요로 감염의 세로 후속 및 생물 발광 이미징을 사용하여 마우스에서의 치료

요약

이 원고는 생물 발광 이미징을 사용하여 세균 부하의 생체 내 분석에서 마우스의 요로 감염을 유도하기 위해 호화 요법 을 가진 비뇨기과 박테리아의 내막 투여를 설명합니다.

초록

요로 감염 (UTI) 인간에서 가장 일반적인 세균 성 감염 중 순위 와 정기적으로 경험적 항생제로 치료. 그러나, 미생물 저항증가 때문에, 가장 많이 사용된 항생제의 효험은 쇠퇴했습니다. 대체 치료 옵션을 찾기 위해, UTI 병인및 UTI 감수성을 결정하는 기계장치의 더 나은 이해를 위한 중대한 필요가 있습니다. 동물 모델에서 이를 조사하기 위해, UTI의 과정을 연구하는 재현 가능한 비침습적 분석은 필수적입니다.

수년 동안, 세균 부하의 열거에 대한 금 본위제는 특정 시료 부피에 대한 콜로니 성형 유닛(CFU)의 결정이었다. 이 기술은 사후 장기 균질화 및 직렬 희석을 요구하여 데이터 출력과 재현성을 제한합니다. 대안으로, 생물 발광 화상 진찰 (BLI)는 세균 부하를 결정하기 위하여 인기를 얻고 있습니다. 럭스 오페론을 가진 병원체를 라벨링하면 비침습적 방식으로 민감한 검출 및 정량화를 허용하여 세로 후속 조치를 가능하게 합니다. 지금까지, UTI 연구에서 BLI의 채택은 제한 남아.

이 원고는 마우스 요로 감염 모델에서 BLI의 실제 구현을 설명합니다. 여기에서, 박테리아를 배양하기위한 단계별 가이드, 내장 주입 및 이미징이 제공됩니다. CFU와의 생체 내 상관 관계를 검사하고 항생제 치료 동물과 치료되지 않은 감염된 동물의 세균 부하를 비교하여 개념 증명이 제공됩니다. 또한 생체 내 UTI 모델에서 BLI 구현과 관련된 장점, 제한 및 고려 사항에 대해 논의합니다. UTI 연구 분야에서 BLI의 구현은 크게 UTI의 병인에 대한 연구와 요로 감염을 예방하고 치료하는 새로운 방법의 발견을 용이하게 할 것입니다.

서문

요로 감염 (UTI)은 인간에서 가장 흔한 세균 감염 중 하나입니다. 모든 여성의 거의 절반은 일생 동안 증상 UTI를 경험하게 될 것입니다^1. 방광에 국한된 감염은 오줌 주파수, 긴급성, 혈뇨증, 요실금 및 고통의 증가와 같은 오줌 현상을 초래할 수 있습니다. 감염이 위요로 올라갈 때, 환자는 불쾌감, 발열, 오한 및 허리 통증으로 열성염을 일으킵니다. 더욱이, UTI를 가진 환자의 최대 20%는 항생감^2,3,4의극적인 감소의 결과로 재발성 감염 때문에 손해를 입습니다. 최근 몇 년 동안, 재발성 UTI의 치료 및 예방을위한 새로운 치료에 대한 관심이 증가하고있다. 하부 요로의 선천적이고 적응력있는 면역력과 침략과 식민지화에 필요한 세균성 독성 요인에 대한 더 나은 이해에도 불구하고, 치료 정권의 급진적인 변화는 매일 비뇨기과 연습^2로번역되지 않았다. 유로병증과 생체내감수성을 연구하기 위해서는 재현 가능한 비침습적 분석이 필수적입니다.

여러 동물 UTI 모델은 선충에서 영장류에 이르기까지 설명되었지만, 뮤린 모델은 주로^5,6을사용한다. 본 모델은 (여성) 마우스의 경도 카테터삽입과 세균현탁액의 후속 주입, 가장 일반적으로 비뇨기과 성 대장균(UPEC), 방광 루멘^7로직접 구성된다. 접종 후, 세균부하는 전통적으로 식민지 형성 단위(CFU)를 결정함으로써 정량화되었다. 이 기술은 동물에게 사후 장기 균질화 및 직렬 희석을 얻기 위해 희생하여 데이터 출력과 재현성을 제한해야 합니다. 더욱이, 개별 동물에서 세균 부하의 세로 후속은이 기술을 사용하여 불가능합니다.

1995년, 전염병 외는 살아있는 동물의 질병 과정을 모니터링하기 위해 생물발광성 태그병원균의 사용을^{제안8, 9.} 그 이후, 생물발광 이미징(BLI)은 뇌막염, 내막염, 골수염, 피부 및 연조직 감염 등과 같은 수많은 감염 모델에 적용되어^10,11,12. 뮤린 UTI 모델에서는, Photorhabdus 발광으로부터의 완전한 럭스 오페론(luxCDABE)을 사용한 UPEC 균주를 사용할 수 있다^13. 효소 반응은 산소의 존재에 감소 된 플라빈 모노 뉴클레오티드와 반응 긴 사슬 알데히드의 산화에 의존하는 세균 성 루시포라에 의해 촉매, 산화 플라빈을 산출, 긴 사슬 지방산과 빛^12. 럭스 오페론은 기판의 합성에 필요한 루시파라제 및 기타 효소에 대한 인코딩. 따라서, 모든 대사 활성 박테리아는 외인성^{기판(12)의}주사를 필요로 하지 않고 지속적으로 청록색(490nm) 빛을 방출한다. 럭스태그 박테리아에 의해 방출 광자를 캡처할 수 있는 매우 민감한, 냉각 충전 결합 장치 (CCD) 카메라를 사용 하 여.

UTI모델에서 생물발광성 박테리아를 사용하면 세균 부하의 세로, 비침습적 정량화를 허용하며, CFU 결정에 대한 후속 조치 중 고정 된 시간 지점에서 동물을 희생할 필요성을 생략합니다. 가능성의 넓은 범위에도 불구하고, 다른 분야에서이 BLI 기술의 견고성과 UTI의 고전적인 모델에 비해 장점에 대한 증거를 축적, 그것은 널리 UTI 연구에서 구현되지 않았습니다. 여기에 제시된 프로토콜은 상세한 단계별 가이드를 제공하고 모든 미래 UTI 연구에 BLI의 장점을 강조합니다.

프로토콜

모든 동물 실험은 유럽 연합 지역 사회 위원회 지침에 따라 수행되었으며 KU Leuven의 동물 윤리위원회 (P158/2018)의 승인을 받았습니다.

1. 배양 박테리아^{(7,13,14에서}적응)

1. 준비
   1. 실험적 요구에 가장 적합한 발광 UPEC 변형을 선택하십시오.
      참고: 여기서, 임상 방광염 분리, UTI89(대장균)는인간과 설치류 모두에서 비뇨기과증 용량, 그리고 뮤린 UTI 모델^{5,7,15에서의}일반적인 사용으로 인해 선택되었다. 완전한 럭스 오페론(luxCDABE)을 운반하는생물발광 동종 균주는 UTI89-럭스라고 더 합니다. 이 오페론은 또한 카나마이신 황산염 (Km) 저항 유전자를 운반합니다. 따라서, Km은 생물 발광^{콜로니(13)를}선택하는 데 사용할 수 있다.
   2. 선택한^{세균균7에}대해 600나노미터(OD 600 nm)에서 CFU 및 광학 밀도에 대한 상관곡선을 만든다.
      1. 이를 위해 배양 박테리아(아래 프로토콜사용)를 만들고 인산염 완충식식염수(PBS)에서 8개의 상이한 희석을 한다. 이러한 모든 희석에 대해 600 nm에서 OD를 측정하고 Luria-Bertani (LB) 플레이트에 플레이트를 플레이트하여 CFU를 결정합니다.
      2. OD 600 nm 값과 CFU 값을 플롯하여 상관 관계를 결정하고 표준 곡선을 가져옵니다.
         참고: 향후 실험의 경우 600nm에서 OD를 측정하고 이 표준 곡선을 사용하여 세균 용액에서 CFU를 즉시 추정합니다.
         주의: UPEC는 병원성 박테리아이며, 객실이 제대로 갖추어져 있는지 확인하고 개인 보호 장비를 사용합니다.
2. 주입 3일 전
   1. 접종 루프를 사용하여 50 μg/mL Km로 보충된 LB 플레이트에서 박테리아의 글리세롤 육수를 줄임으로써 단일 콜로니를 얻고 37°C에서 하룻밤 사이에 배양하십시오. 파라핀 필름으로 이 플레이트를 밀봉하여 최대 1주일까지 4°C에 보관하십시오.
3. 주입 이틀 전
   1. 멸균 14mL 폴리스티렌 라운드 하단 튜브에 5mLLB 국물 5mL의 이중 위치 스냅 캡을 채우고 접종 루프가 있는 단일 세균 식민지를 선택하고 이를 LB 국물에 추가합니다. 적절한 혼합을 보장하기 위해 10 s용 소용돌이.
   2. 스냅 캡을 한 자리에 37°C에서 하룻밤 사이에 정적으로 배양한다.
      참고: 대장균의 정적 성장은 오줌 상피 세포의 준수 및 침입에 중요한 타입-1-pili의 표현을 촉진합니다.
   3. 멸균 된 에를렌마이어 또는 문화 플라스크를 준비합니다.
4. 주입 하루 전
   1. 인큐베이션 후 세균 배양의 적절한 균질화를 보장하기 위해 튜브를 10 초 동안 소용돌이시다. 항생제없이 신선한 LB 배지의 25 mL에 세균 현탁액의 25 μL을 추가하여 Erlenmeyer에서 하위 배양을 확인하십시오.
   2. 하룻밤 사이에 37°C에서 에렌마이어와 문화를 정적으로 닫습니다.
5. 주입 당일
   1. 적절한 혼합을 보장하기 위해 10 s에 대한 에를렌 마이어 소용돌이.
   2. 에를렌마이어의 문화를 50mL 배양 튜브와 원심분리기3,000xg, 4°C로 5분 동안 붓습니다. 상류제를 데칭하고 10 s에 대한 멸균 PBS 및 소용돌이의 10 mL에서 세균 펠릿을 다시 중단합니다.
   3. 접종(CFU)의 실험 적 농도를 선택하고 1.1.2 단계에서 얻은 표준 곡선을 사용하여 해당 OD 600 nm을 결정한다.
   4. 재중단된 세균 배양 1mL를 멸균 PBS 9mL에 넣고 600nm에서 OD를 확인합니다. 원하는 OD 600 nm에 도달할 때까지 멸균 PBS 또는 농축 세균용 용액을 추가하여 더^{조정하십시오.}
      참고: 예를 들어, UTI89-lux는 OD 600 nm이 0.45에 도달할 때까지 PBS를 추가하여 배양을 조정하여 2 x 10⁷ CFU/50 μL에 해당합니다. 실행 가능한 CFU의 수를 확인하려면, 300 개 미만의 식민지를 얻기 위해 트리플 리케이트에 LB 플레이트에 다섯 번째와 여섯 번째 10 배 희석의 10 배 연속 희석 및 플레이트 50 μL을 확인합니다. 37°C. OD 600 nm에서 하룻밤 잠복 후 다음날 얻은 식민지를 카운트아웃하면 즉시 판독을 제공하지만 CFU를 품질 관리로 사용한다.

2. 동물의 접종^{(7에서적응,16)}

1. 동물의 준비
   1. 연구 질문 및 녹아웃 라인의 가용성, 실험적 세부 사항 및 UTI 감수성^5,17의차이에 따라 원하는 마우스 스트레인을 선택한다. 여성 마우스에서 트랜스우레럴 카테터화가 더 쉽다는 점에 유의하십시오. 면역학적으로 미숙하기 때문에 8 주 미만의 동물을 사용하지 마십시오. 여기서, 12주 된 암컷 C57Bl/6J 마우스가 사용되었다.
   2. 동물을 미리 주문하고 7 일 동안 이상적으로 적응하게하십시오. 표준 12h 빛/어두운 조건에서 개별적으로 통풍이 잘되는 케이지에 있는 동물을 그룹화합니다.
   3. 신호의 손실을 제한하기 위해 동물의 복부 영역을 면도. 동물의 피부를 빠르게 구울 수 있으므로 제모 크림을 사용하지 마십시오. 지배적 인 손으로 면도하는 동안 비 지배적 인 손으로 스크러프와 뒷다리를 단단히 잡고 동물을 억제하십시오. 또는, 이소플루란 마취 하에 면도.
      참고 : 동물은 이미징 2 일 전에 면도했다, 동물을 고려하면 더 면도 영역을 손질합니다.
   4. 실험 전반에 걸쳐 물과 표준 식품 광고 리비도 를 제공합니다. 그러나, 주입 하는 동안 방광 볼륨을 최소화 하기 위해 주입 하기 전에 물 2 시간 에서 동물을 박탈.
   5. 멸균 24 Gangiocatheter 팁을 100 μL 주사기에 장착하고 1.5.3 단계에서 제조된 세균용 용액으로 주사기를 채웁니다.
      참고: 배경 발광을 확인하려면 주입 전에 기준선 이미지를 가져옵니다(아래 3단계 참조).
2. 동물의 주입
   1. 유도 챔버에 동물을 배치하고 캐리어 가스로 순수한 산소와 이소플루란의 흡입을 사용하여 마취 (유도에서 3 % 및 유지 보수 1.5%).
   2. 한 동물을 수핀 위치에 있는 작업 표면에 놓고 주입 중에 코 콘을 사용하여 안정적인 이소플루란 마취를 유지합니다. 눈 연고를 바하십시오.
   3. 완만한 압축을 적용하고 suprapubic 지역에 원형 운동을 함으로써 잔류 소변을 추방하십시오. 주입 하기 전에 70% 에탄올로 하부 복부를 청소하십시오.
   4. 카테터 팁을 일반 식염수로 윤활합니다. 비 지배적 인 손의 검지 손가락을 복부에 넣고 부드럽게 위로 밀어 넣습니다. 요도의 카테터삽입을 90° 각도(수직)로 시작하고 저항이 발생하면 수평으로 기울어추가 삽입(0.5cm).
      참고 : 이것은 요도에 해를 끼칠 수 있기 때문에 카테터를 강제로 밀어 붙이는 것은 마십시오. 부드러운 회전 동작은 카테터 삽입에 도움이 될 수 있습니다. 다른 한편으로는, 저항의 부족은 일반적으로 질로 잘못된 삽입을 나타냅니다.
   5. 세균 접종 (2 x 10⁷ CFU)의 50 μL의 느린 (5 μL /s)를 수행합니다.
      참고: 볼륨이 높거나 더 빠른 주입은 신장에 역류를 일으킬 수 있습니다. 기술의 연습 하는 동안, 블루 잉크 역류를 평가 하는 데 사용할 수 있습니다.
   6. 주입 후 주사기와 카테터를 몇 초 더 제자리에 두근 다음 천천히 후퇴하여 누출을 방지합니다. 높은 양의 누출이나 피 묻은 고기와 같은 부정행위를 기록하고 필요한 경우 동물을 배제하십시오.
   7. 이미징 챔버의 코 콘에 척추 위치에 동물을 배치하고 나머지 모든 동물에 대한 앞단계 2.1.1-2.1.6을 반복한다. 실험 그룹당 카테터 1개를 사용하십시오. 마취가 계속되도록하고 첫 번째 동물과 마지막 동물 사이의 시간을 최소화하십시오.
   8. 필요한 경우, 화상 진찰 전후(3단계) 항생제 또는 실험 약물을 투여한다. 예를 들어, enrofloxacin을 투여하기 위해, 1/100 희석을 얻기 위해 생리식염수의 3.96 mL에 enrofloxacin (100 mg/mL) 용액의 40 μL을 추가합니다. 오전 9시와 오후 5시에 100 μL/10g을 피하하여 3일 동안 하루에 두 번 10 mg/kg의 enrofloxacin을 투여하십시오.

3. 생물 발광 이미징

1. 이미징 매개 변수의 준비 및 선택
   1. BLI 획득 소프트웨어(재료 표참조)를 열고 이미징 장치(재료 표 참조)에서초기화를 클릭하여 카메라 및 스테이지 컨트롤러 시스템을 테스트하고 CCD 카메라를 -90°C로 냉각시합니다.
      참고: 이 과정에서 문이 잠기고 초기화 진행 상황을 제어판에서 따를 수 있습니다. 녹색 표시등은 -90°C의 온도에 도달했음을 나타냅니다. 초기화가 완료되기 전에 이미징을 시도하면 경고가 나타납니다.
   2. 데이터가 자동으로 저장되었는지 확인: 획득 자동 저장을 클릭하고 올바른 폴더를 선택합니다.
   3. 발광 및 사진을 선택합니다. 기본 발광 설정 확인: 여기 필터를 차단하도록 설정하고 배출 필터를 엽니다.
   4. 특히 광자 수가 적지 않도록 희미한 신호를 예상할 때 첫 번째 이미지를 촬영할 때 Auto에 노출 시간을 설정합니다. 생체 내 측정 및 밝은 신호의 경우 노출 시간을 ~30s로 설정합니다. 이미지가 포화되면 경고가 나타납니다. 이 경우 노출 시간을 줄입니다.
   5. 중간 비닝, F/스톱 1을 선택하고 올바른시야(FOV)(5마리의동물에 대한 D)를 선택한다.
   6. 마우스를 이미징할 때 피사체 높이를 1cm로 설정합니다.
   7. 획득 제어판에서 세 번 추가를 클릭하여 기술 복제와 같이 세 개의 이미지 시퀀스를 얻습니다.
2. 이미징
   1. 마우스를 흡진챔버에 배치하여 매니폴드 코 콘을 사용하여 마취(isoflurane 1.5%)를 실험 전반에 걸쳐 유지한다. 최대 5마리의 마우스를 동시에 화상화하고 반사를 방지하기 위해 라이트 배플을 사용하여 동물을 분리합니다.
   2. 문을 닫고 획득을 클릭하여 이미징 시퀀스를 시작합니다.
   3. 실험에 대한 자세한 정보를 입력하십시오 (야생 유형 및 녹아웃 동물, 치료, 이미징 의 날 등). 노출 시간과 같은 이미징 설정은 자동으로 저장됩니다.
   4. 이미징 챔버에서 마우스를 제거하고 케이지로 돌려보냅니다. 마취 후 전체 회복을 확인하십시오. 몇 분 안에, 동물은 완전히 깨어 있고 탐구해야한다. 이 UTI 과정을 방해 할 수 있기 때문에 진통을 제공하지 마십시오¹⁸.
   5. 케이지를 다음 이미징 주기까지 통풍랙으로 되돌려 놓습니다. 실험이 완료된 후,_CO2 질식 또는 자궁 경부 탈구로 동물을 안락사시한다. 고통을 최소화하기 위해 이소플루란 마취의 회복 전에이 작업을 수행하십시오.
3. 이미지 분석
   1. 이미징 소프트웨어를 시작하고 찾아보기를 클릭하여 실험 파일을 로드합니다.
   2. 도구 팔레트를 사용하여 이미지의 색상 배율을 조정합니다. 모든 이미지, 즉 최소¹⁰⁴ ~107광자를 사용하여 결과의 시각적 측면을 표준화합니다. 이러한 조정은 원시 데이터에영향을 미치지 않지만 그래픽 프레젠테이션에만 영향을 미칩니다.
   3. ROI 도구를 사용하여 이미지에 관심 영역(ROI)을 그립니다. ROI가 전체 영역을 커버하고 모든 이미지에 동일한 치수를 사용할 수 있을 만큼 충분히 큰지 확인합니다. 여기서, 3.5 cm x 4.5 cm의 사각형 ROI가 하부 복부 위에 배치되었다.
   4. ROI 측정을 클릭하여 광 강도(개수 또는 총 광자 플럭스)를 정량화합니다. 이러한 데이터를 내보내고 기술 복제의 평균을 사용합니다.
      참고: 카운트는 카메라에서 감지한 광자 수를 나타내며 이미지 품질 관리에만 사용해야 합니다. 데이터를 보고하려면 총 광자 플럭스를 사용합니다. 총 광자 플럭스는 표면에서 방출되는 빛을 나타내고 노출 시간(초당)을 위해 보정되는 보정된 장치이기 때문에 생리적으로 더 관련이 있다.

결과

생체 내 BLI는 주입 시 접종시 접종의 CFU와 상관관계가 있습니다.
생체 내 BLI의 검출 한계및 접종의 CFU와의 상관관계를 평가하기 위해, 마우스는 음의 대조군으로서 UTI89-럭스 및 PBS의 상이한 농도에 감염되었다. 주입하기 전에 감염되지 않은 동물을 스캔하여 배경 발광을 결정했습니다. 후속 이미지는 즉시 주입 후(도1A)을얻었...

토론

CFU 수에 비해 BLI의 장점
세로 데이터
미생물 부담을 정량화하기 위해 CFU를 세는 전통적인 방법의 주요 단점은 동물 당 단면 데이터 포인트만 제공하는 사후 조직 균질화의 요구 사항입니다. 반대로 BLI는 감염된 동물의 비침습적 종방향 후속 조치를 가능하게 합니다. 동물은 감염의 역학에 대한 자세한 통찰력을 제공, 하루에 2 ~ 3 번 이미지 할 수 있습니다. 또한 동일한 동?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well Black Flat Bottom Polystyrene Plate	Corning	3925	for in vitro imaging
Aesculap ISIS	Aesculap	GT421	hair trimmer, with GT608 cap
Anesthesia vaporizer	Harvard apparatus limited	N/A	https://www.harvardapparatus.com/harvard-apparatus-anesthetic-vaporizers.html
Baytril 100 mg/mL	Bayer	N/A	Enrofloxacin
BD Insyte Autoguard 24 GA	BD	382912	Yellow angiocatheter, use sterile plastic tip for instillation
C57Bl/6J mice	Janvier	N/A
Centrifuge 5804R	Eppendorf	EP022628146
Dropsense 16	Unchained Labs	Trinean	to measure OD 600nm
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, Gibco	ThermoFisher Scientific	REF 14040-083
Ethanol 70% denaturated 5L	VWR international	85825360
Falcon 14ml Round Bottom Polystyrene Tube, Snap-Cap	Corning	352057
Falcon 50ml cellstart	Greiner	227285
Hamilton GASTIGHT syringe, PTFE luer lock, 100 µL	Sigma-Aldrich	26203	to ensure slow bacterial instillation of 50 µL
Inoculation loop	Roth	6174.1	holder: Art. No. 6189.1
Iso-Vet 1000mg/g	Dechra Veterinary products	N/A	Isoflurane
IVIS Spectrum In Vivo Imaging System	PerkinElmer	REF 124262	imaging device
Kanamycine solution 50 mg/mL	Sigma-Aldrich	CAS 25389-94-0
Living Imaging Software	PerkinElmer	N/A	BLI acquisition software, version 4.7.3
Luria Bertani Broth	Sigma-Aldrich	REF L3022	alternatively can be made
Luria Bertani Broth with agar	Sigma-Aldrich	REF L2897	alternatively can be made
Petri dish Sterilin 90mm	ThermoFisher Scientific	101VR20	to fill with LB agar supplemented with Km
Pyrex Culture flask 250 mL	Sigma-Aldrich	SLW1141/08-20EA
Slide 200 Trinean	Unchained Labs	701-2007	to measure OD 600nm
UTI89-lux	N/A	N/A	Generous gift from Prof. Seed
Vortex	VWR international	444-1372