Aquisição de dados de ressonância magnética funcional de estado de repouso no rato

Resumo

Este protocolo descreve um método para obter dados de ressonância magnética funcional de estado de repouso estável (rs-fMRI) de um rato usando isoflurane de baixa dose em combinação com dexmedetomidina de baixa dose.

Resumo

A ressonância magnética funcional de estado de repouso (rs-fMRI) tornou-se um método cada vez mais popular para estudar a função cerebral em um estado de repouso, sem tarefa. Este protocolo descreve um método de sobrevivência pré-clínico para a obtenção de dados rs-fMRI. A combinação de isoflurano de baixa dose com infusão contínua do α₂ agonizantes agonistas receptores adrenérgicos proporcionam uma opção robusta para aquisição de dados estáveis e de alta qualidade, preservando a função da rede cerebral. Além disso, este procedimento permite a respiração espontânea e fisiologia quase normal no rato. Sequências adicionais de imagem podem ser combinadas com a aquisição de estado de repouso criando protocolos experimentais com estabilidade anestésica de até 5 h usando este método. Este protocolo descreve a instalação de equipamentos, o monitoramento da fisiologia de ratos durante quatro fases distintas da anestesia, aquisição de escaneamentos de estado de repouso, avaliação da qualidade dos dados, recuperação do animal e uma breve discussão sobre análise de dados pós-processamento. Este protocolo pode ser usado em uma grande variedade de modelos de roedores pré-clínicos para ajudar a revelar as mudanças resultantes da rede cerebral que ocorrem em repouso.

Introdução

A ressonância magnética funcional de estado de repouso (rs-fMRI) é uma medida do sinal dependente do nível de oxigênio do sangue (BOLD) quando o cérebro está em repouso e não está envolvido em nenhuma tarefa particular. Esses sinais podem ser usados para medir correlações entre regiões cerebrais para determinar a conectividade funcional dentro de redes neurais. rs-fMRI é amplamente utilizado em estudos clínicos devido à sua não invasiva e à baixa quantidade de esforço necessário aos pacientes (em comparação com a ressonância magnética baseada em tarefas) tornando-o ótimo para diversas populações de pacientes¹.

Os avanços tecnológicos permitiram que o RS-FMRI fosse adaptado para uso em modelos de roedores para descobrir mecanismos subjacentes aos estados da doença (ver referência² para revisão). Modelos de animais pré-clínicos, incluindo modelos de doenças ou nocautes, permitem uma ampla gama de manipulações experimentais não aplicáveis em humanos, e estudos também podem fazer uso de amostras post-mortem para melhorar ainda mais os experimentos². No entanto, devido à dificuldade em limitar o movimento e mitigar o estresse, a aquisição de RM em roedores é tradicionalmente realizada sob anestesia. Agentes anestésicos, dependendo de sua farmacocinética, farmacodinâmica e alvos moleculares, influenciam o fluxo sanguíneo cerebral, o metabolismo cerebral e potencialmente afetam caminhos de acoplamento neurovascular.

Houve inúmeros esforços para desenvolver protocolos anestésicos que preservam o acoplamento neurovascular e a função da rede cerebral^3,4,5,6,7,8. Relatamos anteriormente um regime anestésico que aplicava uma dose baixa de isoflurano, juntamente com uma dose baixa do α₂ receptor adrenérgico agonista dexmedetomidina⁹. Os ratos sob este método de anestesia apresentaram respostas ousadas robustas à estimulação de whisker em regiões consistentes com vias de projeção estabelecidas (núcleos talâmicos ventrolateral e ventromedial, córtex somatossensorial primário e secundário); Redes cerebrais de estado de repouso em larga escala, incluindo a rede de modo padrão^10,11 e a rede de saliência¹² também foram detectadas consistentemente. Além disso, este protocolo anestésico permite imagens repetidas no mesmo animal, o que é importante para monitorar a progressão da doença e o efeito de manipulações experimentais longitudinalmente.

No presente estudo, detalhamos os procedimentos experimentais de configuração, preparação animal e monitoramento fisiológico envolvidos. Em particular, descrevemos as fases anestésicas específicas e a aquisição de exames durante cada fase. A qualidade dos dados é avaliada após cada varredura de estado de repouso. Um breve resumo da análise pós-digitalização também está incluído na discussão. Laboratórios interessados em descobrir o potencial de uso de rs-fMRI em ratos acharão este protocolo útil.

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Protocolo

Todos os experimentos foram realizados em um scanner de ressonância magnética 9.4 T, e foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais no Dartmouth College. Foi obtida aprovação adicional para registrar e mostrar os animais utilizados no vídeo e figuras abaixo.

1. Preparações antes da digitalização

1. Linha de infusão subcutânea
   1. Remova parcialmente uma agulha de 23 G de seu pacote para que o ponto da agulha permaneça estéril.
   2. Segure firmemente o cubo da agulha e use uma lâmina de barbear para marcar o eixo da agulha onde ele encontra o cubo.
   3. Aperte um suporte de agulha ao redor do eixo diretamente abaixo da pontuação e quebre suavemente o eixo do cubo.
   4. Insira 1/3 do eixo da agulha (extremidade cega) na linha PE50 previamente esterilizada com comprimento de linha suficiente para estender da bomba de drogas até o animal dentro do furo do ímã.
2. Diluição de dexmedetomidina e atipamezole
   1. Prepare uma solução de cloridrato de dexmedetomidina diluído utilizando 0,5 mL de caldo de 0,5 mg/mL misturado com 9,5 mL de soro fisiológico estéril em uma garrafa de vidro clara e estéril (concentração diluída = 0,025 mg/mL).
   2. Prepare uma solução de atipamezole diluído utilizando 0,1 mL de estoque de 5 mg/mL misturado com 9,9 mL de soro fisiológico estéril em uma garrafa de vidro clara e estéril (concentração diluída = 0,05 mg/mL).
3. Parâmetros de digitalização
   1. Use os parâmetros apresentados na Tabela 1 para preparar sequências de varredura.

2. Anestesia da Fase 1: Indução e preparação animal

1. Configuração
   1. Certifique-se de que todos os equipamentos estão ligados e funcionando corretamente, incluindo a batedeira de oxigênio e ar, almofada de aquecimento e sistema de limpeza ativo (ver Figura 1).
   2. Defina o ponto de temperatura do sistema de aquecimento para 37,5 °C.
2. Indução animal
   1. Coloque o animal (rato Sprague Dawley, de 90 dias de idade) na câmara de indução e induza a anestesia com 2,5% de isoflurane em ar enriquecido com oxigênio.
      NOTA: Uma ampla gama de idades dos animais e ambos os sexos podem ser usados.
   2. Uma vez que o animal é anestesiado, remova-o da câmara, pese o animal e coloque-o no cone do nariz (a 2,5% isoflurane) na almofada de aquecimento no espaço de preparação.
3. Preparação animal
   1. Aplique pomada lubrificante oftálmica em cada olho para evitar a secagem.
   2. Confirme a profundidade da anestesia por falta de resposta ao dedo do dedo do dedo.
   3. Use cortadores para raspar uma área quadrada de 2" por 2" na região lombar inferior das costas do animal (ou seja, diretamente acima da cauda).
   4. Administre 0,015 mg/kg da solução dexmedetomidina com uma injeção intraperitoneal (i.p.) (por exemplo, um rato de 300 g receberia 0,18 mL) no quadrante inferior direito do abdômen usando uma agulha de 25 G.
   5. Troque o fluxo isoflurane do espaço de preparação para o berço animal.
   6. Mova o animal para o berço animal. Coloque os dentes da frente do rato firmemente sobre e dentro da barra de mordida. Empurre o cone do nariz sobre o nariz para garantir um ajuste apertado.
      NOTA: Se o cone do nariz não cobrir a mandíbula inferior, use um filme de parafina para segurar suavemente a mandíbula fechada enquanto também sela ao redor do cone do nariz.
   7. Posicione a almofada de respiração sob o abdômen do rato abaixo da caixa torácica e reforme-a até que a forma de onda de respiração mostre um cocho profundo centrado em cada respiração (veja a forma de onda de respiração na Figura 2).
   8. Monitore a respiração do animal usando o software de monitoramento da fisiologia. Mova-se para a próxima fase da anestesia quando a respiração for inferior a 40 respirações/min (bpm; aproximadamente 5 min após a injeção de dexmedetomidina).

3. Anestesia da Fase 2: Configuração animal

1. Insira barras de ouvido no canal auditivo para estabilizar a cabeça do rato no berço animal. Uma vez posicionado, puxe para a frente na barra de mordida e confirme que a cabeça não se move. Reajustar o cone do nariz e o filme de parafina conforme necessário (ver Figura 3a).
2. Insira a sonda de temperatura em uma tampa de sonda pré-lubrificada e descartável. Insira suavemente a sonda de temperatura aproximadamente 1/2" no reto e grave-a na base da cauda com fita médica.
3. Coloque o clipe do oxímetro de pulso sobre a área metatarsal do pé traseiro, garantindo que a fonte de luz esteja na parte inferior do pé (palma).
   NOTA: A rotação do clipe pode afetar o sinal; assim, criar um suporte para manter a pata e o clipe ereto levará a uma maior estabilidade. Observe também que até que o rato esteja em temperatura normal do corpo, a saturação de oxigênio pode ser baixa (<95%).
4. Use o peso do rato para calcular a taxa de infusão para ejetar 0,015 mg/kg/h de dexmedetomidina (um rato de 300 g recebe 0,18 mL/h).
5. Defina a bomba de droga para ejetar a taxa de infusão calculada.
6. Encha uma seringa de 3 mL com a solução de dexmedetomidina estéril diluída e insira a ponta da agulha na extremidade aberta da linha de infusão esterilizada (estendendo-se da bomba de drogas até o berço animal com a agulha subcutânea previamente anexada). Encha a linha e proteja a seringa no porta-ar seringa da bomba de drogas.
7. Mova o bloco de empurrador para a frente até tocar o êmbolo, e a droga é expelida na agulha, garantindo que a linha de infusão esteja completamente preenchida.
8. Usando uma limpeza de álcool, limpe a área raspada para remover qualquer cabelo perdido.
9. Aperte a pele aproximadamente duas larguras de dedos acima da base da cauda. Insira 1/3 da agulha da linha de infusão na pele de tenda.
10. Segure a agulha na pele com um pedaço de fita médica de 3". Coloque um segundo pedaço de fita médica larga sobre o primeiro, através do rato, e anexado a ambos os lados do berço animal (ver Figura 4).
    NOTA: É extremamente importante que a agulha ferromagnética esteja bem presa para evitar o movimento durante a varredura.
11. Comece a infusão de dexmedetomidina subcutânea.
12. Coloque um pedaço de gaze na ponte do nariz do rato para criar uma superfície nivelada para a bobina. Use fita de papel, que não interfere com o sinal de ressonância magnética, para fixar a bobina na cabeça do rato, centralizando-a sobre o cérebro (ver Figura 3b,c).
13. Fixar todas as linhas e cabos dentro do berço animal com fita de laboratório e verificar se todos os sinais de fisiologia estão estáveis (ver Figura 2).
14. Coloque toalhas de papel sobre o animal, prendendo-as ao berço animal com fita de laboratório. Se usar um sistema de aquecimento de ar, enrole uma folha de plástico em torno de todo o berço para conter o ar quente.
15. Mova o animal para dentro do furo e sintonize o ímã.

4. Fase 3 anestesia: Aquisição de varredura anatômica

1. Reduza o isoflurane para 1,5%, resultando em um aumento constante da respiração para aproximadamente 45-50 bpm. Permaneça neste nível durante a duração da varredura anatômica.
2. Use a varredura do localizador FLASH para garantir que o cérebro esteja alinhado com o isocentro do ímã(Figura 5a). Reposicione o animal e repita se necessário.
3. Execute a varredura de localizador RARE de maior resolução e use esta saída de varredura para alinhar 15 fatias sagiais centradas em todo o cérebro (da esquerda para a direita, Figura 5b).
4. Usando a fatia sagital média, alinhe a fatia axial central à descussação da comissure anterior, que aparece como uma mancha escura(Figura 5c). Observe o deslocamento da fatia para usar mais tarde nas varreduras de estado de repouso.
5. Adquira 23 fatias usando os protocolos axiais FLASH e RARE para auxiliar no registro em um espaço comum durante a análise pós-digitalização.
6. Shim por todo o cérebro usando a sequência press.

5. Fase 4: Aquisição de varredura de estado de repouso

1. Após a conclusão dos exames anatômicos, reduza o isoflurane para 0,5% a 0,75%, ajustando-se para que a respiração do animal seja de 60-65 respirações por minuto. Permaneça neste nível por pelo menos 10 minutos antes de iniciar a varredura de estado de repouso para garantir a estabilidade.
2. Quando a fisiologia é estável (a faixa de respiração é de 60-75 bpm sem ofegante ou irregularidades, a temperatura corporal do núcleo é de 37,5 ± 1,0 °C, e a saturação de oxigênio é de 95% ou mais), adquira uma varredura EPI de 15 fatias usando a mesma fatia compensada da série axial anatômica.
3. Após cada varredura de estado de repouso ser concluída, verifique a qualidade usando uma análise de componentes independente (ICA) para decompor os dados em componentes espaciais e temporais.
4. Obtenha pelo menos três exames de estado de repouso de alta qualidade.

6. Recuperação pós-digitalização

1. Quando a varredura estiver completa, aumente o isoflurane para 2% e pare a infusão dexmedetomidina subcutânea.
2. Remova o berço animal do ímã, desembrulhe o animal e remova as barras de ouvido, a sonda de temperatura, o clipe do oxímetro de pulso e a agulha dexmedetomidina.
3. Injete 0,015 mg/kg da solução de atipamezole diluída no músculo da perna traseira do rato usando uma seringa de 1 mL com uma agulha de 25 G (ou seja, um rato de 300 g receberia 0,09 mL).
4. Coloque o rato de volta na gaiola em cima de uma almofada de aquecimento e monitore até que o animal esteja ambulatorial.

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Resultados

Após cada varredura de estado de repouso, a estabilidade é avaliada por meio de uma análise de componentes independente (ICA; script de exemplo incluído em Arquivos Suplementares). A Figura 6 mostra exemplos de saídas de componentes de escaneamentos de estado de repouso. A Figura 6a mostra um componente de sinal de uma varredura com alta estabilidade. Note que espacialmente, o componente tem alta regionalidade. Dentro do curso de tempo abai...

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Discussão

A estabilidade do animal, tanto física quanto fisiologicamente, é fundamental para obter dados de estado de repouso de alta qualidade. Este protocolo alcança estabilidade movendo-se através de quatro fases distintas da anestesia. É imperativo que o animal tenha cumprido os limites fisiológicos definidos antes de passar para a próxima fase da anestesia; uma vez que este método se baseia em mecanismos autoregulatórios fisiológicos, animais individuais podem exigir quantidades ligeiramente diferentes de tempo em c...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
9.4T MRI	Varian/Bruker		Varian upgraded with Bruker console running Paravision 6.0.1 software
Air-Oxygen Mixer	Sechrist	Model 3500CP-G
Analysis of Functional NeuroImages (AFNI)	NIMH/NIH	Version AFNI_18.3.03	Freely available at: https://afni.nimh.nih.gov/
Animal Cradle	RAPID Biomedical	LHRXGS-00563	rat holder with bite bar, nose cone and ear bars
Animal Physiology Monitoring & Gating System	SAII	Model 1025	MR-compatible system including oxygen saturation, temperature, respiration and fiber optic pulse oximetry add-on
Antisedan (atipamezole hydrochloride)	Patterson Veterinary	07-867-7097	Zoetis, Manufacturer Item #10000449
Ceramic MRI-Safe Scissors	MRIequip.com	MT-6003
Clippers	Patterson Veterinary	07-882-1032	Wahl touch-up trimmer combo kit, Manufacturer Item #09990-1201
Dexmedesed (dexmedetomidine hydrochloride)	Patterson Veterinary	07-893-1801	Dechra Veterinary Products, Manufacturer Item#17033-005-10
Digital Rectal Thermometer Covers	Medline	MDS9608
FMRIB Software Library	FMRIB	MELODIC Version 3.15	Freely available at: https://fsl.fmrib.ox.ac.uk/fsl/fslwiki
Heating Pad	Cara Inc.	Model 50
Hemostat forceps, straight	Kent Scientific	INS750451-2
Isoflurane	Patterson Veterinary	07-893-1389	Patterson Private Label, Manufacturer Item #14043-0704-06
Isoflurane Vaporizer	VetEquip Inc.	911103
Lab Tape, 3/4"	VWR International	89097-990
Needles, 23 gauge	BD	305145	plastic hub removed
Parafilm Laboratory Film	Patterson Veterinary	07-893-0260	Medline Industries Inc., Manufacturer Item #HSFHS234526A
Planar Surface Coil	Bruker	T12609	2cm
Polyethylene Tubing	Braintree Scientific	PE50 50FT	0.023" (inner diameter), 0.038" (outer diameter)
Puralube Ophthalmic Ointment	Patterson Veterinary	07-888-2572	Dechra Veterinary Products, Manufacturer Item #211-38
Sprague Dawley Rats	Charles River	400 SAS SD
Sterile 0.9% Saline Solution	Patterson Veterinary	07-892-4348	Aspen Vet, Manufacturer Item #14208186
Sterile Alcohol Prep Pads	Medline	MDS090735
Surgical Tape, 1" (3M Durapore)	Medline	MMM15381Z	3M Healthcare, "wide medical tape"
Surgical White Paper Tape, 1/2" (3M Micropore)	Medline	MMM15300	3M Healthcare
Syringes, 1 mL w/ 25 gauge needle	BD	309626
Syringes, 3 mL	BD	309657
Vented induction and scavenging system	VetEquip Inc.	942102	2 liter induction chamber with active scavenging
		411724	omega flowmeter
		931600	scavenging cube, "vacuum"
		921616	nose cone, non-rebreathing