場合の血中酸素レベル依存性(BOLD)シグナルの尺度である。これらの信号は、脳領域間の相関関係を測定して、ニューラルネットワーク内の機能的な接続性を決定するために使用することができます。rs-fMRIは、その非侵襲性と患者の必要な労力の少ない(タスクベースのfMRIと比較して)のために臨床研究で広く使用され、多様な患者集団に最適である1。

技術の進歩により、rs-fMRIはげっ歯類モデルで使用できるように適応し、疾患状態の基礎となるメカニズムを明らかにしました(レビューについては、参照2 を参照)。疾患またはノックアウトモデルを含む前臨床動物モデルは、ヒトでは適用されない広範な実験的操作を可能にし、また研究は、実験をさらに強化するために事後分析サンプルを利用することもできる2。それにもかかわらず、動きを制限することとストレスを軽減することの両方の困難のために、げっ歯類のMRI獲得は伝統的に麻酔下で行われる。麻酔薬は、それらの薬物動態、薬力学、および分子標的に応じて、脳血流、脳代謝に影響を及ぼし、神経血管結合経路に影響を与える可能性がある。

神経血管結合と脳ネットワーク機能3、4、5、6、7、8を維持する麻酔プロトコルを開発するための多くの努力がありました。我々は以前に、α 2アドレナリン受容体アゴニストデクスメデトミジン9の低用量と一緒にイソフルランの低用量を適用する麻酔療法を報告した。この麻酔法の下でラットは、確立された投影経路(腹側および腹腔視床核、一次および二次体性体性感覚皮質)と一致する領域におけるウィスカー刺激に対する堅牢なBOLD応答を示した。デフォルトモードネットワーク10、11およびsalienceネットワーク12を含む大規模な休止状態の脳ネットワークも一貫して検出されている。さらに、この麻酔プロトコルは、同じ動物に繰り返しイメージングを可能にし、これは疾患の進行と実験操作の効果を縦方向に監視するために重要である。

本研究では、実験のセットアップ、動物の調製、および生理学的モニタリング手順を詳述する。特に、各段階における特定の麻酔段階とスキャンの取得について述べています。データ品質は、各休止状態スキャンに従って評価されます。また、スキャン後の分析の概要も説明します。ラットでrs-fMRIを使用する可能性を明らかにすることに興味を持っている研究所は、このプロトコルが有用であることがわかります。

プロトコル

すべての実験は9.4 T MRIスキャナーで行われ、ダートマス大学の制度的動物ケアと使用委員会によって承認されました。ビデオや下の図で使用されている動物を記録し、表示するために追加の承認を得ました。

1. スキャン前の準備

  1. 皮下注入ライン
    1. そのパッケージから23G針を部分的に取り除き、針点が無菌のままになるようにします。
    2. 針のハブをしっかりと保持し、カミソリの刃を使用して、ハブと出会う針シャフトをスコアリングします。
    3. スコアリングの真下のシャフトの周りに針ホルダーをクランプし、ハブからシャフトをそっと壊します。
    4. 薬物ポンプからマグネットボア内の動物まで伸びるのに十分なライン長さで、以前に殺菌されたPE50ラインに針シャフト(鈍い端)の1/3を挿入します。
  2. デキセメデトミジンとアティパメゾールの希釈
    1. 透明で無菌のガラス瓶に9.5mLの無菌生理食塩水を混合した0.5mg/mLストック0.5 mLを使用して、希釈デックスメデトミジン塩酸塩の溶液を調製します(希釈濃度= 0.025 mg/mL)。
    2. 透明で無菌のガラス瓶に9.9mLの無菌生理食塩水を混合した5mg/mLストックの0.1 mLを使用して、希釈されたアティパメゾールの溶液を調製します(希釈濃度= 0.05 mg/mL)。
  3. スキャンパラメータ
    1. 表 1に示すパラメーターを使用して、スキャン シーケンスを準備します。

2. 第1相麻酔:動物の誘導と準備

  1. セットアップ
    1. 酸素およびエアミキサー、加熱パッド、アクティブ清掃システムなど、すべての機器がオンで、正常に動作していることを確認します( 図1を参照)。
    2. 加熱システムの温度設定ポイントを37.5 °Cに設定します。
  2. 動物誘導
    1. 誘導室に動物(90日齢、雄のスプレイグ・ドーリーラット)を入れ、30%酸素濃縮空気中の2.5%イゾフルランで麻酔を誘発する。
      注:動物の年齢と男女の広い範囲を使用することができます。
    2. 動物が麻酔されたら、チャンバーから取り出し、動物の重量を量り、準備スペースの加熱パッドの鼻コーン(2.5%イオブルラン)に置きます。
  3. 動物の準備
    1. 乾燥を防ぐために、眼用潤滑軟膏を各目に塗布してください。
    2. つま先ピンチ応答の欠如によって麻酔の深さを確認します。
    3. バリカンを使用して、動物の背中の下腰部領域(すなわち、尾の真上)の2インチ2インチ正方形の領域を剃ります。
    4. 腹腔内注射(例えば、300gラットは0.18mLを受け取る)を25G針を用いて腹部の右下象限に0.015mg/kgのデキセメデトミジン溶液を投与する。
    5. 準備スペースから動物のクレードルへのイオブルランの流れを切り替える。
    6. 動物の揺りかごに動物を移動します。ラットの前歯をしっかりと噛み付くバーに入れます。鼻の上に鼻コーンを押して、しっかりとフィットするようにします。
      注:鼻コーンが下顎を覆っていない場合は、パラフィンフィルムを使用して顎を静かに閉じ、鼻コーンの周りを密閉します。
    7. 呼吸パッドをリブケージの下のラットの腹部の下に置き、呼吸波形が呼吸の中心となる深いトラフを示すまで再配置する( 図2の呼吸波形を参照)。
    8. 生理学のモニタリングソフトウェアを使用して、動物の呼吸を監視します。呼吸が40回/分未満の場合、麻酔の次の段階に移行します (bpm; デクスメデトミジン注射後約5分).

3. 第2相麻酔:動物のセットアップ

  1. 耳の棒を外耳道に入れ、動物の揺りかごの中でラットの頭部を安定させる。一度配置したら、一口バーを前方に引っ張り、頭が動かないことを確認します。必要に応じて、ノーズコーンとパラフィンフィルムを再調整します( 図3aを参照)。
  2. 温度プローブを、あらかじめ潤滑された使い捨てプローブカバーに挿入します。温度プローブを約1/2インチの位置に静かに挿入し、医療テープで尾部のベースにテープで貼ります。
  3. パルスオキシメータクリップを後足の中足領域に置き、光源が足の底(手のひら)に点灯していることを確認します。
    メモ:クリップの回転は信号に影響を与える可能性があります。したがって、足とクリップを直立に保つホルダーを作成すると、安定性が向上します。また、ラットが常温になるまで、酸素飽和度が低い(<95%)ことに注意してください。
  4. ラットの体重を使用して、デキスメデトミジンの0.015 mg/kg/hを排出する注入速度を計算します(300グラムのラットは0.18 mL/hを受け取ります)。
  5. 薬剤ポンプを設定して、計算された注入速度を排出します。
  6. 3 mL シリンジに滅菌、希釈デキスメデトミジン溶液を充填し、滅菌注入ラインのオープンエンドに針の先端を挿入します(薬物ポンプから動物のクレードルまで、以前に取り付けられた皮下注射針で伸びる)。ラインを充填し、薬物ポンプの注射器ホルダーに注射器を固定します。
  7. プランジャーに触れるまでプッシャーブロックを前方に移動し、薬物を針で排出し、注入ラインが完全に満たされていることを確認します。
  8. アルコール拭き取りを使用して、剃った部分をきれいにして、迷子の髪を取り除きます。
  9. 尻尾のベースの上に約 2 本の指幅の皮膚をつまみます。注入線の針の1/3をテントの皮膚に挿入します。
  10. 3インチの広い医療テープで針を皮膚に固定します。第1の上に2枚目の広い医療テープを置き、ラットを横切り、動物の揺りかごの両側に取り付けた( 図4参照)。
    注:強磁性針がスキャン中の動きを防ぐために十分に固定されている重要です。
  11. 皮下デクスメデトミジンの注入を開始します。.
  12. ラットの鼻の橋の上にガーゼを置き、コイルのレベルサーフェスを作成します。MRI信号を妨げない紙テープを使用して、コイルをラットの頭に固定し、脳の上に中央に配置します(図3b,cを参照)。
  13. 動物のクレードル内のすべてのラインとケーブルをラボテープで固定し、すべての生理学的信号が安定しているかどうかを確認します( 図2を参照)。
  14. 動物の上にペーパータオルを置き、実験室のテープで動物の揺りかごに固定します。空気加熱システムを使用する場合は、プラスチックシートをクレードル全体に巻き付け、暖かい空気を含めます。
  15. 動物を穴に移動し、磁石を調整します。

4. 第3相麻酔:解剖学的スキャン獲得

  1. イオブルランを1.5%に減らし、呼吸を約45〜50bpmに着実に増加させます。解剖学的スキャンの間、このレベルに留まる。
  2. FLASH ローカライザースキャンを使用して、脳が磁石アイソセンターに合っていることを確認します (図 5a)。動物の位置を変更し、必要に応じて繰り返します。
  3. 高分解能の RARE ローカライザースキャンを実行し、このスキャン出力を使用して、脳を中心とした 15 個の矢状スライスを整列させます (左から右、図 5b)。
  4. 中央の矢状スライスを使用して、中心軸スライスを、暗いスポットとして表示される前部コミュシュアのデシテーションに合わせます(図5c)。後で休止状態スキャンで使用するスライス オフセットに注意してください。
  5. フラッシュとRAREの両方の軸プロトコルを使用して23のスライスを取得し、スキャン後の分析中に共通空間への登録を支援します。
  6. プレスシーケンスを使用して脳全体を横切ってシム。

5. フェーズ 4: 休止状態のスキャン取得

  1. 解剖学的スキャンを完了した後、イソフルランを0.5%から0.75%に減らし、動物の呼吸が毎分60〜65呼吸になるように調整します。安定性を確保するために、休止状態のスキャンを開始する前に、少なくとも10分間このレベルに留まる。
  2. 生理学が安定している場合(呼吸範囲は、あえぎや凹凸のない60-75 bpm、コア体温は37.5±1.0°C、酸素飽和度は95%以上)、解剖軸シリーズと同じスライスオフセットを使用して15スライスEPIスキャンを取得します。
  3. 各休止状態スキャンが完了したら、独立したコンポーネント分析 (ICA) を使用して品質を確認し、データを空間コンポーネントと時間コンポーネントに分解します。
  4. 少なくとも3つの高品質な休止状態スキャンを取得します。

6. スキャン後の回復

  1. スキャンが完了したら、イゾフルランを2%に増やし、皮下デクスメデトミジンの注入を停止します。
  2. マグネットボアから動物のクレードルを取り出し、動物をアンラップし、耳棒、温度プローブ、パルスオキシメータクリップ、およびデキスメデトミジン針を取り除きます。
  3. 25G針の1mLシリンジを使用して、希釈したアティパメゾール溶液を0.015mg/kgをラットの後ろ脚筋に注入します(すなわち、300gラットは0.09mLを受け取ります)。
  4. ラットを暖房パッドの上のホームケージに戻し、動物が歩行するまで監視します。

結果

各休止状態スキャンに続いて、独立したコンポーネント分析(ICA; 補助ファイルに含まれるスクリプトの例)を使用して安定性が評価されます。 図 6 は、休止状態スキャンからのコンポーネント出力の例を示しています。 図6a は、安定性の高いスキャンからの信号成分を示す。空間的には、コンポーネントの地域性が高いことに注意し?...

ディスカッション

動物の安定性は、物理的にも生理的にも、高品質の安静状態データを得るための鍵である。このプロトコルは、麻酔の4つの異なる段階を経ることによって安定性を達成する。動物は麻酔の次の段階に移動する前に設定された生理学的閾値を満たしていることが不可欠です;この方法は生理学的な自己調節機構に依存するので、個々の動物は麻酔段階でわずかに異なる時間を必要とするかもし?...

開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

この研究は、国立衛生研究所(NIH)の国立薬物乱用研究所(NIDA)からの資金提供によって支えられました[DJW、 EDKSとEMBはグラントR21DA044501によってアラン・I・グリーンに授与され、DJWはグラントT32DA037202によってアラン・J・バドニーに支えられ、国立アルコール乱用・アルコール依存症研究所(NIAAA)[グラントF31AA028413]エミリー・D・K.サリバンに支えられました。ダートマスのレイモンド・ソベル精神医学教授として、アラン・I・グリーンの寄付基金を通じて追加の支援が行われました。

ハンビン・ルーは、国立薬物乱用研究所の壁内研究プログラム(NIH)の支援を受けています。

著者たちは故アラン・I・グリーンを認め、感謝したいと考えております。共生障害の分野に対する彼の揺るぎない献身は、著者間のコラボレーションを確立するのに役立ちました。私たちは、彼の指導と指導に感謝します。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
9.4T MRIVarian/BrukerVarian upgraded with Bruker console running Paravision 6.0.1 software
Air-Oxygen MixerSechristModel 3500CP-G
Analysis of Functional NeuroImages (AFNI)NIMH/NIHVersion AFNI_18.3.03Freely available at: https://afni.nimh.nih.gov/
Animal CradleRAPID BiomedicalLHRXGS-00563rat holder with bite bar, nose cone and ear bars
Animal Physiology Monitoring & Gating SystemSAIIModel 1025MR-compatible system including oxygen saturation, temperature, respiration and fiber optic pulse oximetry add-on
Antisedan (atipamezole hydrochloride)Patterson Veterinary07-867-7097Zoetis, Manufacturer Item #10000449
Ceramic MRI-Safe ScissorsMRIequip.comMT-6003
ClippersPatterson Veterinary07-882-1032Wahl touch-up trimmer combo kit, Manufacturer Item #09990-1201
Dexmedesed (dexmedetomidine hydrochloride)Patterson Veterinary07-893-1801Dechra Veterinary Products, Manufacturer Item#17033-005-10
Digital Rectal Thermometer CoversMedlineMDS9608
FMRIB Software LibraryFMRIBMELODIC Version 3.15Freely available at: https://fsl.fmrib.ox.ac.uk/fsl/fslwiki
Heating PadCara Inc.Model 50
Hemostat forceps, straightKent ScientificINS750451-2
IsofluranePatterson Veterinary07-893-1389Patterson Private Label, Manufacturer Item #14043-0704-06
Isoflurane VaporizerVetEquip Inc.911103
Lab Tape, 3/4"VWR International89097-990
Needles, 23 gaugeBD305145plastic hub removed
Parafilm Laboratory FilmPatterson Veterinary07-893-0260Medline Industries Inc., Manufacturer Item #HSFHS234526A
Planar Surface CoilBrukerT126092cm
Polyethylene TubingBraintree ScientificPE50 50FT0.023" (inner diameter), 0.038" (outer diameter)
Puralube Ophthalmic OintmentPatterson Veterinary07-888-2572Dechra Veterinary Products, Manufacturer Item #211-38
Sprague Dawley RatsCharles River400 SAS SD
Sterile 0.9% Saline SolutionPatterson Veterinary07-892-4348Aspen Vet, Manufacturer Item #14208186
Sterile Alcohol Prep PadsMedlineMDS090735
Surgical Tape, 1" (3M Durapore)MedlineMMM15381Z3M Healthcare, "wide medical tape"
Surgical White Paper Tape, 1/2" (3M Micropore)MedlineMMM153003M Healthcare
Syringes, 1 mL w/ 25 gauge needleBD309626
Syringes, 3 mLBD309657
Vented induction and scavenging systemVetEquip Inc.9421022 liter induction chamber with active scavenging
411724omega flowmeter
931600scavenging cube, "vacuum"
921616nose cone, non-rebreathing

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