Продольное наблюдение за инфекциями мочевыводящих путей и их лечение у мышей с использованием биолюминесцентной визуализации

Резюме

В данной рукописи описывается внутрипузырное введение уропатогенных бактерий с помощью люкс-оперона для индуцирования инфекции мочевыводящих путей у мышей и последующий продольный in vivo анализ бактериальной нагрузки с использованием биолюминесцентной визуализации.

Аннотация

Инфекции мочевыводящих путей (ИМП) относятся к числу наиболее распространенных бактериальных инфекций у людей и обычно лечатся эмпирическими антибиотиками. Однако из-за повышения микробной резистентности эффективность наиболее часто используемых антибиотиков снизилась. Чтобы найти альтернативные варианты лечения, существует большая потребность в лучшем понимании патогенеза ИМП и механизмов, определяющих восприимчивость к ИМП. Чтобы исследовать это на животной модели, необходим воспроизводимый, неинвазивный анализ для изучения течения ИМП.

В течение многих лет золотым стандартом для перечисления бактериальной нагрузки было определение колониеобразующих единиц (КОЕ) для конкретного объема образца. Этот метод требует посмертных гомогенатов органов и последовательных разбавлений, ограничивая вывод данных и воспроизводимость. В качестве альтернативы набирает популярность биолюминесцентная визуализация (BLI) для определения бактериальной нагрузки. Маркировка патогенов с помощью люкс-оперона позволяет осуществлять чувствительное обнаружение и количественную оценку неинвазивным способом, тем самым обеспечивая продольное наблюдение. До сих пор принятие BLI в исследованиях ИМП остается ограниченным.

Эта рукопись описывает практическую реализацию BLI в мышиной модели инфекции мочевыводящих путей. Здесь приведено пошаговое руководство по культивированию бактерий, внутрипузырной инстилляции и визуализации. Исследуется корреляция in vivo с КОЕ и обеспечивается доказательство концепции путем сравнения бактериальной нагрузки необработанных инфицированных животных с животными, обработанными антибиотиками. Кроме того, обсуждаются преимущества, ограничения и соображения, характерные для реализации BLI в модели in vivo UTI. Внедрение BLI в области исследований ИМП значительно облегчит исследования патогенеза ИМП и открытие новых способов профилактики и лечения ИМП.

Введение

Инфекции мочевыводящих путей (ИМП) являются одними из наиболее распространенных бактериальных инфекций у людей. Почти половина всех женщин будут испытывать симптоматическую ИМП в течение своей жизни^1. Инфекции, ограниченные мочевым пузырем, могут привести к мочевым симптомам, таким как увеличение частоты мочеиспускания, срочность, гематурия, недержание мочи и боль. Когда инфекция поднимается в верхние мочевые пути, у пациентов развивается пиелонефрит, с недомоганием, лихорадкой, ознобом и болями в спине. Кроме того, до 20% пациентов с ИМП страдают от рецидивирующих инфекций, что приводит к резкому снижению чувствительности к антибиотикам^2,3,4. В последние годы наблюдается растущий интерес к новым методам лечения и профилактики рецидивирующих ИМП. Несмотря на лучшее понимание врожденного и адаптивного иммунитета нижних мочевых путей и факторов бактериальной вирулентности, необходимых для инвазии и колонизации, никаких радикальных изменений в режиме лечения не было переведено в ежедневную урологическую практику^2. Для изучения патогенеза ИМП и восприимчивости in vivoнеобходим воспроизводимый и неинвазивный анализ.

Было описано несколько моделей ИМП на животных, начиная от нематод и заканчивая приматами, но мышиная модель преимущественно используется^5,6. Эта модель состоит из трансуретральной катетеризации (самок) мышей и последующей инстилляции бактериальной суспензии, чаще всего уропатогенной кишечной палочки (УПЭК), непосредственно в просвет мочевого пузыря^7. После инокуляции бактериальная нагрузка традиционно количественно определяется путем определения колониеобразующих единиц (КОЕ). Этот метод требует жертвоприношения животных для получения посмертных гомогенатов органов и последовательных разведений, ограничивая вывод данных и воспроизводимость. Кроме того, продольное наблюдение за бактериальной нагрузкой у отдельных животных невозможно с использованием этой методики.

В 1995 году Contag etal. предложили использовать биолюминесцентно-меченые патогены для мониторинга процессов заболевания у живых животных^8,9. С тех пор биолюминесцентная визуализация (BLI) была применена к многочисленным моделям инфекций, таким как менингит, эндокардит, остеомиелит, инфекции кожи и мягких тканей и т. Д.^10,11,12. В мышиной модели ИМП может быть использован штамм УПЭК с полным люкс-опероном (luxCDABE)от Photorhabdus luminescens ^13. Ферментативная реакция катализируется бактериальной люциферазой, которая зависит от окисления длинноцепочечных альдегидов, реагирующих с восстановленным мононуклеотидом флавина в присутствии кислорода, в результате чего образуется окисленный флавин, длинноцепочечная жирная кислота и свет^12. Люкс оперон кодирует люциферазу и другие ферменты, необходимые для синтеза субстратов. Поэтому все метаболически активные бактерии будут непрерывно излучать сине-зеленый (490 нм) свет без необходимости введения экзогенного субстрата^12. Фотоны, испускаемые бактериями сметками люкс, могут быть захвачены с помощью высокочувствительных камер с охлаждаемой связью с зарядом (CCD).

Использование биолюминесцентных бактерий в модели ИМП позволяет проводить продольную, неинвазивную количественную оценку бактериальной нагрузки, исключая необходимость жертвоприношения животных в фиксированные моменты времени во время последующего наблюдения за определением КОЕ. Несмотря на широкий спектр возможностей, аккумулирующих доказательств надежности данной методики МПЖ в других областях и ее преимущества перед классическими моделями ИМП, она не получила широкого применения в исследованиях ИМП. Протокол, представленный здесь, предоставляет подробное пошаговое руководство и подчеркивает преимущества BLI для всех будущих исследований ИМП.

протокол

Все эксперименты на животных проводились в соответствии с руководящими принципами Совета Сообщества Европейского Союза и были одобрены Комитетом по этике животных KU Leuven (P158/2018).

1. Культивирование бактерий (адаптировано из^7,13,14)

1. Подготовка
   1. Выберите люминесцентный штамм UPEC, который наилучшим образом соответствует экспериментальным потребностям.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь был выбран клинический изолят цистита, UTI89(E. coli),из-за его уропатогенной способности как у людей, так и у грызунов, и его общего использования в мышиных моделях ИМП^5,7,15. Биолюминесцентный изогенный штамм, несущий полный люкс-оперон (luxCDABE),далее упоминается как UTI89-lux. Этот оперон также несет гены устойчивости к сульфату канамицина (Km). Поэтому Км можно использовать для отбора биолюминесцентных колоний^13.
   2. Сделайте корреляционную кривую для КОЕ и оптической плотности в 600 нанометров (OD 600 нм) для выбранного бактериального штамма^7.
      1. Для этого культивируют бактерии (используя приведенный ниже протокол) и делают 8 различных разведений в фосфатно-буферном физиологическом растворе (PBS). Измерьте OD при 600 нм для всех этих разбавлений и нанесите их на пластины Luria-Bertani (LB), чтобы определить КОЕ.
      2. График значений OD 600 нм и значений КОЕ для определения корреляции и получения стандартной кривой.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Для будущих экспериментов измерьте OD при 600 нм и используйте эту стандартную кривую, чтобы получить мгновенную оценку КОЕ в бактериальном растворе.
         ВНИМАНИЕ: УПЭК являются патогенными бактериями, обеспечивают надлежащее оснащение помещений и используют средства индивидуальной защиты.
2. За три дня до закапывания
   1. Получают одиночные колонии, вытирая запасы глицерина бактерий с помощью петли прививки на пластинах LB, дополненных 50 мкг/мл км, и культивируют в течение ночи при 37 °C. Запечатайте эти пластины парафиновой пленкой для хранения при 4 °C до 1 недели.
3. За два дня до закапывания
   1. Наполните стерильную 14 мл полистирольной трубки круглого дна двухпозиционными защелками с 5 мл бульона LB, дополненного 50 мкг / мл км. Выберите одну бактериальную колонию с помощью петли инокуляции и добавьте ее в бульон LB. Вихрь в течение 10 с для обеспечения правильного перемешивания.
   2. Процедить статически с защелкой в открытом положении при 37 °C в течение ночи.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Статический рост кишечной палочки способствует экспрессии 1-пили типа, которые имеют решающее значение для прилипания и инвазии эпителиальных клеток мочевыводящих путей.
   3. Приготовьте стерильный эрленмейер или колбу для культивирования.
4. За день до инстилляции
   1. После инкубации вращайте трубку в течение 10 с, чтобы обеспечить надлежащую гомогенизацию бактериальной культуры. Сделайте субкультуру в Эрленмейере, добавив 25 мкл бактериальной суспензии к 25 мл свежей среды LB без антибиотиков.
   2. Закройте эрленмейер и процедите статически при температуре 37 °C в течение ночи.
5. В день инстилляции
   1. Вихрь Эрленмейера в течение 10 с для обеспечения правильного перемешивания.
   2. Перелейте культуру из Эрленмейера в культуральную трубку 50 мл и центрифугу при 3000 х г и 4 °C в течение 5 мин. Декантировать супернатант и повторно суспендировать бактериальную гранулу в 10 мл стерильного PBS и снова вихрь в течение 10 с.
   3. Выберите экспериментальную концентрацию инокулята (КОЕ) и используйте стандартную кривую, полученную на шаге 1.1.2, для определения соответствующего OD 600 нм.
   4. Добавьте 1 мл повторно суспендированной бактериальной культуры в 9 мл стерильного PBS и проверьте OD на 600 нм. Далее корректируют, добавляя либо стерильный PBS, либо концентрированный бактериальный раствор, пока желаемый OD 600 нм не будет достигнут^7.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Например, для UTI89-lux отрегулируйте культуру, добавив PBS до тех пор, пока OD 600 нм не достигнет 0,45, что соответствует 2 x 10⁷ КОЕ/50 мкл. Чтобы проверить количество жизнеспособных КОЕ, сделайте 10-кратное последовательное разведение и пластину 50 мкл пятого и шестого 10-кратного разведения на пластинах LB в трех экземплярах для получения менее 300 колоний. Подсчитайте полученные колонии на следующий день после ночной инкубации при 37 °C. OD 600 нм дает мгновенное считывание, но используйте КОЕ в качестве контроля качества.

2. Прививка животных (адаптирована из^7,16)

1. Подготовка животных
   1. Выберите желаемый штамм (штаммы) мыши в зависимости от исследовательского вопроса и наличия нокаут-линий, экспериментальных деталей и различий в восприимчивости к ИМП^5,17. Имейте в виду, что трансуретральная катетеризация легче у самок мышей. Не используйте животных моложе 8 недель, так как они иммунологически незрелые. Здесь использовались 12-недельные самки мышей C57Bl/6J.
   2. Заказывайте животных заранее и дайте им акклиматизироваться, в идеале в течение 7 дней. Группируйте домашних животных в индивидуально вентилируемых клетках, в стандартных 12-часовых условиях света/темноты.
   3. Побрейте брюшную область животных, чтобы ограничить потерю сигнала. Не используйте крем для удаления волос, так как он может быстро обжечь кожу животных. Удерживайте животное, крепко держа неряшливо и задние конечности недоминирующей рукой, в то время как бритье доминирующей рукой. В качестве альтернативы, бриться под изофлурановой анестезией.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Животные были выбриты за 2 дня до визуализации, учитывая, что животные будут ухаживать за бритой областью еще дальше.
   4. Обеспечьте воду и стандартную пищу ad libitum на протяжении всего эксперимента. Однако лишайте животных воды за 2 ч до закапывания, чтобы минимизировать объем мочевого пузыря во время закапывания.
   5. Установите стерильный наконечник ангиокатетера 24 Г на шприц объемом 100 мкл и заполните шприц бактериальным раствором, приготовленным на этапе 1.5.3.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы определить люминесценцию фона, получите базовое изображение до инстилляции (см. шаг 3 ниже).
2. Закапывание животных
   1. Поместите животных в индукционную камеру и обезболите их с помощью вдыхания изофлурана с чистым кислородом в качестве газа-носителя (индукция на 3% и поддержание на 1,5%).
   2. Поместите одно животное на рабочую поверхность в лежачем положении и поддерживайте стабильную изофлурановую анестезию с помощью носового конуса во время закапывания. Нанесите глазную мазь.
   3. Изгоняют остаточную мочу, применяя мягкое сжатие и совершая круговые движения по надлобковой области. Очистите нижнюю часть живота 70% этанолом перед закапыванием.
   4. Смажьте кончик катетера обычным физиологическим раствором. Положите указательный палец недоминирующей руки на живот и осторожно протолкните его вверх. Начните катетеризацию уретры под углом 90° (по вертикали) и, как только сопротивление встретится, наклоните его горизонтально, прежде чем вставлять его дальше (0,5 см).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Никогда не нажимайте с силой на катетер, так как это нанесет вред мочеиспускательному каналу. Мягкие поворотные движения могут быть полезны при установке катетера. С другой стороны, отсутствие сопротивления обычно указывает на ошибочное введение во влагалище.
   5. Выполняют медленную (5 мкл/с) закапывание 50 мкл бактериальной инокуляции (2 х 10⁷ КОЕ).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Большие объемы или более быстрая инстилляция могут вызвать рефлюкс в почках. Во время практики техники синие чернила могут быть использованы для оценки рефлюкса.
   6. После закапывания держите шприц и катетер на месте еще несколько секунд, а затем медленно втягивайте, чтобы предотвратить утечку. Запишите любые нарушения, такие как большое количество утечки или кровавый мяс, и исключите животных, если это необходимо.
   7. Поместите животное в положение лежа на спине у носового конуса камеры визуализации и повторите предыдущие шаги 2.1.1-2.1.6 для всех остальных животных. Используйте один катетер на экспериментальную группу. Обеспечьте продолжение анестезии и сведите к минимуму время между первым и последним животным.
   8. При необходимости вводят антибиотики или экспериментальные препараты до или после визуализации (этап 3). Например, для введения энрофлоксацина добавляют 40 мкл раствора энрофлоксацина (100 мг/мл) к 3,96 мл физиологического раствора для получения 1/100 разведения. Вводят 100 мкл /10 г подкожно в 9 утра и 5 вечера для введения 10 мг / кг энрофлоксацина два раза в день в течение 3 дней.

3. Биолюминесцентная визуализация

1. Подготовка и подбор параметров визуализации
   1. Откройте программное обеспечение для сбора BLI (см. Таблицу материалов)и нажмите «Инициализировать» в устройстве обработки изображений (см. Таблицу материалов), чтобыпротестировать систему контроллера камеры и сцены и охладить ПЗС-камеру до -90 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Во время этого процесса дверь запирается, и за ходом инициализации можно следить на панели управления. Зеленый свет указывает на то, что достигнута температура -90 °C. Предупреждение появится, если перед завершением инициализации будет предпринята попытка создания образа.
   2. Убедитесь, что данные сохраняются автоматически: нажмите на получение Автосохранение и выберите правильную папку.
   3. Выберите Люминесценция и Фотография. Проверьте настройки люминесценции по умолчанию: Установите фильтр возбуждения в положение Блокировать, а для фильтра излучения — значение Открыть.
   4. Установите время экспозиции на Авто при съемке первого изображения, особенно при ожидании тусклого сигнала, чтобы обеспечить достаточное количество фотонов. Для измерений in vivo и ярких сигналов установите время экспозиции равным ~30 с. Если изображение насыщено, появится предупреждение. Если это произошло, сократите время воздействия.
   5. Выберите средний Binning, F/stop 1 и выберите правильное поле зрения(FOV)(D для 5 животных).
   6. Установите высоту объекта на 1 см при визуализации мышей.
   7. Нажмите кнопку Добавить три раза в панели управления приобретением, чтобы получить последовательность из трех изображений в качестве технических реплик.
2. Отображение
   1. Поместите мышей в камеру визуализации в лежачем положении и используйте многообразный носовой конус для поддержания анестезии (изофлуран 1,5%) на протяжении всего эксперимента. Визуализируйте до 5 мышей одновременно и разделяйте животных, используя световую перегородку, чтобы предотвратить отражение.
   2. Закройте дверь и нажмите «Получить», чтобы начать последовательность изображений.
   3. Заполните подробную информацию об эксперименте (дикий тип и нокаутирующие животные, лечение, день визуализации и т.д.). Параметры изображения, такие как время экспозиции, сохраняются автоматически.
   4. Извлеките мышей из камеры визуализации и верните их в клетку. Проверьте полное восстановление после анестезии. В течение нескольких минут животные должны быть полностью бодрствующими и исследовательскими. Не проводите обезболивание, так как это может помешать течению ИМП^18.
   5. Верните клетки в вентилируемые стойки до следующего цикла визуализации. После завершения эксперимента усыпляют животных асфиксией_СО2 или вывихом шейки матки. Сделайте это до восстановления изофлурановой анестезии, чтобы свести к минимуму дистресс.
3. Анализ изображений
   1. Запустите программное обеспечение для создания образов и загрузите экспериментальный файл, нажав кнопку Обзор.
   2. Используйте инструментальную палитру для настройки цветовой шкалы изображения. Стандартизируйте визуальный аспект результатов, используя одинаковые настройки для всех изображений, т. е. используйте логарифмическую шкалу с минимумом от^{10 4} до максимум 10⁷ фотонов. Эти корректировки не влияют на необработанные данные, а только на графическое представление.
   3. Используйте инструменты ROI, чтобы нарисовать интересующую область (ROI) на изображении. Убедитесь, что рентабельность инвестиций достаточно велика, чтобы покрыть всю область, и используйте одинаковые размеры для всех изображений. Здесь квадратная ROI размером 3,5 см х 4,5 см была помещена над нижней частью живота.
   4. Нажмите на измерение ROI, чтобы количественно оценить интенсивность света (количество или общий поток фотонов). Экспортируйте эти данные и используйте среднее значение технических реплик.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Счетчики представляют собой количество фотонов, обнаруженных камерой, и должны использоваться только для контроля качества изображения. Для передачи данных используйте общий поток фотонов. Общий поток фотонов более физиологически значим, поскольку он представляет собой свет, излучаемый поверхностью, и представляет собой калиброванную единицу, которая корректируется на время экспозиции (в секунду).

Результаты

In vivo BLI коррелирует с КОЕ инокулята в момент инстилляции.
Чтобы оценить предел обнаружения BLI in vivo и корреляцию с КОЕ инокулята, мышей заражали различными концентрациями UTI89-lux и PBS в качестве отрицательного контроля. Перед инстилляцией неинфицированны?...

Обсуждение

Преимущества BLI по сравнению с количеством КОЕ
Продольные данные
Основным недостатком традиционного метода подсчета КОЕ для количественной оценки микробной нагрузки является требование гомогенатов посмертных органов, обеспечивающих только одну точку поперечного с...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well Black Flat Bottom Polystyrene Plate	Corning	3925	for in vitro imaging
Aesculap ISIS	Aesculap	GT421	hair trimmer, with GT608 cap
Anesthesia vaporizer	Harvard apparatus limited	N/A	https://www.harvardapparatus.com/harvard-apparatus-anesthetic-vaporizers.html
Baytril 100 mg/mL	Bayer	N/A	Enrofloxacin
BD Insyte Autoguard 24 GA	BD	382912	Yellow angiocatheter, use sterile plastic tip for instillation
C57Bl/6J mice	Janvier	N/A
Centrifuge 5804R	Eppendorf	EP022628146
Dropsense 16	Unchained Labs	Trinean	to measure OD 600nm
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, Gibco	ThermoFisher Scientific	REF 14040-083
Ethanol 70% denaturated 5L	VWR international	85825360
Falcon 14ml Round Bottom Polystyrene Tube, Snap-Cap	Corning	352057
Falcon 50ml cellstart	Greiner	227285
Hamilton GASTIGHT syringe, PTFE luer lock, 100 µL	Sigma-Aldrich	26203	to ensure slow bacterial instillation of 50 µL
Inoculation loop	Roth	6174.1	holder: Art. No. 6189.1
Iso-Vet 1000mg/g	Dechra Veterinary products	N/A	Isoflurane
IVIS Spectrum In Vivo Imaging System	PerkinElmer	REF 124262	imaging device
Kanamycine solution 50 mg/mL	Sigma-Aldrich	CAS 25389-94-0
Living Imaging Software	PerkinElmer	N/A	BLI acquisition software, version 4.7.3
Luria Bertani Broth	Sigma-Aldrich	REF L3022	alternatively can be made
Luria Bertani Broth with agar	Sigma-Aldrich	REF L2897	alternatively can be made
Petri dish Sterilin 90mm	ThermoFisher Scientific	101VR20	to fill with LB agar supplemented with Km
Pyrex Culture flask 250 mL	Sigma-Aldrich	SLW1141/08-20EA
Slide 200 Trinean	Unchained Labs	701-2007	to measure OD 600nm
UTI89-lux	N/A	N/A	Generous gift from Prof. Seed
Vortex	VWR international	444-1372