使用生物发光成像对小鼠尿路感染及其治疗的纵向随访

摘要

本手稿描述了使用 勒克斯 操纵子膀胱内施用泌尿道致病细菌以诱导小鼠尿路感染，以及随后使用生物发光成像对细菌负荷进行 纵向体内 分析。

摘要

尿路感染 （UTI） 是人类最常见的细菌感染之一，常规使用经验性抗生素治疗。然而，由于微生物耐药性的增加，最常用的抗生素的疗效已经下降。为了找到替代治疗方案，非常需要更好地了解UTI的发病机制和确定UTI易感性的机制。为了在动物模型中研究这一点，研究UTI病程的可重复，非侵入性测定是必不可少的。

多年来，细菌负荷计数的金标准一直是确定特定样品体积的菌落形成单位（CFU）。该技术需要 死后 器官均质和连续稀释，限制了数据输出和可重复性。作为替代方案，生物发光成像（BLI）越来越受欢迎，以确定细菌负荷。使用 lux 操纵子标记病原体，可以以非侵入性方式进行灵敏的检测和定量，从而实现纵向随访。到目前为止，BLI在UTI研究中的采用仍然有限。

本手稿描述了BLI在小鼠尿路感染模型中的实际实施。这里提供了培养细菌，膀胱内滴注和成像的分步指南。检查了 体内 与CFU的相关性，并通过比较未经处理的受感染动物与抗生素处理动物的细菌负荷来提供概念验证。此外，还讨论了 在体内 UTI模型中实施BLI的优点，局限性和注意事项。BLI在UTI研究领域的实施将极大地促进UTI发病机制的研究以及预防和治疗UTI的新方法的发现。

引言

尿路感染（UTI）是人类最常见的细菌感染之一。几乎一半的女性在其一生中会出现有症状的^UTI1。局限于膀胱的感染可引起泌尿系统症状，例如尿频增加、尿急、血尿、尿失禁和疼痛。当感染上升到上尿路时，患者会出现肾盂肾炎，伴有不适、发热、寒战和背痛。此外，高达20%的UTI患者患有复发性感染，导致抗生素敏感性急剧下降^2，3，4。近年来，人们对治疗和预防复发性UTI的新疗法越来越感兴趣。尽管对下尿路的先天性和适应性免疫以及侵袭和定植所需的细菌毒力因素有了更好的了解，但治疗方案的根本性变化尚未转化为日常泌尿外科实践²。为了研究UTI的发病机制和体内的易感性，一种可重复的、非侵入性的测定是必不可少的。

已经描述了从线虫到灵长类动物的多种动物UTI模型，但小鼠模型主要使用^5，6。该模型包括（雌性）小鼠的经尿道导管插入术，随后将细菌悬浮液（最常见的是泌尿致病性大肠杆菌（UPEC））直接滴注到膀胱腔⁷中。接种后，细菌负荷传统上通过确定菌落形成单位（CFU）来量化。该技术需要牺牲动物以获得死后器官均质和连续稀释，从而限制了数据输出和可重复性。此外，使用这种技术不可能对个体动物的细菌负荷进行纵向随访。

1995年，Contag等人建议使用生物发光标记的病原体来监测活体动物的疾病过程^8，9。从那时起，生物发光成像（BLI）已应用于许多感染模型，如脑膜炎，心内膜炎，骨髓炎，皮肤和软组织感染等10，11，12。在小鼠UTI模型中，可以使用来自Photorhabdus发光的具有完全勒克斯操纵子（luxCDABE）的UPEC菌株^13。酶促反应由细菌荧光素酶催化，其依赖于长链醛的氧化，在氧气存在下与还原的黄素单核苷酸反应，产生氧化的黄素，长链脂肪酸和光^12。lux操纵子编码荧光素酶和合成底物所需的其他酶。因此，所有代谢活性细菌将连续发射蓝绿色（490nm）光，而无需注射外源性底物^12。lux标记细菌发射的光子可以使用高灵敏度的冷却电荷耦合器件（CCD）相机捕获。

在UTI模型中使用生物发光细菌允许对细菌负荷进行纵向，非侵入性定量，而不需要在CFU测定的随访期间在固定时间点牺牲动物。尽管存在广泛的可能性，积累了这种BLI技术在其他领域的稳健性及其相对于UTI经典模型的优势的证据，但它尚未在UTI研究中得到广泛实施。这里介绍的方案提供了详细的分步指南，并强调了BLI在未来所有UTI研究中的优势。

研究方案

所有动物实验均按照欧盟共同体理事会指南进行，并得到KU Leuven动物伦理委员会的批准（P158 / 2018）。

1. 培养细菌（适应于^{7、13、14）}

1. 制备
   1. 选择最适合实验需求的发光UPEC菌株。
      注意:在这里，选择临床膀胱炎分离物UTI89（大肠杆菌），因为它在人类和啮齿动物中的泌尿致病能力，以及它在小鼠UTI模型^5，7，15中的常见用途。携带完全勒克斯操纵子（luxCDABE）的生物发光等基因菌株进一步被称为UTI89-lux。该操纵子还携带硫酸卡那霉素（Km）抗性基因。因此，Km可用于选择生物发光菌落^13。
   2. 为所选细菌菌株⁷的CFU和600纳米（OD 600nm）处的光密度制作相关曲线。
      1. 为此，培养细菌（使用下面的方案）并在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中产生8种不同的稀释液。测量所有这些稀释液在600nm处的OD，并将其接种在Luria-Bertani（LB）板上以确定CFU。
      2. 绘制 OD 600 nm 值和 CFU 值以确定相关性并获得标准曲线。
         注意:对于未来的实验，测量600nm处的OD，并使用此标准曲线即时估计细菌溶液中的CFU。
         注意:UPEC是致病细菌，请确保房间配备正确并使用个人防护装备。
2. 滴注前三天
   1. 通过使用接种环在补充有50μg/ mL Km的LB板上划出甘油菌料储备并在37°C下培养过夜来获得单个菌落。 用石蜡膜密封这些板，在4°C下储存长达1周。
3. 滴注前两天
   1. 用5 mL LB肉汤填充带有双位置卡扣帽的无菌14 mL聚苯乙烯圆底管，并补充50μg/ mL Km。涡旋10秒，以确保适当混合。
   2. 用卡扣帽在37°C的开放位置静态培养过夜。
      注意: 大肠杆菌 的静态生长促进1型毛囊的表达，这对于粘附和侵入尿上皮细胞至关重要。
   3. 准备无菌锥形瓶或培养瓶。
4. 滴注前一天
   1. 孵育后，涡旋管10秒以确保细菌培养物的适当均质化。通过将25μL细菌悬浮液加入25mL不含抗生素的新鲜LB培养基中，在锥形器中进行亚培养。
   2. 关闭锥形瓶并在37°C下静置培养过夜。
5. 在滴注当天
   1. 涡旋锥形器10秒，以确保正确混合。
   2. 将锥形瓶中的培养物倒入50mL培养管中，并在3，000×g和4°C下离心5分钟。倾析上清液并将细菌沉淀重悬于10mL无菌PBS中，并再次涡旋10 s。
   3. 选择接种物的实验浓度（CFU），并使用步骤1.1.2中获得的标准曲线来确定相应的OD 600nm。
   4. 将1mL重悬的细菌培养物加入9mL无菌PBS中，并在600nm处检查OD。通过加入无菌PBS或浓缩细菌溶液进一步调整，直到达到所需的OD 600nm⁷。
      注意:例如，对于UTI89-lux，通过加入PBS调节培养物，直到OD 600nm达到0.45，对应于2×10⁷ CFU / 50μL。 为了验证可行CFU的数量，在LB板上一式三份进行10倍连续稀释和板50μL的第五和第六次10倍稀释，以获得少于300个集落。在37°C下孵育过夜后的第二天计数获得的菌落，OD 600nm立即读数，但使用CFU作为质量控制。

2. 动物接种（改编自^7，16）

1. 动物的准备
   1. 根据研究问题和敲除线的可用性，实验细节以及UTI易感性的差异选择所需的小鼠品系^5，17。请记住，经尿道导管插入术在雌性小鼠中更容易。不要使用小于8周的动物，因为它们在免疫学上是不成熟的。在这里，使用12周龄的雌性C57Bl / 6J小鼠。
   2. 提前订购动物，让它们适应环境，最好是7天。在标准12小时的光/暗条件下，将动物分组在单独通风的笼子中。
   3. 剃掉动物的腹部区域，以限制信号的损失。不要使用脱毛膏，因为它会迅速灼伤动物的皮肤。用非惯用手紧紧握住苞毛和后肢，同时用惯用手剃须，从而约束动物。或者，在异氟醚麻醉下剃须。
      注意:动物在成像前2天剃须，考虑到动物将进一步梳理剃须区域。
   4. 在整个实验过程中 随意 提供水和标准食物。但是，在滴注前2小时剥夺动物的水分，以尽量减少滴注过程中的膀胱体积。
   5. 将无菌的24 G血管导管尖端安装在100μL注射器上，并用步骤1.5.3中制备的细菌溶液填充注射器。
      注意:要确定背景发光，请在滴注前获得基线图像（请参阅下面的步骤3）。
2. 动物滴注
   1. 将动物置于诱导室中，并使用吸入以纯氧为载气的异氟醚麻醉它们（诱导率为3%，维持为1.5%）。
   2. 将一只动物放在仰卧位的工作表面上，并在滴注过程中使用鼻锥保持稳定的异氟醚麻醉。涂抹眼药膏。
   3. 通过轻柔按压并在耻骨上区域进行打圈运动来排出残留的尿液。在滴注前用70%乙醇清洁下腹部。
   4. 用生理盐水润滑导管尖端。将非惯用手的食指放在腹部，轻轻向上推。以90°角（垂直）开始尿道导管插入术，一旦遇到阻力，请水平倾斜，然后再进一步插入（0.5厘米）。
      注意:切勿用力推动导管，因为这会对尿道造成伤害。轻柔的转动动作有助于导管插入。另一方面，缺乏阻力通常表明错误地插入阴道。
   5. 缓慢（5μL / s）滴注50μL细菌接种物（2 x 10⁷ CFU）。
      注意:较高的容量或更快的滴注可能会导致肾脏反流。在该技术的实践过程中，可以使用蓝色墨水来评估回流。
   6. 滴注后，将注射器和导管保持在适当的位置几秒钟，然后慢慢缩回以防止泄漏。记录任何异常情况，例如大量泄漏或血腥的口道，并在必要时排除动物。
   7. 将动物置于成像室鼻锥的仰卧位置，并对所有剩余的动物重复上述步骤2.1.1-2.1.6。每个实验组使用一根导管。确保继续麻醉，并尽量减少第一只动物和最后一只动物之间的时间。
   8. 如有必要，在成像之前或之后施用抗生素或实验药物（步骤3）。例如，要施用恩诺沙星，将40μL恩诺沙星（100mg / mL）溶液加入3.96mL生理盐水以获得1/100稀释液。上午9点和下午5点皮下注射100μL/ 10g，给予10mg / kg恩诺沙星，每日两次，持续3天。

3. 生物发光成像

1. 准备和选择成像参数
   1. 打开BLI采集软件（参见 材料表），然后单击成像设备中的初始化（参见 材料表），测试相机和载物台控制器系统，并将CCD相机冷却至-90°C。
      注:在此过程中，门被锁定，并且可以在控制面板上跟踪初始化的进度。绿灯表示达到-90°C的温度。如果在完成初始化之前尝试映像，则会显示警告。
   2. 确保自动保存数据:单击采集 自动保存到 并选择正确的文件夹。
   3. 选择发光和照片。检查默认发光设置:将激发滤镜设置为"阻止"，将发射滤镜设置为"打开"。
   4. 拍摄第一张图像时，将曝光时间设置为 "自动"， 尤其是在需要微弱信号以确保足够数量的光子计数时。对于 体内 测量和明亮信号，请将 曝光时间 设置为~30秒。如果图像饱和，将出现警告。如果发生这种情况，请减少曝光时间。
   5. 选择中等 分档，F/stop 1，然后选择正确的视野（FOV）（D代表5只动物）。
   6. 对小鼠进行成像时，将 受试者高度 设置为1厘米。
   7. 单击"采集控制面板"中的"添加"三次，获取三张图像序列，作为技术重复。
2. 成像
   1. 将小鼠置于仰卧位的成像室中，并在整个实验过程中使用歧管鼻锥保持麻醉（异氟醚1.5%）。同时对多达5只小鼠进行成像，并使用光挡板将动物分开以防止反射。
   2. 关闭门，然后单击" 获取 "以开始成像序列。
   3. 填写有关实验的详细信息（野生型和敲除动物，治疗，成像日等）。自动保存成像设置，例如曝光时间。
   4. 将小鼠从成像室中取出并将它们放回笼子中。检查麻醉后是否完全恢复。在几分钟内，动物应该完全清醒和探索。不要提供镇痛药，因为这可能会干扰UTI病程¹⁸。
   5. 将笼子放回通风架，直到下一个成像周期。实验完成后，通过CO₂ 窒息或宫颈脱位对动物实施安乐死。在异氟醚麻醉恢复之前这样做，以尽量减少痛苦。
3. 图像分析
   1. 启动映像软件，然后单击" 浏览"加载实验文件。
   2. 使用 工具选项板 调整图像的色阶。通过对所有图像使用相同的设置来标准化结果的视觉方面，即使用最小10⁴ 到最大10⁷ 光子的对数刻度。这些调整不会影响原始数据，而只会影响图形显示。
   3. 使用 ROI 工具 在图像上绘制感兴趣区域 （ROI）。确保ROI足够大以覆盖整个区域，并对所有图像使用相同的尺寸。在这里，将3.5厘米x 4.5厘米的正方形ROI放置在下腹部。
   4. 单击ROI测量以量化光强度（计数或总光子通量）。导出这些数据并使用技术重复的平均值。
      注:计数表示相机检测到的光子数，应仅用于图像质量控制。要报告数据，请使用总光子通量。总光子通量在生理上更相关，因为它代表从表面发出的光，并且是一个校准单位，根据曝光时间（每秒）进行校正。

结果

体内 BLI与滴注时接种物的CFU相关。
为了评估BLI在体内的检测限以及与接种物CFU的相关性，以不同浓度的UTI89-lux和PBS作为阴性对照感染小鼠。在滴注之前，扫描未受感染的动物以确定背景发光。随后的图像在滴注后立即获得（图1A）。在滴注UTI89-lux后，生物发光在2 x 10⁴ CFU以上被强烈地检测到，并且建立了接种物?...

讨论

与 CFU 计数相比，BLI 的优势
纵向数据
传统上计算CFU以量化微生物负荷的方法的一个主要缺点是需要 死后 器官均质，每只动物只能提供一个横截面数据点。相反，BLI能够对受感染的动物进行非侵入性纵向随访。这些动物每天可以成像2到3次，从而提供对感染动力学的详细见解。此外，对同一动物的重复测量大大减少了充分动力实验所需的动物数量。此外，研究人员可以专?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well Black Flat Bottom Polystyrene Plate	Corning	3925	for in vitro imaging
Aesculap ISIS	Aesculap	GT421	hair trimmer, with GT608 cap
Anesthesia vaporizer	Harvard apparatus limited	N/A	https://www.harvardapparatus.com/harvard-apparatus-anesthetic-vaporizers.html
Baytril 100 mg/mL	Bayer	N/A	Enrofloxacin
BD Insyte Autoguard 24 GA	BD	382912	Yellow angiocatheter, use sterile plastic tip for instillation
C57Bl/6J mice	Janvier	N/A
Centrifuge 5804R	Eppendorf	EP022628146
Dropsense 16	Unchained Labs	Trinean	to measure OD 600nm
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, Gibco	ThermoFisher Scientific	REF 14040-083
Ethanol 70% denaturated 5L	VWR international	85825360
Falcon 14ml Round Bottom Polystyrene Tube, Snap-Cap	Corning	352057
Falcon 50ml cellstart	Greiner	227285
Hamilton GASTIGHT syringe, PTFE luer lock, 100 µL	Sigma-Aldrich	26203	to ensure slow bacterial instillation of 50 µL
Inoculation loop	Roth	6174.1	holder: Art. No. 6189.1
Iso-Vet 1000mg/g	Dechra Veterinary products	N/A	Isoflurane
IVIS Spectrum In Vivo Imaging System	PerkinElmer	REF 124262	imaging device
Kanamycine solution 50 mg/mL	Sigma-Aldrich	CAS 25389-94-0
Living Imaging Software	PerkinElmer	N/A	BLI acquisition software, version 4.7.3
Luria Bertani Broth	Sigma-Aldrich	REF L3022	alternatively can be made
Luria Bertani Broth with agar	Sigma-Aldrich	REF L2897	alternatively can be made
Petri dish Sterilin 90mm	ThermoFisher Scientific	101VR20	to fill with LB agar supplemented with Km
Pyrex Culture flask 250 mL	Sigma-Aldrich	SLW1141/08-20EA
Slide 200 Trinean	Unchained Labs	701-2007	to measure OD 600nm
UTI89-lux	N/A	N/A	Generous gift from Prof. Seed
Vortex	VWR international	444-1372