生物発光イメージングを用いたマウスにおける尿路感染症の縦方向のフォローアップとその治療

要約

本稿では、生体発光イメージングを用いた細菌負荷の解析とその後の縦方向インビボ解析を行うルクスオペロンを用いた泌尿器内細菌の脳内投与について説明する。

要約

尿路感染症(UTI)は、ヒトで最も一般的な細菌感染症の中でランク付けされ、日常的に経験的抗生物質で治療されています。しかし、微生物耐性の増加により、最も使用される抗生物質の効力は低下している。代替治療オプションを見つけるためには、UTIの病因とUTI感受性を決定するメカニズムをよりよく理解する必要があります。これを動物モデルで調べるには、UTIの経過を研究するための再現性のある非侵襲的なアッセイが不可欠である。

何年もの間、細菌負荷の列挙のためのゴールドスタンダードは、特定のサンプル体積のコロニー形成単位(CFU)の決定であった。この技術は 、事後臓器 の均質化と連続希釈を必要とし、データ出力と再現性を制限する。代替として、生物発光イメージング(BLI)は、細菌の負荷を決定するために人気を集めています。 ルクス オペロンで病原体を標識することで、非侵襲的な方法での感受性検出と定量を可能にし、それによって縦方向のフォローアップを可能にする。これまでのところ、UTI研究におけるBLIの採用は依然として限られています。

本稿では、マウス尿路感染モデルにおけるBLIの実用的な実施について説明する。ここでは、細菌を培養するためのステップバイステップガイド、脳内吸込みおよびイメージングが提供される。CFUと の生体内 相関を調べ、抗生物質処理動物と未感染動物の細菌負荷を比較することによって概念実証を提供する。さらに 、in vivo UTI モデルにおける BLI の実装に特有の利点、制限、および考慮事項について説明します。UTI研究分野におけるBLIの導入は、UTIの病因とUTIの予防・治療方法の発見に関する研究を大きく促進します。

概要

尿路感染症(UTI)は、ヒトで最も一般的な細菌感染症の一つです。全女性のほぼ半数が生涯に対して症状のUTIを経験する¹.膀胱に限られた感染症は、尿頻度の増加、緊急性、血尿、失禁、痛みなどの尿症状を引き起こす可能性があります。感染が上部尿路に上昇すると、患者は倦怠感、発熱、悪寒、背中の痛みで腎盂腎炎を発症する。さらに、UTI患者の最大20%が再発性感染症に苦しむことで、抗生物質感受性^2、3、4が劇的に低下する。近年、再発性UTIの治療・予防に対する新しい治療法への関心が高まっています。下尿路の先天的および適応的免疫と、浸潤および植民地化に必要な細菌毒性因子の理解が良いにもかかわらず、治療体制における根本的な変化は毎日の泌尿器科的実践²に翻訳されていない。生体内でUTIの病因と感受性を研究するためには、再現性と非侵襲的なアッセイが不可欠です。

複数の動物のUTIモデルは線虫から霊長類までまで記述されてきたが、マウスモデルは主に^5,6を用いる。このモデルは、(雌)マウスの経尿道カテーテル法及びそれに続く細菌懸濁液の植え付け、最も一般的には尿病性大腸菌(UPEC)からなる、膀胱管腔⁷に直接入る。接種後、細菌負荷は、コロニー形成単位(CFU)を決定することによって伝統的に定量化されてきた。この技術は、死後の臓器の均質化および連続希釈を得るために動物を犠牲にする必要があり、データ出力および再現性を制限する。また、個々の動物における細菌負荷の縦方向のフォローアップは、この技術を用いることは不可能である。

1995年、Tagtagらは生きている動物の病気プロセスを監視するために生物発光タグ付き病原体の使用を示唆^した8,9.それ以来、髄膜イメージング(BLI)は、髄膜炎、心内膜炎、骨髄炎、皮膚、軟部組織感染症などの多数の感染モデルに適用^{されてきた。}マウスUTIモデルでは、フォトルフドゥス・ルミネセンスから完全なルクス・オペロン(luxCDABE)を有するUPEC株を¹³個使用することができる。酵素反応は、酸素の存在下で還元フラビンモノヌクレオチドと反応する長鎖アルデヒドの酸化に依存する細菌ルシファーゼによって触媒され、酸化フラビン、長鎖脂肪酸及び光¹²を生じる。ルクスオペロンは、基質の合成に必要なルシファーゼおよび他の酵素をコードする。したがって、全ての代謝活性菌は、外因性基質¹²の注入を必要とせずに青色緑色(490nm)の光を連続的に放出する。ルクスタグ付き細菌によって放出される光子は、非常に敏感で冷却された電荷結合装置(CCD)カメラを使用して捕獲することができる。

UTIのモデルでの生物発光細菌の使用は、CFU決定のためのフォローアップ中に一定の時点で動物を犠牲にする必要性を省略し、細菌負荷の縦方向、非侵襲的な定量を可能にする。可能性の広い範囲にもかかわらず、他の分野でのこのBLI技術の堅牢性とUTIの古典的なモデルよりもその利点のための証拠を蓄積し、それは広くUTI研究で実装されていません。ここで紹介するプロトコルは、詳細なステップバイステップガイドを提供し、将来のUTI研究におけるBLIの利点を強調しています。

プロトコル

すべての動物実験は、欧州連合共同体理事会のガイドラインに従って実施され、KUルーヴェンの動物倫理委員会(P158/2018)によって承認されました。

1. 細菌の培養⁽⁷から適応^,13,14)

1. 準備
   1. 実験ニーズに最も適した発光UPEC株を選択してください。
      注:ここでは、臨床膀胱炎分離株、UTI89(大腸菌)は、ヒトとげっ歯類の両方における泌尿器病能力、およびマウスUTIモデル^5、7、15での一般的な使用のために選択された。完全なルクスオペロン(luxCDABE)を運ぶ生物発光アイソジェニック株は、UTI89-ルクスといいます。このオペロンは、カナマイシン硫酸塩(Km)耐性遺伝子も運びます。従って、Kmは生物発光コロニー¹³を選択するために使用することができる。
   2. 選択した細菌株⁷に対して600ナノメートル(OD 600 nm)でCFUと光学密度の相関曲線を作る。
      1. これを行うには、培養細菌(下記のプロトコルを使用して)、リン酸緩衝生理食塩分(PBS)で8種類の希釈液を作る。これらの希釈液の600 nmでODを測定し、CFUを決定するためにルリア・ベルタニ(LB)プレートにプレートします。
      2. OD 600 nm 値と CFU 値をプロットして、相関を決定し、標準曲線を取得します。
         注: 今後の実験では、600 nm で OD を測定し、この標準曲線を使用して、細菌溶液中の CFU の即時推定を取得します。
         注意:UPECは病原性細菌であり、部屋が適切に装備されていることを確認し、個人的な保護具を使用してください。
2. 植え付けの3日前
   1. 50 μg/mL Kmを補ったLBプレート上で、細菌のグリセロールストックをストリークアウトし、37°Cで一晩培養することにより、単一コロニーを得る。 これらのプレートをパラフィンフィルムで密封し、4°Cで1週間保存します。
3. 点え込む2日前
   1. 50 μg/mL Kmで補われたLBスープの5 mLを備えたデュアルポジションスナップキャップで無菌14 mLポリスチレンラウンドボトムチューブを充填します。10 sの渦は、適切な混合を確保する。
   2. 一晩37°Cで開いた位置にスナップキャップを静かに培養する。
      注: 大腸菌 の静的成長は、尿上皮細胞の付着および浸潤に不可欠な1型ピリの発現を促進する。
   3. 無菌のエルレンマイヤーまたは培養フラスコを準備します。
4. 1日前に、植え付け
   1. インキュベーション後、チューブを10sに対してボルテックスし、細菌培養物の適切な均質化を確実にする。抗生物質を使わずに25mLの新鮮なLB培地に細菌懸濁液の25 μLを加えて、エルレンマイヤーでサブカルチャーを作ります。
   2. 一晩で37°Cで静にアーレンマイヤーと培養を閉じます。
5. 日に、植え付け
   1. 正しい混合を確実にするために10 sのためのエルレンマイヤーを渦。
   2. 50 mLの培養管に、遠心分離器に50mLの培養液を注ぎ、5分間は3,000 x g、4°Cで遠心分離します。上清をデカントし、10sの滅菌PBSと渦の10 mLで細菌ペレットを再懸濁する。
   3. 接種物(CFU)の実験濃度を選択し、ステップ1.1.2で得られた標準曲線を使用して、対応するOD 600 nmを決定します。
   4. 再懸濁された細菌培養液の1 mLを9 mLの無菌PBSに加え、600 nmでODを確認します。滅菌PBSまたは濃縮細菌溶液のいずれかを加えて、所望のOD 600 nmが⁷に達するまでさらに調整する。
      注:例えば、UTI89-ルクス の場合、OD 600 nmが0.45に達するまでPBSを加えて培養を調整し、2 x 10⁷ CFU/50 μLに対応します。生き生きとしたCFUsの数を確認するには、LBプレートの5番目と6番目の10倍の希釈液の10倍の連続希釈液とプレート50μLを300未満のコロニーを得るようにします。得られたコロニーを37°Cでの一晩のインキュベートの翌日に数え、OD 600 nmは即座に読み出すが、品質管理としてCFUを使用する。

2. 動物の接種^(7,16から適応)

1. 動物の準備
   1. ノックアウトラインの研究問題と利用可能性、実験の詳細、UTI感受性^5、17の違いに応じて、目的のマウス株を選択してください。経尿道カテーテル法は雌マウスの方が簡単です。8週未満の動物は免疫学的に未熟であるため、使用しないでください。ここでは、12週齢の雌のC57Bl/6Jマウスを使用した。
   2. 動物を事前に注文し、理想的には7日間順応させてください。グループハウス動物は、標準的な12時間の明暗条件下で、個別に換気されたケージに入れられます。
   3. 動物の腹部を剃って信号の損失を制限する。それはすぐに動物の皮膚を燃やすことができるので、脱毛クリームを使用しないでください。支配的な手で剃りながら、不器用な手足と後肢を非支配的な手でしっかりと握って動物を拘束します。あるいは、イオブルラン麻酔下で剃る。
      注:動物は、動物がさらに剃った領域をグルーミングすることを考慮して、イメージングの2日前に剃られました。
   4. 実験全体を通して水と標準的な食品 のアドリビタム を提供します。しかし、植物を2時間前に水から奪い、植え付け時の膀胱容積を最小限に抑える。
   5. 滅菌24Gアンジオカテーテル先端を100μLシリンジに取り付け、ステップ1.5.3で調製した細菌溶液でシリンジを充填します。
      注: 背景の発光を確認するには、点光の前にベースライン イメージを取得します(下記の手順 3 を参照)。
2. 動物の植え付け
   1. 誘導室に動物を入れ、純粋な酸素を用いたイソフルランをキャリアガスとして吸入して麻酔をします(3%で誘導し、1.5%で維持します)。
   2. 1匹の動物を滑者の位置に作業面に置き、点鼻コーンを使用して安定したイソファラン麻酔を維持します。目軟膏を適用します。
   3. 穏やかな圧縮を適用し、上皮領域に円形の動きをすることによって残りの尿を排出します。下腹部を70%エタノールで洗浄してから、植え付けする前に洗浄してください。
   4. カテーテル先端を通常の生理食塩水で潤滑します。非支配的な手の人差し指を腹部に置き、そっと上に押します。尿道のカテーテル法を90°の角度(垂直)で開始し、抵抗に遭遇したら、さらに(0.5cm)挿入する前に水平に傾けます。
      注意:これは尿道に害を引き起こすので、強制的にカテーテルを押すことはありません。穏やかな旋回の動きはカテーテル挿入で役立つ。一方、抵抗力の欠如は、通常、膣への誤挿入を示す。
   5. 細菌の接種物(2 x 10⁷ CFU)の50 μLの遅い(5 μL/秒)の植え付けを行います。
      注:より高い体積または速い点込は腎臓に逆流を引き起こす可能性があります。この技術の練習中に、青色インクを使用して還流を評価することができます。
   6. 点水後、注射器とカテーテルを数秒間所定の位置に保ち、漏れを防ぐためにゆっくりと引き込みます。大量の漏れや血まみれの肉などの不規則性を記録し、必要に応じて動物を除外します。
   7. 動物を画像チャンバーの鼻コーンに位置合わせし、残りのすべての動物について前のステップ2.1.1-2.1.6を繰り返します。実験グループごとに1カテーテルを使用してください。麻酔が継続されることを確認し、最初と最後の動物の間の時間を最小限に抑えます。
   8. 必要に応じて、画像化の前または後に、抗生物質または実験薬を投与する(ステップ3)。例えば、エンロフロキサシンを投与するには、40μLのエンロフロキサシン(100mg/mL)溶液を3.96mLの生理食塩水に加えて、1/100希釈を得る。100 μL/10 g を皮下に 9 時と午後 5 時に注入し、10 mg/kg のエンロフロキサシンを1日2回3日間投与します。

3. 生物発光イメージング

1. イメージングパラメータの準備と選択
   1. BLI取得ソフトウェア( 材料表を参照)を開き、イメージングデバイスの初期化( 材料表を参照)をクリックして、カメラとステージコントローラシステムをテストし、CCDカメラを-90°Cに冷却します。
      メモ:このプロセスの間、ドアはロックされ、初期化の進捗状況はコントロールパネルで続けることができます。緑色のライトは-90°Cの温度に達したことを示します。初期化が完了する前にイメージングを試行すると、警告が表示されます。
   2. データが自動的に保存されることを確認する: 取得の[自動保存]を クリックして、正しいフォルダを選択します。
   3. [発光と写真] を選択します。既定の発光設定を確認する: 励振フィルタをブロックに設定し、放出フィルタを[開く] に設定します。
   4. 最初の画像を撮影する場合は、特に光数の適切な数を確保するために暗い信号を期待する場合は、露出時間を Auto に設定します。 インビボ 測定と明るい信号の場合は、 露光時間 を~30 sに設定します。画像が飽和状態の場合は、警告が表示されます。この場合は、露出時間を短縮してください。
   5. 中ビン 、F/ストップ 1を選択し、正しい視野(FOV)(5匹の動物の場合はD)を選択します。
   6. マウスを撮像する際の 被写体の高さを 1cmに設定します。
   7. 取得コントロール パネルで[3回追加] をクリックして、技術的な複製として 3 つのイメージのシーケンスを取得します。
2. イメージング
   1. マウスを画像チャンバーの位置に置き、マニホールドノーズコーンを使用して麻酔(イゾフルラン1.5%)を実験全体で維持します。最大5匹のマウスを同時に画像化し、反射を防ぐために光バッフルを使用して動物を分離します。
   2. ドアを閉じて[ 取得] をクリックして、イメージングシーケンスを開始します。
   3. 実験に関する詳細情報(野生型やノックアウト動物、治療、撮影日など)を記入してください。露光時間などのイメージング設定は自動的に保存されます。
   4. マウスをイメージングチャンバーから取り出し、ケージに戻します。麻酔後の完全回復を確認してください。数分以内に、動物は完全に目を覚まし、探索的でなければなりません。これはUTIコース¹⁸に干渉する可能性があるため、鎮痛を提供しないでください。
   5. 次のイメージングサイクルまで、ケージを換気されたラックに戻します。実験終了後_、CO2 窒息または頸椎脱臼により動物を安楽死させる。イオブルラン麻酔の回復前にこれを行い、苦痛を最小限に抑えます。
3. 画像の分析
   1. イメージングソフトウェアを起動し、実験ファイルをロードするには、[ 参照]をクリックします。
   2. ツール パレット を使用して、イメージのカラー スケールを調整します。すべての画像に同じ設定を使用して結果の視覚的な側面を標準化する、すなわち、10^4~ 最大10⁷ 光子の対数スケールを使用します。これらの調整は生データに影響を与えるのではなく、グラフィカルな表示にのみ影響します。
   3. ROI ツールを使用して、画像に関心領域 (ROI) を描画します。ROIが完全な領域をカバーするのに十分な大きさであることを確認し、すべての画像に同じ寸法を使用します。ここでは、下腹部に3.5cm x 4.5cmの正方形のROIを配置した。
   4. ROI 測定をクリックして、光強度(カウントまたは総光束)を定量化します。これらのデータをエクスポートし、技術複製の平均を使用します。
      注: カウントは、カメラによって検出されたフォトンの数を表し、画像の品質管理にのみ使用する必要があります。データをレポートするには、総フォトンフラックスを使用します。総光子束は、表面から放出される光を表し、較正された単位であるため、より生理学的に関連しており、これは露光時間(毎秒)に対して修正される。

結果

インビボ BLIは、インスティレーション時のインノキュラムのCFUと相関する。
生体内でのBLIの検出限界および接種のCFUとの相関を評価するために、マウスは陰性対照としてUTI89−ルクスおよびPBSの異なる濃度で感染した。植え付けの前に、未感染動物をスキャンして、バックグラウンド発光を決定した。その後の画像は、即時の後の植え付け(

ディスカッション

CFUカウントと比較したBLIの利点
縦方向データ
CFUを数えて微生物の負担を定量化する伝統的な方法の大きな欠点は、 死後 の臓器ホモジナートの要件であり、動物1人につき1つの断面データポイントのみを提供する。逆に、BLIは、感染した動物の非侵襲的な縦方向のフォローアップを可能にする。動物は1日2〜3回画像化することができ、感染の運動に関する詳細な洞察?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well Black Flat Bottom Polystyrene Plate	Corning	3925	for in vitro imaging
Aesculap ISIS	Aesculap	GT421	hair trimmer, with GT608 cap
Anesthesia vaporizer	Harvard apparatus limited	N/A	https://www.harvardapparatus.com/harvard-apparatus-anesthetic-vaporizers.html
Baytril 100 mg/mL	Bayer	N/A	Enrofloxacin
BD Insyte Autoguard 24 GA	BD	382912	Yellow angiocatheter, use sterile plastic tip for instillation
C57Bl/6J mice	Janvier	N/A
Centrifuge 5804R	Eppendorf	EP022628146
Dropsense 16	Unchained Labs	Trinean	to measure OD 600nm
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, Gibco	ThermoFisher Scientific	REF 14040-083
Ethanol 70% denaturated 5L	VWR international	85825360
Falcon 14ml Round Bottom Polystyrene Tube, Snap-Cap	Corning	352057
Falcon 50ml cellstart	Greiner	227285
Hamilton GASTIGHT syringe, PTFE luer lock, 100 µL	Sigma-Aldrich	26203	to ensure slow bacterial instillation of 50 µL
Inoculation loop	Roth	6174.1	holder: Art. No. 6189.1
Iso-Vet 1000mg/g	Dechra Veterinary products	N/A	Isoflurane
IVIS Spectrum In Vivo Imaging System	PerkinElmer	REF 124262	imaging device
Kanamycine solution 50 mg/mL	Sigma-Aldrich	CAS 25389-94-0
Living Imaging Software	PerkinElmer	N/A	BLI acquisition software, version 4.7.3
Luria Bertani Broth	Sigma-Aldrich	REF L3022	alternatively can be made
Luria Bertani Broth with agar	Sigma-Aldrich	REF L2897	alternatively can be made
Petri dish Sterilin 90mm	ThermoFisher Scientific	101VR20	to fill with LB agar supplemented with Km
Pyrex Culture flask 250 mL	Sigma-Aldrich	SLW1141/08-20EA
Slide 200 Trinean	Unchained Labs	701-2007	to measure OD 600nm
UTI89-lux	N/A	N/A	Generous gift from Prof. Seed
Vortex	VWR international	444-1372