用蛋白毒性应激器治疗大 肠杆菌 后蛋白质聚合物的提取和可视化

摘要

本协议描述了用蛋白质毒性抗菌素治疗后从 大肠杆 菌中提取和可溶性蛋白质的提取和可视化。遵循此程序，可以对不同细菌菌株和/或治疗之间的 体内 蛋白质聚合形成进行定性比较。

摘要

生物体暴露于环境和细胞压力中通常会导致蛋白质平衡的破坏，并可能导致蛋白质聚集。细菌细胞中蛋白质聚合物的积累可导致细胞表型行为发生重大变化，包括生长速率、抗应力和毒性降低。对这些压力源介质表型的检查存在几个实验程序。本文描述了一种优化的检测方法，用于使用含银抗菌素治疗后，从不同的 大肠杆 菌菌株中提取和可溶性蛋白质的提取和可视化。众所周知，这种化合物会产生活性氧物种，并导致广泛的蛋白质聚集。

该方法结合了从治疗和未经处理的细胞中分离出的蛋白质聚合物和可溶性蛋白质的离心分离，以及随后通过硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和库马西染色进行分离和可视化。这种方法简单、快速，允许对不同 大肠杆菌 株中的蛋白质聚合形成进行定性比较。该方法具有广泛的应用，包括研究其他蛋白质抗菌素对多种细菌 体内 蛋白质聚合的影响的可能性。此外，该协议可用于识别有助于增强对蛋白毒物质抵抗力的基因。凝胶带可用于后续识别特别容易聚集的蛋白质。

引言

细菌不可避免地会受到无数的环境压力，包括低pH值（例如， 在哺乳动物胃^）1，2，活性氧和氯物种（ROS/RCS）（例如，在噬菌细胞氧化爆裂期间）3，4，5，温度升高（如在温泉或热休克期间^）6，7，和几个有效的抗菌剂（例如，AGXX用于本协议^）8。蛋白质特别容易受到这些压力源的影响，暴露会引发蛋白质的无/误折叠，然后播种聚合。所有生物体都采用保护系统，使它们能够处理蛋白质误折叠^9。然而，严重的压力会压倒蛋白质质量控制机制，破坏蛋白质的二级和/或三级结构，最终使蛋白质失活。因此，蛋白质聚合物会严重损害细菌生长和生存、抗压和毒性^所需的关键细胞功能。因此，关注蛋白质聚合及其在细菌中的后果的研究是一个相关的课题，因为它对传染病控制的潜在影响。

热诱导蛋白的展开和聚合通常是可逆的^7。....

研究方案

1. 大肠杆菌 株MG1655和CFT073应激处理

1. 接种5mL的利生肉汤（LB）介质，分别与单菌群的共生 大肠杆菌 株MG1655和尿病原性 大肠杆菌 （UPEC）菌株CFT073，并在37°C和300 rpm孵育为14-16小时（过夜）。
   注： 大肠杆菌 CFT073是一种人类病原体。CFT073 的处理必须在生物安全 2 级认证实验室中采取适当的生物安全措施。
2. 将每个菌株稀释成500 mL烧瓶，含有70 mL的3-（N-形态）丙烷硫酸（MOPS）-葡萄糖（MOPS-g）（表1）介质，以600纳米（OD_600）值0.1的光学密度。在 37 °C 和 300 rpm 下孵育，直到达到中日阶段（OD₆₀₀ = 0.5-0.55）。
3. 将每个培养物的 20 mL 转移到三个预热 125 mL 烧瓶中，在 37 °C 和 300 rpm 下孵育 2 分钟。
   注：由于需要及时处理样品，每次处理不超过 6 种文化。
4. 在浓度为 2 毫克/兆升的 MOPS-g 介质中准备抗菌化合物溶液。将抗菌剂添加到每个培养物中，以达到指示的浓度。对于未经处理的控制，添加 MOPS-g 介质所需的体积。
   注：涡流2毫克/mL抗菌溶液，使复合颗粒均匀分布，避免沉降。
5. 在 37 °C....

结果

图6：大肠杆菌株MG1655和UGEC菌株CFT073中抗菌诱导蛋白聚合的代表性结果。大肠杆菌株MG1655和CFT073生长在37°C和300 rpm至OD₆₀₀= 0.5-0.55在MOPS-g介质之前，他们处理与指示浓度 （-， 0毫克/毫升;+，175毫克/毫升;+，200毫克/毫升）的抗菌剂45分钟。可溶.......

讨论

本协议描述了一种优化的方法，用于分析蛋白质聚合形成后，处理不同的大肠杆菌菌株与蛋白质毒性抗菌剂。该协议允许同时从经过治疗和未经治疗的大肠杆菌细胞中提取不溶性和可溶性蛋白质分数。与现有的蛋白质聚合分离方案相比，从细胞14，15，16，20，这种方法有几个优点：（?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals/Reagents
Acetone	Fisher Scientific	67-64-1
30% Acrylamide/Bisacrylamide solution 29:1	Bio-Rad	1610156
Ammonium persulfate	Millipore Sigma	A3678-100G
Benzonase nuclease	Sigma	E1014-5KU
Bluestain 2 Protein ladder, 5-245 kDa	GoldBio	P008-500
β-mercaptoethanol	Millipore Sigma	M6250-100ML
Bromophenol blue	GoldBio	B-092-25
Coomassie Brilliant Blue R-250	MP Biomedicals LLC	821616
D-Glucose	Millipore Sigma	G8270-1KG
D-Sucrose	Acros Organics	57-50-1
Ethylenediamine tetra acetic acid (EDTA)	Sigma-Aldrich	SLBT9686
Glacial Acetic acid	Millipore Sigma	ARK2183-1L
Glycerol, 99%	Sigma-Aldrich	G5516-1L
Glycine	GoldBio	G-630-1
Hydrochloric acid, ACS reagent	Sigma-Aldrich	320331-2.5L
Isopropanol (2-Propanol)	Sigma	402893-2.5L
LB broth (Miller)	Millipore Sigma	L3522-1KG
LB broth with agar (Miller)	Millipore Sigma	L2897-1KG
Lysozyme	GoldBio	L-040-25
10x MOPS Buffer	Teknova	M2101
Nonidet P-40	Thomas Scientific	9036-19-5
Potassium phosphate, dibasic	Sigma-Aldrich	P3786-1KG
Potassium phosphate, monobasic	Acros Organics	7778-77-0
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Sigma-Aldrich	L3771-500G
Tetramethylethylenediamine (TEMED)	Millipore Sigma	T9281-50ML
Thiamine	Sigma-Aldrich	T4625-100G
100% Trichloroacetic acid	Millipore Sigma	T6399-100G
Tris base	GoldBio	T-400-1
Material/Equipment
Centrifuge tubes (15 mL)	Alkali Scientific	JABG-1019
Erlenmeyer flask (125 mL)	Carolina	726686
Erlenmeyer flask (500 mL)	Carolina	726694
Freezer: -80 °C	Fisher Scientific
Glass beads (0.5 mm)	BioSpec Products	1107-9105
Microcentrifuge	Hermle	Z216MK
Microcentriguge tubes (1.7 mL)	VWR International	87003-294
Microcentriguge tubes (2.0 mL)	Axygen Maxiclear Microtubes	MCT-200-C
Plastic cuvettes	Fischer Scientific	14-377-012
Power supply	ThermoFisher Scientific	EC105
Rocker	Alkali Scientific	RS7235
Shaking incubator (37 °C)	Benchmark Scientific
Small glass plate	Bio-Rad	1653311
Spacer plates (1 mm)	Bio-Rad	1653308
Spectrophotometer	Thermoscientific	3339053
Tabletop centrifuge for 15 mL centrifuge tubes	Beckman-Coulter
Vertical gel electrophoresis chamber	Bio-Rad	1658004
Vortexer	Fisher Vortex Genie 2	12-812
Thermomixer	Benchmark Scientific	H5000-HC
10 well comb	Bio-Rad	1653359