מעקב אורך של דלקות בדרכי השתן והטיפול שלהם בעכברים באמצעות הדמיית ביו-לומינציה

Summary

כתב יד זה מתאר את הניהול התוך-עבזי של חיידקים אורופתיוגניים עם לוקס אופרון כדי לגרום לדלקת בדרכי השתן בעכברים ואת אורך האורך שלאחר מכן בניתוח vivo של העומס החיידקי באמצעות הדמיית ביו-לומינציה.

Abstract

זיהומים בדרכי השתן (UTI) מדורגים בין הזיהומים החיידקיים הנפוצים ביותר בבני אדם ומטופלים באופן שגרתי באנטיביוטיקה אמפירית. עם זאת, בשל עמידות מיקרוביאלית גוברת, היעילות של האנטיביוטיקה הנפוצה ביותר ירדה. כדי למצוא אפשרויות טיפול חלופיות, יש צורך גדול בהבנה טובה יותר של פתוגנזה UTI ואת המנגנונים הקובעים רגישות UTI. על מנת לחקור את זה במודל בעלי חיים, הבדיקה הניתנת לשחזור, לא פולשנית כדי ללמוד את מהלך UTI היא הכרחית.

במשך שנים, תקן הזהב לספירת עומס חיידקים היה הקביעה של יחידות יוצרות מושבה (CFU) עבור נפח מדגם מסוים. טכניקה זו דורשת הומוגנטים של איברים לאחר המוות ודילול טורי, המגבילים את פלט הנתונים ואת יכולת הרבייה. כחלופה, הדמיית ביולומינציה (BLI) צוברת פופולריות כדי לקבוע את העומס החיידקי. תיוג פתוגנים עם לוקס אופרון מאפשר זיהוי וכימות רגישים באופן לא פולשני, ובכך מאפשר מעקב אורך. עד כה, האימוץ של BLI במחקר UTI נשאר מוגבל.

כתב יד זה מתאר את היישום המעשי של BLI במודל זיהום בדרכי השתן של העכבר. כאן, מדריך צעד אחר צעד עבור חיידקים culturing, הטמעה תוך-בסית והדמיה מסופק. המתאם in vivo עם CFU נבדק הוכחה של מושג מסופק על ידי השוואת העומס החיידקי של בעלי חיים נגועים מטופלים עם בעלי חיים מטופלים באנטיביוטיקה. יתר על כן, היתרונות, המגבלות והשיקולים הספציפיים ליישום BLI במודל IN VIVO UTI נדונים. היישום של BLI בתחום המחקר UTI יקל מאוד על המחקר על הפתוגנזה של UTI וגילוי דרכים חדשות למנוע ולטפל UTI.

Introduction

זיהומים בדרכי השתן (UTI) הם בין הזיהומים החיידקיים הנפוצים ביותר בבני אדם. כמעט מחצית מכל הנשים יחוו UTI סימפטומטי במהלך חייהם¹. זיהומים המוגבלים לשלפוחית השתן יכולים לגרום לתסמינים בדרכי השתן כגון עלייה בתדירות השתן, דחיפות, המטוריה, בריחת שתן וכאב. כאשר הזיהום עולה למערכת השתן העליונה, חולים לפתח pyelonephritis, עם חולשה, חום, צמרמורות, וכאבי גב. יתר על כן, עד 20% מהחולים עם UTI סובלים מזיהומים חוזרים ונשנים וכתוצאה מכך^ירידהדרמטית ברגישות לאנטיביוטיקה 2^,3,4. בשנים האחרונות, יש עניין גובר בטיפולים חדשניים לטיפול ומניעה של UTI חוזר. למרות הבנה טובה יותר של החסינות המולדת וההסתגלותית של דרכי השתן התחתונות ושל גורמי ארס החיידקים הדרושים לפלישה ולקולוניזציה, לא תורגמו שינויים רדיקליים במשטר הטיפול לפרקטיקה האורולוגית היומית². על מנת ללמוד UTI פתוגנזה ורגישות ב vivo, בדיקת שחזור ולא פולשנית היא הכרחית.

מספר דגמי UTI של בעלי חיים תוארו החל נמטודות לפרימטים, אבל מודל מורין משמש בעיקר^5,6. מודל זה מורכב צנתור טרנסאורתרלי של עכברים (נקבה) והטמעה לאחר מכן של השעיה חיידקית, לרוב אורופתיגני Escherichia coli (UPEC), ישירות לתוך לומן שלפוחית השתן⁷. לאחר החיסון, העומס החיידקי כותם באופן מסורתי על ידי קביעת יחידות יוצרות מושבה (CFU). טכניקה זו דורשת הקרבת בעלי חיים כדי להשיג הומוגנטים איברים לאחר המוות ודילול סדרתי, הגבלת תפוקת נתונים ושחזור. יתר על כן, מעקב אורך של עומס חיידקים בבעלי חיים בודדים אינו אפשרי באמצעות טכניקה זו.

בשנת 1995, Contag et al. הציע את השימוש בפתוגנים מתויגים bioluminescent כדי לפקח על תהליכי מחלה בבעלי חיים^8,9. מאז, הדמיית ביולומינציה (BLI) הוחלה על מודלים זיהום רבים כגון דלקת קרום המוח, אנדוקרדיטיס, דלקת מפרקים ניוונית, עור, זיהומים רקמות רכות, וכו^'10,11,12. במודל UTI מורין, זן UPEC עם לוקס אופרון מלא (luxCDABE) מ Photorhabdus luminescens ניתן להשתמש¹³. תגובה אנזימטית מזורזת על ידי לוציפראז חיידקי התלוי בחמצון של אלדהידים ארוכי שרשרת המגיבים עם מונונונוקלאוטיד פלאבין מופחת בנוכחות חמצן, מניב את הפלבין המחומצן, חומצת שומן ארוכת שרשרת ואור¹². לוקס אופרון מקודד עבור לוציפראז ואנזימים אחרים הנדרשים לסינתזה של המצעים. לכן, כל החיידקים הפעילים מטבולית פולטים ברציפות אור ירוק כחול (490 ננומטר) ללא צורך בהזרקת מצע אקסוגני¹². פוטונים הנפלטים מחיידקים מתויגים בלוקסניתנים לצילום באמצעות מצלמות מכשירים רגישים מאוד, מקוררים (CCD).

השימוש בחיידקים ביו-זוהרים במודל עבור UTI מאפשר כימות אורך ולא פולשני של העומס החיידקי, תוך השמטת הצורך בהקרבת בעלי חיים בנקודות זמן קבועות במהלך המעקב אחר קביעת CFU. למרות מגוון רחב של אפשרויות, צובר ראיות לחוסנה של טכניקת BLI זו בתחומים אחרים ויתרונותיה על פני מודלים קלאסיים של UTI, זה לא יושם באופן נרחב במחקר UTI. הפרוטוקול המוצג כאן מספק מדריך מפורט שלב אחר שלב ומדגיש את היתרונות של BLI עבור כל מחקר UTI עתידי.

Protocol

כל הניסויים בבעלי חיים נערכו בהתאם להנחיות מועצת הקהילה של האיחוד האירופי ואושרו על ידי ועדת האתיקה של בעלי החיים של KU Leuven (P158/2018).

1. חיידקי פולחן (מותאם מ^7,13,14)

1. הכנה
   1. בחר זן UPEC זוהר המתאים בצורה הטובה ביותר לצרכים הניסיוניים.
      הערה: כאן, לבודד דלקת שלפוחית השתן הקלינית, UTI89 (E. coli), נבחר בגלל יכולתו האורופתיוגנית הן בבני אדם והן במכרסמים, והשימוש הנפוץ בו במודלים UTI מורינים^5,7,15. זן איזוגני bioluminescent הנושא את לוקס אופרון מלא (luxCDABE) מכונה עוד יותר UTI89-לוקס. אופרון זה נושא גם גנים התנגדות קנאמיצין גופרתי (ק"מ). לכן, ק"מ יכול לשמש לבחירת מושבות ביולומינסנט¹³.
   2. הפוך עקומת מתאם עבור CFU וצפיפות אופטית ב 600 ננומטר (OD 600 ננומטר) עבור זן חיידקי שנבחר⁷.
      1. כדי לעשות זאת, חיידקי תרבית (באמצעות הפרוטוקול להלן) ולעשות 8 דילולים שונים מלוחים חוצץ פוספט (PBS). למדוד את OD ב 600 ננומטר עבור כל דילול אלה צלחת אותם על לוחות לוריא-ברטאני (LB) כדי לקבוע את CFU.
      2. התווה את ערכי OD 600 ננומטר וערכי CFU כדי לקבוע את המתאם ולקבל עקומה סטנדרטית.
         הערה: לניסויים עתידיים, למדוד את OD ב 600 ננומטר ולהשתמש בעקומה סטנדרטית זו כדי לקבל הערכה מיידית של CFU בתמיסה חיידקית.
         זהירות: UPEC הם חיידקים פתוגניים, ודאו שהחדרים מצוידים כראוי והשתמשו בציוד מגן אישי.
2. שלושה ימים לפני ההטמעה
   1. להשיג מושבות בודדות על ידי פסים את מלאי הגליצריל של חיידקים, באמצעות לולאת חיסון, על לוחות LB בתוספת 50 מיקרוגרם / מ"ל ק"מ ותרבות לילה ב 37 °C (57 °F). לאטום את הצלחות האלה עם סרט פרפין לאחסון ב 4 °C (70 °F) עד שבוע אחד.
3. יומיים לפני ההטמעה
   1. מלא צינור תחתון עגול סטרילי 14 מ"ל עם כובעי הצמדה במיקום כפול עם 5 מ"ל של מרק LB בתוספת 50 מיקרוגרם / מ"ל ק"מ. בחר מושבה חיידקית אחת עם לולאת חיסון והוסף את זה למרק LB. מערבולת ל -10 s כדי להבטיח ערבוב נכון.
   2. תרבות סטטית עם כובע הצמדה במצב פתוח ב 37 °C (50 °F) לילה.
      הערה: צמיחה סטטית של E. coli מקדמת את הביטוי של סוג 1-פילי, שהם קריטיים לדבקות לפלישה לתאי אפיתל בדרכי השתן.
   3. הכן ארלנמייר סטרילי או בקבוקון תרבות.
4. יום אחד לפני ההטמעה
   1. לאחר הדגירה, מערבולת הצינור עבור 10 s כדי להבטיח הומוגניזציה נכונה של התרבות החיידקית. הפוך תת-תרבות ב Erlenmeyer על ידי הוספת 25 μL של השעיה חיידקית ל 25 מ"ל של מדיום LB טרי ללא אנטיביוטיקה.
   2. סגור את ארלנמאייר ואת התרבות סטטית ב 37 °C (50 °F) לילה.
5. ביום ההטמעה
   1. מערבולת ארלנמאייר במשך 10 s כדי להבטיח ערבוב נכון.
   2. יוצקים את התרבות מארנמאייר לתוך צינור תרבות 50 מ"ל וצנטריפוגה ב 3,000 x g ו 4 °C (5 °F) במשך 5 דקות. דקאנט סופרנט ו resuspend גלולה חיידקית ב 10 מ"ל של PBS סטרילי ומערבולת שוב עבור 10 s.
   3. בחר את הריכוז הניסיוני של inoculum (CFU) ולהשתמש בעקומה הסטנדרטית המתקבלת בשלב 1.1.2 כדי לקבוע את OD המתאים 600 ננומטר.
   4. הוסף 1 מ"ל של תרבית חיידקים resuspended לתוך 9 מ"ל של PBS סטרילי ולבדוק את OD ב 600 ננומטר. התאם עוד יותר על ידי הוספת PBS סטרילי או פתרון חיידקי מרוכז, עד OD הרצוי 600 ננומטר הוא הגיע⁷.
      הערה: לדוגמה, עבור UTI89-lux להתאים את התרבות על ידי הוספת PBS עד OD 600 ננומטר מגיע 0.45, המתאים 2 x 10⁷ CFU / 50 μL. כדי לאמת את מספר יחידות ה-CFUs קיימא, הכינו דילול טורי פי 10 וצלחת 50 מיקרו-אל של הדילול החמישי והשישי פי 10 על לוחות LB במשולש כדי להשיג פחות מ-300 מושבות. לספור את המושבות המתקבלות למחרת לאחר דגירה לילה ב 37 °C.C. OD 600 ננומטר נותן קריאה מיידית החוצה אבל להשתמש CFU כמו בקרת איכות.

2. חיסון בעלי החיים (מותאם מ^7,16)

1. הכנת בעלי החיים
   1. בחר את זני העכבר הרצויים בהתאם לשאלת המחקר והזמינות של שורות נוק-אאוט, פרטים ניסיוניים והבדלים ברגישות UTI^5,17. זכור כי צנתור טרנסאורתרלי קל יותר בעכברים הנשיים. אין להשתמש בבעלי חיים מתחת לגיל 8 שבועות, מכיוון שהם לא בוגרים מבחינה חיסונית. כאן נעשה שימוש בעכברים C57Bl/6J נקבות בנות 12 שבועות.
   2. להזמין בעלי חיים זמן רב מראש ולתת להם להתאקלם, באופן אידיאלי במשך 7 ימים. בעלי חיים ביתיים קבוצתיים בכלובים מאווררים בנפרד, בתנאים סטנדרטיים של 12 שעות בהירות/חושך.
   3. לגלח את אזור הבטן של בעלי החיים כדי להגביל את אובדן האות. אין להשתמש קרם להסרת שיער, כפי שהוא יכול לשרוף את העור של בעלי החיים במהירות. לרסן את החיה על ידי החזקה הדוקה של הגפיים הקשוחות והגפיים האחוריות עם היד הלא דומיננטית תוך כדי גילוח עם היד הדומיננטית. לחלופין, להתגלח תחת הרדמה איזופלוריין.
      הערה: בעלי חיים גולחו יומיים לפני ההדמיה, בהתחשב בכך שבעלי החיים יטפחו את האזור המגולח עוד יותר.
   4. לספק מים ומזון סטנדרטי ad libitum לאורך כל הניסוי. עם זאת, לשלול בעלי חיים ממים 2 שעות לפני ההטמעה כדי למזער את נפח שלפוחית השתן במהלך ההטמעה.
   5. הר טיפ אנגיוקטטר סטרילי 24 G על מזרק 100 μL ולמלא את המזרק עם פתרון חיידקי מוכן בשלב 1.5.3.
      הערה: כדי לקבוע את luminescence הרקע, לקבל תמונה בסיסית לפני ההטמעה (ראה שלב 3, להלן).
2. הטמעת בעלי החיים
   1. מניחים את בעלי החיים בתא אינדוקציה ומרדים אותם באמצעות שאיפת איזופלוראן עם חמצן טהור כגז נושא (אינדוקציה ב -3% ותחזוקה ב -1.5%).
   2. מניחים חיה אחת על משטח עבודה בתנוחת העל-סף ושומרים על הרדמה איזופלוריין יציבה באמצעות חרוט אף במהלך ההטמעה. החל את משחת העין.
   3. לגרש את השתן שיורית על ידי החלת דחיסה עדינה וביצוע תנועות מעגליות על האזור suprapubic. נקה את הבטן התחתונה עם 70% אתנול לפני ההטמעה.
   4. משמנים את קצה הצנתר עם תמיסת מלח רגילה. שים את האצבע המורה של היד הלא דומיננטית על הבטן ולדחוף אותו בעדינות כלפי מעלה. התחל את הצנתור של השופכה בזווית של 90° (אנכית) וברגע שנתקלים בהתנגדות, הטה אותה אופקית לפני הכנסתה עוד יותר (0.5 ס"מ).
      הערה: לעולם אל תדחוף בכוח את הקטטר, שכן זה יגרום נזק לשופכה. תנועות סיבוב עדינות יכולות לעזור בהחדרת צנתר. מצד שני, חוסר התנגדות בדרך כלל מצביע על החדרה שגויה לתוך הנרתיק.
   5. בצע הטמעה איטית (5 μL/s) של 50 μL של inoculum חיידקי (2 x 10⁷ CFU).
      הערה: נפחים גבוהים יותר או הטמעה מהירה יותר עלולים לגרום ריפלוקס לכליות. במהלך התרגול של הטכניקה, דיו כחול יכול לשמש להערכת ריפלוקס.
   6. לאחר ההטמעה, לשמור על המזרק ואת הצנתר במקום עוד כמה שניות ולאחר מכן לסגת לאט כדי למנוע דליפה. תיעדו אי סדרים כגון כמות גבוהה של דליפה או בשר מדמם ואל תכלול בעלי חיים, במידת הצורך.
   7. מקם את החיה בתנוחה על-חושית בקונוס האף של תא ההדמיה וחזר על השלבים הקודמים 2.1.1-2.1.6 עבור כל בעלי החיים הנותרים. השתמש צנתר אחד לכל קבוצת ניסוי. ודא הרדמה נמשכת ולמזער את הזמן בין החיה הראשונה האחרונה.
   8. במידת הצורך, יש לתת אנטיביוטיקה או תרופות ניסיוניות, לפני או אחרי ההדמיה (שלב 3). לדוגמה, כדי לנהל enrofloxacin, להוסיף 40 μL של אנרופופלוקסצין (100 מ"ג / מ"ל) פתרון 3.96 מ"ל של תמיסת מלח פיזיולוגית כדי לקבל דילול 1/100. הזריק 100 μL/10 גרם תת עורית ב 9 בבוקר ו 5 pm כדי לנהל 10 מ"ג / קילוגרם של enrofloxacin פעמיים ביום במשך 3 ימים.

3. הדמיית ביו-לומינציה

1. הכנה ובחירה של פרמטרי הדמיה
   1. פתח את תוכנת הרכישה שלBLI (ראה טבלת חומרים ) ולחץ על Initialize בהתקן ההדמיה (ראה טבלת חומרים) כדי לבדוק את המצלמה ואת מערכת בקר הבמה ולקרר את מצלמת ה- CCD ל - 90 °C (90 °C).
      הערה: במהלך תהליך זה, הדלת נעולה, וניתן לעקוב אחר התקדמות האתחול בלוח הבקרה. אור ירוק מציין כי הטמפרטורה של -90 °C (50 °F). אזהרה תופיע אם נעשה ניסיון הדמיה לפני השלמת האתחול.
   2. ודא שהנתונים נשמרים באופן אוטומטי: לחץ על שמירה אוטומטית של רכישה ובחר את התיקיה הנכונה.
   3. בחר זוהר וצילום. בדיקת הגדרות ברירת המחדל של ערך: הגדר מסנן עירור למסנן חסימה ופליטה כ'פתח'.
   4. הגדר את זמן החשיפה כ'אוטומטי' בעת צילום התמונה הראשונה, במיוחד כאשר מצפים לאות עמום כדי להבטיח מספר הולם של ספירות פוטון. למדידות ויוו ולאותות בהירים, הגדר את זמן החשיפה ל- ~30s. אם התמונה רוויה, תופיע אזהרה. אם זה קורה, צמצם את זמן החשיפה.
   5. בחר את הבינוני, F / stop 1 ובחר את שדה הראייה הנכון (FOV) (D עבור 5 בעלי חיים).
   6. הגדר את גובה הנושא ל- 1 ס"מ בעת הדמיית עכברים.
   7. לחץ על הוסף שלוש פעמים בלוח הבקרה של הרכישה כדי להשיג רצף של שלוש תמונות, כשכפול טכני.
2. דימות
   1. מניחים עכברים בתא ההדמיה בתנוחת הסופים ומשתמשים בקונוס האף המגוזר כדי לשמור על הרדמה (איזופלוריין 1.5%) לאורך כל הניסוי. תמונה עד 5 עכברים בו זמנית ולהפריד את בעלי החיים באמצעות בלבל האור כדי למנוע השתקפות.
   2. סגור את הדלת ולחץ על רכוש כדי להתחיל את רצף ההדמיה.
   3. מלאו מידע מפורט על הניסוי (חיות מסוג בר ונוקאאוט, טיפולים, יום הדמיה וכו '). הגדרות ההדמיה, כגון זמן חשיפה, נשמרות באופן אוטומטי.
   4. מוציאים עכברים מתא ההדמיה ומחזירים אותם לכלוב שלהם. בדוק את ההחלמה המלאה לאחר הרדמה. בתוך דקות, בעלי החיים צריכים להיות ערים לחלוטין וחקרניים. אין לספק שך ים מכיוון שהדבר עלול להפריע לקורס UTI¹⁸.
   5. החזר את הכלובים למדפיים המאווררים עד מחזור ההדמיה הבא. לאחר השלמת הניסוי, להרדים את בעלי החיים על ידי חנק CO₂ או נקע צוואר הרחם. לעשות זאת לפני ההתאוששות של הרדמה איזופלוריין כדי למזער את המצוקה.
3. ניתוח התמונות
   1. הפעל את תוכנת ההדמיה וטען את הקובץ הניסיוני על ידי לחיצה על עיון.
   2. השתמשו בלוח הכלים להתאמת סרגל הצבעים של התמונה. תקן את ההיבט החזותי של התוצאות באמצעות אותן הגדרות עבור כל התמונות, כלומר, השתמש בקנה מידה לוגריתמי עם מינימום של 10⁴ עד למקסימום של 10⁷ פוטונים. התאמות אלה אינן משפיעות על הנתונים הגולמיים אלא רק על המצגת הגרפית.
   3. השתמש בכלי ROI כדי לצייר אזור עניין (ROI) בתמונה. ודאו שההמחיר על תנאי גדול מספיק כדי לכסות את האזור המלא ולהשתמש באותם ממדים עבור כל התמונות. כאן, ROI מרובע של 3.5 ס"מ x 4.5 ס"מ הונח מעל הבטן התחתונה.
   4. לחץ על מדידת ROI כדי לכמת את עוצמת האור (ספירה או שטף פוטון מוחלט). יצא נתונים אלה והשתמש בממוצע המשכפלים הטכניים.
      הערה: ספירות מייצגות את מספר הפוטונים שזוהו על-ידי המצלמה ויש להשתמש בהן רק לבקרת איכות התמונה. כדי לדווח על נתונים, השתמש בשטף פוטון מוחלט. שטף פוטון כולל רלוונטי יותר מבחינה פיזיולוגית מכיוון שהוא מייצג את האור הנפלט מפני השטח והוא יחידה מכוילת, אשר מתוקנת לזמן החשיפה (לשנייה).

תוצאות

In vivo BLI מתואם עם CFU של האינוקולום בזמן ההטמעה.
כדי להעריך את מגבלת הזיהוי של BLI in vivo ואת המתאם עם CFU של inoculum, עכברים נדבקו בריכוזים שונים של UTI89-לוקס ו- PBS כשליטה שלילית. לפני ההטמעה, בעלי חיים לא נגועים נסרקו כדי לקבוע את זוהר הרקע. התמונות הבאות התקבלו מיד לאח?...

Discussion

היתרונות של BLI בהשוואה לספירת CFU
נתוני אורך
חיסרון מרכזי בשיטה המסורתית של ספירת CFU כדי לכמת את הנטל המיקרוביאלי הוא הדרישה של הומוגנטים איברים לאחר המוות, מתן נקודת נתונים חתך אחת בלבד לכל חיה. לעומת זאת, BLI מאפשר מעקב אורך לא פולשני של בעלי חיים נגועים. ניתן לדמיין את בעלי ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well Black Flat Bottom Polystyrene Plate	Corning	3925	for in vitro imaging
Aesculap ISIS	Aesculap	GT421	hair trimmer, with GT608 cap
Anesthesia vaporizer	Harvard apparatus limited	N/A	https://www.harvardapparatus.com/harvard-apparatus-anesthetic-vaporizers.html
Baytril 100 mg/mL	Bayer	N/A	Enrofloxacin
BD Insyte Autoguard 24 GA	BD	382912	Yellow angiocatheter, use sterile plastic tip for instillation
C57Bl/6J mice	Janvier	N/A
Centrifuge 5804R	Eppendorf	EP022628146
Dropsense 16	Unchained Labs	Trinean	to measure OD 600nm
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, Gibco	ThermoFisher Scientific	REF 14040-083
Ethanol 70% denaturated 5L	VWR international	85825360
Falcon 14ml Round Bottom Polystyrene Tube, Snap-Cap	Corning	352057
Falcon 50ml cellstart	Greiner	227285
Hamilton GASTIGHT syringe, PTFE luer lock, 100 µL	Sigma-Aldrich	26203	to ensure slow bacterial instillation of 50 µL
Inoculation loop	Roth	6174.1	holder: Art. No. 6189.1
Iso-Vet 1000mg/g	Dechra Veterinary products	N/A	Isoflurane
IVIS Spectrum In Vivo Imaging System	PerkinElmer	REF 124262	imaging device
Kanamycine solution 50 mg/mL	Sigma-Aldrich	CAS 25389-94-0
Living Imaging Software	PerkinElmer	N/A	BLI acquisition software, version 4.7.3
Luria Bertani Broth	Sigma-Aldrich	REF L3022	alternatively can be made
Luria Bertani Broth with agar	Sigma-Aldrich	REF L2897	alternatively can be made
Petri dish Sterilin 90mm	ThermoFisher Scientific	101VR20	to fill with LB agar supplemented with Km
Pyrex Culture flask 250 mL	Sigma-Aldrich	SLW1141/08-20EA
Slide 200 Trinean	Unchained Labs	701-2007	to measure OD 600nm
UTI89-lux	N/A	N/A	Generous gift from Prof. Seed
Vortex	VWR international	444-1372