쥐에서 휴식 상태 기능 자기 공명 이미징 데이터 획득

요약

본 프로토콜은 저용량 디졸루란을 사용하여 낮은 용량의 이소플루란을 사용하여 쥐로부터 안정적인 휴식 상태 기능성 자기 공명 영상(rs-fMRI) 데이터를 낮은 용량 덱스메데토미딘과 결합하여 얻는 방법을 설명합니다.

초록

휴식 상태 기능성 자기 공명 영상 (rs-fMRI)은 휴식, 비 작업 상태에서 뇌 기능을 연구하는 점점 더 인기있는 방법이되고있다. 이 프로토콜은 rs-fMRI 데이터를 얻기 위한 전임상 생존 방법을 설명합니다. 저용량 이소플루란과 α₂ 아드레너기용량 수용체 작용제 덱스메데토미딘의 지속적인 주입을 결합하면 뇌 네트워크 기능을 유지하면서 안정적이고 고품질의 데이터 수집을 위한 강력한 옵션을 제공한다. 또한,이 절차는 쥐에서 자발적인 호흡과 거의 정상 생리학을 허용합니다. 추가 이미징 서열은 휴식 상태 획득과 결합하여 이 방법을 사용하여 최대 5h의 마취 안정성을 가진 실험 프로토콜을 생성할 수 있습니다. 이 프로토콜은 장비 의 설정, 마취의 네 가지 단계 동안 쥐 생리학의 모니터링, 휴식 상태 스캔의 수집, 데이터의 품질 평가, 동물의 복구, 및 후 처리 데이터 분석에 대한 간단한 논의를 설명합니다. 이 프로토콜은 다양한 전임상 설치류 모델에서 사용할 수 있어, 이로 인해 발생하는 뇌 네트워크 변화가 미뤄질 수 있다.

서문

휴식 상태 기능성 자기 공명 영상 (rs-fMRI)은 뇌가 쉬고 특정 작업에 관여하지 않을 때 혈액 산소 수준 의존성 (BOLD) 신호의 척도입니다. 이러한 신호는 신경망 내의 기능적 연결을 결정하기 위해 뇌 영역 간의 상관 관계를 측정하는 데 사용할 수 있습니다. rs-fMRI는 비침습성 및 환자(작업 기반 fMRI와 비교하여)에 요구되는 저량의 노력으로 인해 임상 연구에서 널리 사용되어 다양한 환자 집단에 최적입니다^1.

기술 발전은 rs-fMRI가 설치류 모델에서 사용하기 위해 적응하여 질병 상태의 기전을 발견할 수 있게 했습니다(검토를 위한 참조² 참조). 질병 또는 녹아웃 모델을 포함한 전임상 동물 모델은 인간에게 적용되지 않는 광범위한 실험 조작을 허용하며, 스터디를 사용하여 실험^2를더욱 강화할 수 있다. 그럼에도 불구하고 운동 제한과 스트레스 완화의 어려움으로 인해 설치류의 MRI 인수는 전통적으로 마취 하에 수행됩니다. 마취제는 약동학, 약역학 및 분자 표적에 따라 뇌 혈류, 뇌 대사 에 영향을 미치고 잠재적으로 신경 혈관 커플링 경로에 영향을 미칩니다.

신경혈관 커플링 및 뇌 네트워크 기능^{3,4,5,6,7,8을}보존하는 마취^{프로토콜을}개발하기 위한 수많은 노력이 있었습니다. 우리는 이전에 α₂ 부력 수용체 고뇌의 낮은 복용량과 함께 이소플루란의 낮은 복용량을 적용 마취 정권을보고^9. 마취의 이 방법의 밑에 쥐는 확립된 투영 통로와 일치하는 지구에 있는 수염 자극에 강력한 BOLD 반응을 전시했습니다 (ventrolateral 및 ventromedial 탈라믹 핵, 1 차 및 이차 색소 감각 피질); 기본 모드^{네트워크(10,11)} 및 현저네트워크(12)를 포함한 대규모 휴게상태 뇌네트워크도 일관되게 검출되었다. 더욱이, 이 마취 프로토콜은 질병 진행 및 실험 조작의 효력을 세로로 감시하기 위한 중요한 동일 동물에 반복적인 화상 진찰을 허용합니다.

본 연구에서는 실험적 설정, 동물 제제 및 생리적 모니터링 절차를 자세히 설명합니다. 특히, 각 단계에서 특정 마취 단계 및 스캔 획득에 대해 설명합니다. 데이터 품질은 각 휴식 상태 검사 에 따라 평가됩니다. 사후 검사 분석에 대한 간략한 요약도 토론에 포함되어 있습니다. 쥐에서 rs-fMRI를 사용 하 여의 잠재력을 발견에 관심이 실험실이 프로토콜 유용 찾을 수 있습니다.

프로토콜

모든 실험은 9.4 T MRI 스캐너에서 수행되었으며 다트머스 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았습니다. 추가 승인은 아래의 비디오 및 그림에 사용되는 동물을 기록하고 보여주기 위해 얻어졌습니다.

1. 스캔 하기 전에 준비

1. 피하 주입 라인
   1. 바늘 점이 멸균 상태로 유지되도록 패키지에서 23 G 바늘을 부분적으로 제거합니다.
   2. 바늘의 허브를 단단히 잡고 면도날을 사용하여 허브와 만나는 바늘 샤프트를 득점합니다.
   3. 바늘 홀더를 채점 바로 아래 샤프트 주위에 고정시키고 허브에서 샤프트를 부드럽게 부러뜨린다.
   4. 바늘 샤프트 (무딘 끝)의 1/3을 이전에 멸균 된 PE50 라인에 삽입하여 약물 펌프에서 자석 보어 내부의 동물로 확장하십시오.
2. 덱스메디토미딘과 아티파메졸의 희석
   1. 투명한 멸균 유리 병에 멸균 식염수의 9.5mL와 혼합된 0.5 mg/mL 재고0.5mL의 0.5mL를 사용하여 희석 덱스메디틴 염산염의 용액을 준비한다(희석 농도 = 0.025 mg/mL).
   2. 투명한 멸균 유리 병에 멸균 식염수 의 9.9 mL와 혼합 5 mg / mL 재고의 0.1 mL을 사용하여 희석 atipamezole의 용액을 준비 (희석 농도 = 0.05 mg /mL).
3. 매개 변수 스캔
   1. 표 1에 제시된 매개 변수를 사용하여 스캔 시퀀스를 준비합니다.

2. 1 단계 마취 : 동물 유도 및 준비

1. 설치
   1. 산소 및 공기 믹서, 가열 패드 및 활성 청소 시스템을 포함하여 모든 장비가 제대로 작동하는지 확인하십시오 (그림 1참조).
   2. 가열 시스템의 온도 세트 점을 37.5 °C로 설정합니다.
2. 동물 유도
   1. 유도 챔버에 동물 (90 일 된 남성 스프라그 Dawley 쥐)을 배치하고 30 % 산소가 풍부한 공기에 2.5 %의 이소플루란으로 마취를 유도합니다.
      참고: 다양한 동물 연령과 남녀 를 모두 사용할 수 있습니다.
   2. 동물이 마취되면 챔버에서 제거하고 동물의 무게를 측정하고 준비 공간에서 가열 패드에 코 콘 (2.5 %의 이소플루란)에 놓습니다.
3. 동물 제제
   1. 건조를 방지하기 위해 각 눈에 안과 윤활 연고를 적용합니다.
   2. 발가락 핀치 응답의 부족에 의해 마취의 깊이를 확인합니다.
   3. 클리퍼를 사용하여 동물의 뒤쪽 의 아래 요추 부위에 2"by 2" 평방 영역(즉, 꼬리 바로 위에)을 면도합니다.
   4. 관전(i.p.) 주사(즉, 300g 쥐는 0.18mL)를 25G 바늘을 사용하여 복부의 오른쪽 하단사분면으로 0.015 mg/kg의 덱스메디토마이딘 용액을 투여한다.
   5. 스위치 이소플루란은 준비 공간에서 동물 요람으로 흐르고 있습니다.
   6. 동물을 동물 요람으로 옮킨다. 쥐의 앞니를 물린 바에 단단히 넣습니다. 코 콘을 코 위로 밀어 단단히 맞습니다.
      참고: 코 콘이 아래턱을 덮지 않으면 파라핀 필름을 사용하여 턱을 부드럽게 닫고 코 콘 주위에 밀봉합니다.
   7. 호흡 패드를 흉골 아래 쥐의 복부 아래에 배치하고 호흡 파형이 각 호흡을 중심으로 깊은 트로프를 보일 때까지 재배치합니다(도 2의호흡 파형 참조).
   8. 생리 모니터링 소프트웨어를 사용하여 동물의 호흡을 모니터링합니다. 호흡이 40 호흡 / 분 미만일 때 마취의 다음 단계로 이동 (bpm; 약 5 덱스메디토미딘 주입 후 분).

3. 단계 2 마취 : 동물 설정

1. 외이도에 이어바를 삽입하여 동물 요람에서 쥐의 머리를 안정시습니다. 일단 배치, 물린 바에 앞으로 당겨 머리가 움직이지 않는 지 확인합니다. 필요에 따라 코 콘과 파라핀 필름을 다시 조정합니다(그림 3a참조).
2. 온도 프로브를 윤활, 일회용 프로브 커버에 삽입합니다. 약 1/2"의 온도 프로브를 직장에 부드럽게 삽입하고 의료 용 테이프로 꼬리 의 바닥에 테이프를 넣습니다.
3. 펄스 산소계 클립을 뒷발의 중족골 부위에 놓고 광원이 발 바닥(손바닥)에 있는지 확인합니다.
   참고: 클립의 회전은 신호에 영향을 줄 수 있습니다. 따라서 발과 클립을 똑바로 세워야 하는 홀더를 만들면 안정성이 향상됩니다. 또한 쥐가 정상 체온에 있을 때까지 산소 포화도가 낮을 수 있습니다(<95%).
4. 쥐의 무게를 사용하여 덱스메데토미딘의 0.015 mg/kg/h를 배출하기 위해 주입 속도를 계산합니다(300 g 쥐는 0.18 mL/h를 받습니다).
5. 계산된 주입 속도를 배출하기 위해 약물 펌프를 설정합니다.
6. 멸균, 희석 덱스메디틴 용액으로 3mL 주사기를 채우고, 바늘 끝을 멸균 주입 라인의 열린 끝에 삽입합니다(약물 펌프에서 동물 요람으로 확장하여 이전에 부착된 피하 바늘이 부착된 동물 요람으로 확장). 라인을 채우고 약물 펌프의 주사기 홀더에 주사기를 고정하십시오.
7. 푸셔 블록을 플런저에 닿을 때까지 앞으로 이동하고, 약물은 바늘에서 추방되어 주입 라인이 완전히 채워지도록 합니다.
8. 알코올 닦아를 사용하여 면도 부위를 청소하여 길 잃은 머리카락을 제거하십시오.
9. 꼬리 의 베이스 위에 약 두 손가락 너비의 피부를 꼬집습니다. 주입 라인 바늘의 1/3을 텐트 피부에 삽입합니다.
10. 3인치 의 넓은 의료 테이프로 피부에 바늘을 고정하십시오. 첫 번째 에 넓은 의료 테이프의 두 번째 조각을 배치, 쥐를 가로 질러, 동물 요람의 양쪽에 부착 (그림 4참조).
    참고: 강자성 바늘이 스캔 중에 움직임을 방지하기 위해 잘 고정되어 있는 것이 매우 중요합니다.
11. 피하 덱스메디틴의 주입을 시작합니다.
12. 쥐의 코 다리에 거즈 조각을 놓고 코일에 대한 수평 표면을 만듭니다. MRI 신호를 방해하지 않는 종이 테이프를 사용하여 쥐의 머리에 코일을 고정하여 뇌를 중심으로 합니다(그림 3b,c참조).
13. 실험실 테이프로 동물 요람 내의 모든 라인과 케이블을 보호하고 모든 생리 신호가 안정되어 있는지 확인합니다(그림 2참조).
14. 동물 위에 종이 타월을 놓고 실험실 테이프로 동물 요람에 고정하십시오. 공기 가열 시스템을 사용하는 경우, 따뜻한 공기를 포함하도록 전체 요람 주위에 플라스틱 시트를 감쌉니다.
15. 동물을 보어로 옮기고 자석을 조정합니다.

4. 단계 3 마취 : 해부학 검사 취득

1. 이소플루란을 1.5%로 줄이면 호흡이 약 45-50 bpm으로 꾸준히 증가합니다. 해부학 적 스캐닝 기간 동안이 수준에 남아.
2. FLASH 국소 스캔을 사용하여 뇌가 자석 등각센터(도5a)와정렬되도록 합니다. 동물을 재배치하고 필요한 경우 반복합니다.
3. 더 높은 해상도의 RARE localizer 검사를 실행하고 이 스캔 출력을 사용하여 뇌를 가로질러 15개의 시상 슬라이스를 정렬합니다(왼쪽에서 오른쪽으로, 그림 5b).
4. 중간 처탈 슬라이스를 사용하여, 어두운 반점(도 5c)으로나타나는 전방 쉼표의 감도에 중앙 축축 슬라이스를 정렬합니다. 나머지 상태 검사의 나중에 사용할 슬라이스 오프셋을 기록합니다.
5. 플래시 및 희귀 축 프로토콜을 사용하여 23개의 슬라이스를 획득하여 스캔 후 분석 중에 공통 공간에 등록할 수 있습니다.
6. 심은 프레스 시퀀스를 사용하여 뇌 전체를 가로질러.

5. 4 단계: 휴식 상태 스캔 획득

1. 해부학 검사를 완료한 후 이소플루란을 0.5%에서 0.75%로 줄여 동물의 호흡이 분당 60-65호흡이 되도록 조정합니다. 안정성을 보장하기 위해 휴식 상태 스캐닝을 시작하기 전에 최소 10 분 동안이 수준에 머물러보십시오.
2. 생리학이 안정되면(호흡 범위는 60-75 bpm이며, 심체 온도는 37.5 ± 1.0°C이고 산소 포화도는 95% 이상), 해부학축 축계와 동일한 슬라이스 오프셋을 사용하여 15슬라이스 EPI 스캔을 획득한다.
3. 각 휴식 상태 검사가 완료되면 ICA(독립적인 구성 요소 분석)를 사용하여 품질을 확인하여 데이터를 공간 및 측두구성요소로 분해합니다.
4. 적어도 세 개의 고품질 휴식 상태 스캔을 가져옵니다.

6. 스캔 후 복구

1. 스캐닝이 완료되면 이소플루란을 2%로 늘리고 피하 덱스메디토미딘 주입을 중단합니다.
2. 자석 구멍에서 동물 요람을 제거하고, 동물을 풀고, 이어 바, 온도 프로브, 펄스 산소계 클립 및 덱스메디틴 바늘을 제거합니다.
3. 25G 바늘로 1mL 주사기를 사용하여 희석 된 아티파메졸 용액의 0.015 mg /kg을 쥐의 뒷다리 근육에 주입하십시오 (즉, 300 g 쥐는 0.09 mL을 받게됩니다).
4. 쥐를 가열 패드 위에 다시 집 케이지에 넣고 동물이 외래가 될 때까지 모니터링하십시오.

결과

각 휴게 상태 검사에 따라 독립적인 구성 요소 분석(ICA; 보충 파일에 포함된 예제 스크립트)을 사용하여 안정성을 평가합니다. 그림 6은 휴게 상태 검사에서 구성 요소 출력의 예를 보여줍니다. 도 6a는 안정성이 높은 스캔으로부터 신호 성분을 나타낸다. 공간적으로 구성 요소는 높은 지역성을 가지고 있습니다. 공간 구성 요소 아래 시간 ?...

토론

동물의 안정성은 신체적, 생리적으로 고품질의 휴식 상태 데이터를 얻는 데 핵심적입니다. 이 프로토콜은 마취의 네 가지 단계를 통해 이동하여 안정성을 달성한다. 동물이 마취의 다음 단계로 이동하기 전에 설정 된 생리적 임계 값을 충족하는 것이 필수적이다; 이 방법은 생리적 자동 조절 메커니즘에 의존하기 때문에 개별 동물은 각 마취 단계에서 약간 다른 양의 시간을 필요로 할 수 있습니?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
9.4T MRI	Varian/Bruker		Varian upgraded with Bruker console running Paravision 6.0.1 software
Air-Oxygen Mixer	Sechrist	Model 3500CP-G
Analysis of Functional NeuroImages (AFNI)	NIMH/NIH	Version AFNI_18.3.03	Freely available at: https://afni.nimh.nih.gov/
Animal Cradle	RAPID Biomedical	LHRXGS-00563	rat holder with bite bar, nose cone and ear bars
Animal Physiology Monitoring & Gating System	SAII	Model 1025	MR-compatible system including oxygen saturation, temperature, respiration and fiber optic pulse oximetry add-on
Antisedan (atipamezole hydrochloride)	Patterson Veterinary	07-867-7097	Zoetis, Manufacturer Item #10000449
Ceramic MRI-Safe Scissors	MRIequip.com	MT-6003
Clippers	Patterson Veterinary	07-882-1032	Wahl touch-up trimmer combo kit, Manufacturer Item #09990-1201
Dexmedesed (dexmedetomidine hydrochloride)	Patterson Veterinary	07-893-1801	Dechra Veterinary Products, Manufacturer Item#17033-005-10
Digital Rectal Thermometer Covers	Medline	MDS9608
FMRIB Software Library	FMRIB	MELODIC Version 3.15	Freely available at: https://fsl.fmrib.ox.ac.uk/fsl/fslwiki
Heating Pad	Cara Inc.	Model 50
Hemostat forceps, straight	Kent Scientific	INS750451-2
Isoflurane	Patterson Veterinary	07-893-1389	Patterson Private Label, Manufacturer Item #14043-0704-06
Isoflurane Vaporizer	VetEquip Inc.	911103
Lab Tape, 3/4"	VWR International	89097-990
Needles, 23 gauge	BD	305145	plastic hub removed
Parafilm Laboratory Film	Patterson Veterinary	07-893-0260	Medline Industries Inc., Manufacturer Item #HSFHS234526A
Planar Surface Coil	Bruker	T12609	2cm
Polyethylene Tubing	Braintree Scientific	PE50 50FT	0.023" (inner diameter), 0.038" (outer diameter)
Puralube Ophthalmic Ointment	Patterson Veterinary	07-888-2572	Dechra Veterinary Products, Manufacturer Item #211-38
Sprague Dawley Rats	Charles River	400 SAS SD
Sterile 0.9% Saline Solution	Patterson Veterinary	07-892-4348	Aspen Vet, Manufacturer Item #14208186
Sterile Alcohol Prep Pads	Medline	MDS090735
Surgical Tape, 1" (3M Durapore)	Medline	MMM15381Z	3M Healthcare, "wide medical tape"
Surgical White Paper Tape, 1/2" (3M Micropore)	Medline	MMM15300	3M Healthcare
Syringes, 1 mL w/ 25 gauge needle	BD	309626
Syringes, 3 mL	BD	309657
Vented induction and scavenging system	VetEquip Inc.	942102	2 liter induction chamber with active scavenging
		411724	omega flowmeter
		931600	scavenging cube, "vacuum"
		921616	nose cone, non-rebreathing