Seguimiento longitudinal de las infecciones del tracto urinario y su tratamiento en ratones utilizando imágenes de bioluminiscencia

Resumen

Este manuscrito describe la administración intravesical de bacterias uropatógenas con un lux operon para inducir una infección del tracto urinario en ratones y el posterior análisis longitudinal in vivo de la carga bacteriana mediante imágenes de bioluminiscencia.

Resumen

Las infecciones del tracto urinario (ITU) se encuentran entre las infecciones bacterianas más comunes en humanos y se tratan rutinariamente con antibióticos empíricos. Sin embargo, debido al aumento de la resistencia microbiana, la eficacia de los antibióticos más utilizados ha disminuido. Para encontrar opciones de tratamiento alternativas, existe una gran necesidad de una mejor comprensión de la patogénesis de la ITU y los mecanismos que determinan la susceptibilidad a la ITU. Para investigar esto en un modelo animal, es indispensable un ensayo reproducible y no invasivo para estudiar el curso de la ITU.

Durante años, el estándar de oro para la enumeración de la carga bacteriana ha sido la determinación de unidades formadoras de colonias (UFC) para un volumen de muestra particular. Esta técnica requiere homogeneizados de órganos post mortem y diluciones en serie, lo que limita la producción de datos y la reproducibilidad. Como alternativa, las imágenes de bioluminiscencia (BLI) están ganando popularidad para determinar la carga bacteriana. El etiquetado de patógenos con un operón lux permite la detección y cuantificación sensible de una manera no invasiva, lo que permite un seguimiento longitudinal. Hasta ahora, la adopción de BLI en la investigación de itunicas urinarias sigue siendo limitada.

Este manuscrito describe la implementación práctica de BLI en un modelo de infección del tracto urinario de ratón. Aquí, se proporciona una guía paso a paso para el cultivo de bacterias, la instilación intravesical y la obtención de imágenes. Se examina la correlación in vivo con la UFCC y se proporciona una prueba de concepto comparando la carga bacteriana de los animales infectados no tratados con los animales tratados con antibióticos. Además, se discuten las ventajas, limitaciones y consideraciones específicas de la implementación de BLI en un modelo de ITU in vivo. La implementación de BLI en el campo de investigación de UTI facilitará en gran medida la investigación sobre la patogénesis de UTI y el descubrimiento de nuevas formas de prevenir y tratar UTI.

Introducción

Las infecciones del tracto urinario (ITU) se encuentran entre las infecciones bacterianas más comunes en los seres humanos. Casi la mitad de todas las mujeres experimentarán una infección urinaria sintomática durante su vida¹. Las infecciones limitadas a la vejiga pueden dar lugar a síntomas urinarios como aumento de la frecuencia urinaria, urgencia, hematuria, incontinencia y dolor. Cuando la infección asciende al tracto urinario superior, los pacientes desarrollan pielonefritis, con malestar general, fiebre, escalofríos y dolor de espalda. Además, hasta el 20% de los pacientes con ITU sufren infecciones recurrentes que resultan en una disminución dramática de la sensibilidad a los antibióticos^2,3,4. En los últimos años, ha habido un creciente interés en nuevas terapias para el tratamiento y la prevención de la ITU recurrente. A pesar de una mejor comprensión de la inmunidad innata y adaptativa del tracto urinario inferior y de los factores de virulencia bacteriana necesarios para la invasión y colonización, no se han traducido cambios radicales en el régimen de tratamiento a la práctica urológica diaria². Para estudiar la patogénesis y la susceptibilidad in vivo delas itunicas urinarias, es indispensable un ensayo reproducible y no invasivo.

Se han descrito múltiples modelos de ITU animales que van desde nematodos hasta primates, pero el modelo murino se utiliza predominantemente^5,6. Este modelo consiste en el cateterismo transuretral de ratones (hembras) y la posterior instilación de una suspensión bacteriana, más comúnmente uropatógena Escherichia coli (UPEC), directamente en la luz de la vejiga⁷. Después de la inoculación, la carga bacteriana se ha cuantificado tradicionalmente mediante la determinación de unidades formadoras de colonias (UFC). Esta técnica requiere el sacrificio de animales para obtener homogeneizados de órganos post mortem y diluciones en serie, lo que limita la producción de datos y la reproducibilidad. Además, el seguimiento longitudinal de la carga bacteriana en animales individuales no es posible utilizando esta técnica.

En 1995, Contag etal. sugirieron el uso de patógenos marcados con bioluminiscencia para monitorear los procesos de enfermedad en animales vivos^8,9. Desde entonces, la imagen de bioluminiscencia (BLI) se ha aplicado a numerosos modelos de infección como meningitis, endocarditis, osteomielitis, infecciones de la piel y tejidos blandos, etc.^10,11,12. En el modelo murino UTI, se puede utilizar una cepa UPEC con el operón lux completo(luxCDABE)de Photorhabdus luminescens ¹³. Una reacción enzimática es catalizada por la luciferasa bacteriana que depende de la oxidación de aldehídos de cadena larga que reaccionan con el mononucleótido de flavina reducido en presencia de oxígeno, produciendo la flavina oxidada, un ácido graso de cadena larga y ligero¹². El operón lux codifica para la luciferasa y otras enzimas necesarias para la síntesis de los sustratos. Por lo tanto, todas las bacterias metabólicamente activas emitirán continuamente luz verde azul (490 nm) sin necesidad de la inyección de un sustrato exógeno¹². Los fotones emitidos por bacterias marcadas con luxse pueden capturar utilizando cámaras de dispositivos de carga acoplada (CCD) refrigeradas y altamente sensibles.

El uso de bacterias bioluminiscentes en un modelo para la ITU permite la cuantificación longitudinal y no invasiva de la carga bacteriana, omitiendo la necesidad de sacrificar animales en puntos de tiempo fijos durante el seguimiento para la determinación de ufc. A pesar de la amplia gama de posibilidades, la acumulación de evidencia de la robustez de esta técnica BLI en otros campos y sus ventajas sobre los modelos clásicos de ITU, no se ha implementado ampliamente en la investigación de UTI. El protocolo presentado aquí proporciona una guía detallada paso a paso y destaca las ventajas de BLI para toda la investigación futura de UTI.

Protocolo

Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices del Consejo de la Comunidad de la Unión Europea y fueron aprobados por el Comité de Ética Animal de KU Leuven (P158/2018).

1. Cultivo de bacterias (adaptado de^7,13,14)

1. Preparación
   1. Elija una cepa UPEC luminiscente que mejor se adapte a las necesidades experimentales.
      NOTA: Aquí, el aislado clínico de cistitis, UTI89(E. coli),fue seleccionado por su capacidad uropatógena tanto en humanos como en roedores, y su uso común en modelos de ITU murina^5,7,15. La cepa isogénica bioluminiscente que transporta el operón lux completo(luxCDABE)se conoce además como UTI89-lux. Este operón también lleva genes de resistencia al sulfato de kanamicina (Km). Por lo tanto, Km se puede utilizar para seleccionar colonias bioluminiscentes¹³.
   2. Haga una curva de correlación para la UFC y la densidad óptica a 600 nanómetros (OD 600 nm) para la cepa bacteriana elegida⁷.
      1. Para hacer esto, cultive bacterias (utilizando el protocolo a continuación) y haga 8 diluciones diferentes en solución salina tamponada con fosfato (PBS). Mida el OD a 600 nm para todas estas diluciones y enchapó en placas de Luria-Bertani (LB) para determinar la UFC.
      2. Trazar los valores de OD 600 nm y los valores de CFU para determinar la correlación y obtener una curva estándar.
         NOTA: Para futuros experimentos, mida el OD a 600 nm y use esta curva estándar para obtener una estimación instantánea de la UFC en una solución bacteriana.
         PRECAUCIÓN: Los UPEC son bacterias patógenas, asegúrese de que las habitaciones estén debidamente equipadas y use equipo de protección personal.
2. Tres días antes de la instilación
   1. Obtener colonias individuales mediante la eliminación de la cepa de glicerol de las bacterias, utilizando un bucle de inoculación, en placas LB suplementadas con 50 μg/mL Km y cultivo durante la noche a 37 °C. Selle estas placas con una película de parafina para almacenar a 4 °C hasta 1 semana.
3. Dos días antes de la instilación
   1. Llene un tubo inferior redondo de poliestireno estéril de 14 ml con tapas de doble posición con 5 ml de caldo LB suplementado con 50 μg / ml Km. Elija una sola colonia bacteriana con un lazo de inoculación y agréguelo al caldo LB. Vórtice durante 10 s para garantizar una mezcla adecuada.
   2. Cultivo estático con la tapa a presión en posición abierta a 37 °C durante la noche.
      NOTA: El crecimiento estático de E. coli promueve la expresión del tipo 1-pili, que son críticos para la adherencia e invasión de las células epiteliales urinarias.
   3. Prepare un Erlenmeyer estéril o un matraz de cultivo.
4. Un día antes de la instilación
   1. Después de la incubación, vórtice el tubo durante 10 s para garantizar la homogeneización adecuada del cultivo bacteriano. Realice un subcultivo en el Erlenmeyer agregando 25 μL de la suspensión bacteriana a 25 ml de lb medio fresco sin antibióticos.
   2. Cierre el Erlenmeyer y cultive estáticamente a 37 °C durante la noche.
5. El día de la instilación
   1. Vórtice el Erlenmeyer durante 10 s para garantizar una mezcla adecuada.
   2. Vierta el cultivo del Erlenmeyer en un tubo de cultivo de 50 ml y centrífuga a 3.000 x g y 4 °C durante 5 min. Decantar el sobrenadante y resuspendir el pellet bacteriano en 10 mL de PBS estéril y vórtice de nuevo durante 10 s.
   3. Elija la concentración experimental del inóculo (UFC) y utilice la curva estándar obtenida en el paso 1.1.2 para determinar el OD 600 nm correspondiente.
   4. Agregue 1 ml del cultivo bacteriano resuspendido en 9 ml de PBS estéril y verifique el OD a 600 nm. Ajuste aún más agregando PBS estéril o solución bacteriana concentrada, hasta que se alcance el OD 600 nm deseado⁷.
      NOTA: Por ejemplo, para UTI89-lux ajustar el cultivo añadiendo PBS hasta que el OD 600 nm alcance 0,45, correspondiente a 2 x 10⁷ UFC/50 μL. Para verificar el número de UFC viables, hacer diluciones en serie de 10 veces y placa 50 μL de las diluciones quinta y sexta de 10 veces en placas LB por triplicado para obtener menos de 300 colonias. Cuente las colonias obtenidas al día siguiente después de la incubación nocturna a 37 ° C. OD 600 nm proporciona una lectura instantánea, pero use CFU como control de calidad.

2. Inoculación de los animales (adaptado de^7,16)

1. Preparación de los animales
   1. Elija la(s) cepa(s) de ratón deseada(s) en función de la pregunta de investigación y la disponibilidad de líneas eliminatorias, detalles experimentales y diferencias en la susceptibilidad a la ITU^5,17. Tenga en cuenta que el cateterismo transuretral es más fácil en ratones hembra. No use animales menores de 8 semanas, ya que son inmunológicamente inmaduros. Aquí, se utilizaron ratones C57Bl / 6J hembra de 12 semanas de edad.
   2. Ordene animales con mucha anticipación y déjelos aclimatarse, idealmente durante 7 días. Agrupe a los animales domésticos en jaulas ventiladas individualmente, en condiciones estándar de luz/oscuridad de 12 h.
   3. Afeitar la región abdominal de los animales para limitar la pérdida de señal. No use crema depilatoria, ya que puede quemar la piel de los animales rápidamente. Sujete al animal sosteniendo firmemente las extremidades arrugadas y traseras con la mano no dominante mientras se afeita con la mano dominante. Alternativamente, afeitarse bajo anestesia isoflurano.
      NOTA: Los animales fueron afeitados 2 días antes de la toma de imágenes, considerando que los animales acicalarán aún más el área afeitada.
   4. Proporcione agua y alimentos estándar ad libitum durante todo el experimento. Sin embargo, prive a los animales del agua 2 h antes de la instilación para minimizar el volumen de la vejiga durante la instilación.
   5. Monte una punta de angiocatéter estéril de 24 G en una jeringa de 100 μL y llene la jeringa con la solución bacteriana preparada en la etapa 1.5.3.
      NOTA: Para determinar la luminiscencia de fondo, obtenga una imagen de referencia antes de la instilación (consulte el paso 3, a continuación).
2. Instilación de los animales
   1. Colocar a los animales en una cámara de inducción y anestesiarlos mediante inhalación de isoflurano con oxígeno puro como gas portador (inducción al 3% y mantenimiento al 1,5%).
   2. Coloque un animal en una superficie de trabajo en posición supina y mantenga una anestesia estable de isoflurano utilizando un cono nasal durante la instilación. Aplique el ungüento para los ojos.
   3. Expulse la orina residual aplicando una compresión suave y haciendo movimientos circulares en la región suprapúbica. Limpie la parte inferior del abdomen con etanol al 70% antes de la instilación.
   4. Lubrique la punta del catéter con solución salina normal. Coloque el dedo índice de la mano no dominante sobre el abdomen y empuje suavemente hacia arriba. Comience el cateterismo de la uretra en un ángulo de 90° (verticalmente) y una vez que se encuentre resistencia, inclínelo horizontalmente antes de insertarlo más (0,5 cm).
      NOTA: Nunca empuje con fuerza el catéter, ya que esto causará daño a la uretra. Los movimientos de giro suaves pueden ser útiles en la inserción del catéter. Por otro lado, la falta de resistencia suele indicar una inserción errónea en la vagina.
   5. Realizar una instilación lenta (5 μL/s) de 50 μL del inóculo bacteriano (2 x 10⁷ UFC).
      NOTA: Los volúmenes más altos o la instilación más rápida pueden causar reflujo en los riñones. Durante la práctica de la técnica, la tinta azul se puede utilizar para evaluar el reflujo.
   6. Después de la instilación, mantenga la jeringa y el catéter en su lugar durante unos segundos más y luego retraiga lentamente para evitar fugas. Registre cualquier irregularidad, como una gran cantidad de fugas o un meato con sangre y excluya a los animales, si es necesario.
   7. Coloque al animal en posición supina en el cono nasal de la cámara de imágenes y repita los pasos anteriores 2.1.1-2.1.6 para todos los animales restantes. Utilice un catéter por grupo experimental. Asegúrese de que la anestesia continúe y minimice el tiempo entre el primer y el último animal.
   8. Si es necesario, administre antibióticos o medicamentos experimentales, antes o después de la toma de imágenes (paso 3). Por ejemplo, para administrar enrofloxacina, agregue 40 μL de la solución de enrofloxacina (100 mg/ml) a 3,96 ml de solución salina fisiológica para obtener una dilución de 1/100. Inyecte 100 μL/10 g por vía subcutánea a las 9 am y 5 pm para administrar 10 mg/kg de enrofloxacina dos veces al día durante 3 días.

3. Imágenes de bioluminiscencia

1. Preparación y selección de parámetros de imagen
   1. Abra el software de adquisición BLI (consulte la Tabla de materiales)y haga clic en Inicializar en el dispositivo de imagen (consulte la Tabla de materiales)para probar la cámara y el sistema de controlador de escenario y enfriar la cámara CCD a -90 ° C.
      NOTA: Durante este proceso, la puerta está bloqueada y el progreso de la inicialización se puede seguir en el panel de control. Una luz verde indica que se alcanza la temperatura de -90 °C. Aparecerá una advertencia si se intenta obtener imágenes antes de completar la inicialización.
   2. Asegúrese de que los datos se guarden automáticamente: Haga clic en adquisición Guardar automáticamente y seleccione la carpeta correcta.
   3. Seleccione Luminiscencia y Fotografía. Compruebe la configuración de luminiscencia predeterminada: Establezca el filtro de excitación en Bloquear y el filtro de emisión en Abrir.
   4. Establezca el tiempo de exposición en Automático al tomar la primera imagen, especialmente cuando se espera una señal tenue para garantizar un número adecuado de recuentos de fotones. Para mediciones in vivo y señales brillantes, establezca el tiempo de exposición en ~ 30 s. Si la imagen está saturada, aparecerá una advertencia. Si esto sucede, reduzca el tiempo de exposición.
   5. Seleccione el medio Binning, F/stop 1 y elija el campo de visión correcto(FOV)(D para 5 animales).
   6. Establezca la altura del sujeto en 1 cm al obtener imágenes de ratones.
   7. Haga clic en Agregar tres veces en el Panel de control de adquisición para obtener una secuencia de tres imágenes, como réplicas técnicas.
2. Imagenológico
   1. Coloque a los ratones en la cámara de imágenes en posición supina y use el cono nasal múltiple para mantener la anestesia (isoflurano 1.5%) durante todo el experimento. Imagina hasta 5 ratones simultáneamente y separa a los animales usando el deflector de luz para evitar la reflexión.
   2. Cierre la puerta y haga clic en Adquirir para iniciar la secuencia de imágenes.
   3. Complete información detallada sobre el experimento (animales salvajes y knockout, tratamientos, día de la toma de imágenes, etc.). La configuración de imágenes, como el tiempo de exposición, se guarda automáticamente.
   4. Retire los ratones de la cámara de imágenes y devuélvalos a su jaula. Verifique la recuperación completa después de la anestesia. En cuestión de minutos, los animales deben estar completamente despiertos y exploratorios. No proporcione analgesia ya que esto podría interferir con el curso de ITU¹⁸.
   5. Devuelva las jaulas a los bastidores ventilados hasta el siguiente ciclo de imágenes. Después de la finalización del experimento, sacrificar a los animales por asfixia de CO₂ o dislocación cervical. Haga esto antes de la recuperación de la anestesia isoflurano para minimizar la angustia.
3. Análisis de las imágenes
   1. Inicie el software de imágenes y cargue el archivo experimental haciendo clic en Examinar.
   2. Utilice la paleta de herramientas para ajustar la escala de colores de la imagen. Estandarizar el aspecto visual de los resultados utilizando la misma configuración para todas las imágenes, es decir, utilizar una escala logarítmica con un mínimo de 10⁴ a un máximo de 10⁷ fotones. Estos ajustes no afectan a los datos brutos, sino solo a la presentación gráfica.
   3. Utilice las herramientas de ROI para dibujar una región de interés (ROI) en la imagen. Asegúrese de que el ROI sea lo suficientemente grande como para cubrir el área completa y use las mismas dimensiones para todas las imágenes. Aquí, se colocó un ROI cuadrado de 3,5 cm x 4,5 cm sobre la parte inferior del abdomen.
   4. Haga clic en medición de ROI para cuantificar la intensidad de la luz (recuentos o flujo total de fotones). Exporte estos datos y utilice el promedio de las réplicas técnicas.
      NOTA: Los recuentos representan el número de fotones detectados por la cámara y solo deben utilizarse para el control de calidad de la imagen. Para informar de los datos, utilice el flujo total de fotones. El flujo total de fotones es más relevante fisiológicamente, ya que representa la luz emitida desde la superficie y es una unidad calibrada, que se corrige para el tiempo de exposición (por segundo).

Resultados

El BLI in vivo se correlaciona con la UFC del inóculo en el momento de la instilación.
Para evaluar el límite de detección de BLI in vivo y la correlación con ufc del inóculo, los ratones fueron infectados con diferentes concentraciones de UTI89-lux y PBS como control negativo. Antes de la instilación, los animales no infectados fueron escaneados para determinar la luminiscencia de fondo. Las imágenes posteriores se obtuvieron inmediatamente después...

Discusión

Ventajas de BLI en comparación con los recuentos de UFC
Datos longitudinales
Una desventaja importante del método tradicional de conteo de UFC para cuantificar la carga microbiana es el requisito de homogeneizados de órganos post mortem, que proporcionan solo un punto de datos transversal por animal. Por el contrario, el BLI permite un seguimiento longitudinal no invasivo de los animales infectados. Los animales pueden ser fotografiados de 2 a 3 veces al día, proporcionando una visión...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well Black Flat Bottom Polystyrene Plate	Corning	3925	for in vitro imaging
Aesculap ISIS	Aesculap	GT421	hair trimmer, with GT608 cap
Anesthesia vaporizer	Harvard apparatus limited	N/A	https://www.harvardapparatus.com/harvard-apparatus-anesthetic-vaporizers.html
Baytril 100 mg/mL	Bayer	N/A	Enrofloxacin
BD Insyte Autoguard 24 GA	BD	382912	Yellow angiocatheter, use sterile plastic tip for instillation
C57Bl/6J mice	Janvier	N/A
Centrifuge 5804R	Eppendorf	EP022628146
Dropsense 16	Unchained Labs	Trinean	to measure OD 600nm
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, Gibco	ThermoFisher Scientific	REF 14040-083
Ethanol 70% denaturated 5L	VWR international	85825360
Falcon 14ml Round Bottom Polystyrene Tube, Snap-Cap	Corning	352057
Falcon 50ml cellstart	Greiner	227285
Hamilton GASTIGHT syringe, PTFE luer lock, 100 µL	Sigma-Aldrich	26203	to ensure slow bacterial instillation of 50 µL
Inoculation loop	Roth	6174.1	holder: Art. No. 6189.1
Iso-Vet 1000mg/g	Dechra Veterinary products	N/A	Isoflurane
IVIS Spectrum In Vivo Imaging System	PerkinElmer	REF 124262	imaging device
Kanamycine solution 50 mg/mL	Sigma-Aldrich	CAS 25389-94-0
Living Imaging Software	PerkinElmer	N/A	BLI acquisition software, version 4.7.3
Luria Bertani Broth	Sigma-Aldrich	REF L3022	alternatively can be made
Luria Bertani Broth with agar	Sigma-Aldrich	REF L2897	alternatively can be made
Petri dish Sterilin 90mm	ThermoFisher Scientific	101VR20	to fill with LB agar supplemented with Km
Pyrex Culture flask 250 mL	Sigma-Aldrich	SLW1141/08-20EA
Slide 200 Trinean	Unchained Labs	701-2007	to measure OD 600nm
UTI89-lux	N/A	N/A	Generous gift from Prof. Seed
Vortex	VWR international	444-1372