Extraction et visualisation d’agrégats protéiques après traitement d’Escherichia coli avec un facteur de stress protéotoxique

Résumé

Ce protocole décrit l’extraction et la visualisation de protéines agrégées et solubles d’Escherichia coli après traitement avec un antimicrobien protéotoxique. Suivre cette procédure permet une comparaison qualitative de la formation d’agrégats protéiques in vivo dans différentes souches bactériennes et/ou entre les traitements.

Résumé

L’exposition des organismes vivants à des stress environnementaux et cellulaires provoque souvent des perturbations dans l’homéostasie des protéines et peut entraîner une agrégation des protéines. L’accumulation d’agrégats de protéines dans les cellules bactériennes peut entraîner des altérations significatives du comportement phénotypique cellulaire, notamment une réduction des taux de croissance, de la résistance au stress et de la virulence. Plusieurs procédures expérimentales existent pour l’examen de ces phénotypes médiés par les facteurs de stress. Cet article décrit un essai optimisé pour l’extraction et la visualisation de protéines agrégées et solubles de différentes souches d’Escherichia coli après traitement avec un antimicrobien contenant de l’argent-ruthénium. Ce composé est connu pour générer des espèces réactives de l’oxygène et provoque une agrégation protéique généralisée.

La méthode combine une séparation basée sur la centrifugation des agrégats de protéines et des protéines solubles des cellules traitées et non traitées avec une séparation et une visualisation ultérieures par électrophorèse sur gel de dodécylsulfate de sodium-polyacrylamide (SDS-PAGE) et coloration de Coomassie. Cette approche est simple, rapide et permet une comparaison qualitative de la formation d’agrégats protéiques dans différentes souches d’E. coli. La méthodologie a un large éventail d’applications, y compris la possibilité d’étudier l’impact d’autres antimicrobiens protéotoxiques sur l’agrégation in vivo des protéines dans un large éventail de bactéries. De plus, le protocole peut être utilisé pour identifier les gènes qui contribuent à une résistance accrue aux substances protéotoxiques. Les bandes de gel peuvent être utilisées pour l’identification ultérieure des protéines particulièrement sujettes à l’agrégation.

Introduction

Les bactéries sont inévitablement exposées à une myriade de stress environnementaux, y compris un faible pH (par exemple, dans l’estomac des mammifères)^1,2, des espèces réactives de l’oxygène et du chlore (ROS / RCS) (par exemple, lors d’une explosion oxydative dans les phagocytes)^3,4,5, des températures élevées (par exemple, dans les sources chaudes ou pendant un choc thermique)^6,7, et plusieurs antimicrobiens puissants (par exemple, AGXX utilisé dans ce prot....

Protocole

1. Traitement du stress des souches d’E. coli MG1655 et CFT073

1. Inoculer 5 mL de bouillon de lysogénie (LB) avec une seule colonie de souche commensale d’E. coli MG1655 et de souche uropathogène E. coli (UPEC) CFT073, respectivement, et incuber pendant 14 à 16 h (pendant la nuit) à 37 °C et 300 tr/min.
   REMARQUE: Escherichia coli CFT073 est un agent pathogène humain. La manipulation du CFT073 doit être effectuée avec des mesures de biosécurité appropriées dans un laboratoire certifié de niveau de biosécurité 2.
2. Diluer chaque souche dans une fiole de 500 mL contenant70 mL de 3-(N-morpholino)acide propane....

Résultats

Figure 6: Résultats représentatifs de l’agrégation protéique induite par les antimicrobiens dans la souche commensale Mg1655 d’Escherichia coli et la souche CFT073 de l’UPEC. Les souches d’E. coli MG1655 et CFT073 ont été cultivées à 37 °C et de 300 tr/min à_{OD 600}= 0,5-0,55 dans un milieu MOPS-g avant d’être t.......

Discussion

Ce protocole décrit une méthodologie optimisée pour l’analyse de la formation d’agrégats protéiques après traitement de différentes souches d’E. coli avec un antimicrobien protéotoxique. Le protocole permet l’extraction simultanée de fractions protéiques insolubles et solubles à partir de cellules E. coli traitées et non traitées. Par rapport aux protocoles existants pour l’isolement des agrégats de protéines à partir des cellules^14,

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals/Reagents
Acetone	Fisher Scientific	67-64-1
30% Acrylamide/Bisacrylamide solution 29:1	Bio-Rad	1610156
Ammonium persulfate	Millipore Sigma	A3678-100G
Benzonase nuclease	Sigma	E1014-5KU
Bluestain 2 Protein ladder, 5-245 kDa	GoldBio	P008-500
β-mercaptoethanol	Millipore Sigma	M6250-100ML
Bromophenol blue	GoldBio	B-092-25
Coomassie Brilliant Blue R-250	MP Biomedicals LLC	821616
D-Glucose	Millipore Sigma	G8270-1KG
D-Sucrose	Acros Organics	57-50-1
Ethylenediamine tetra acetic acid (EDTA)	Sigma-Aldrich	SLBT9686
Glacial Acetic acid	Millipore Sigma	ARK2183-1L
Glycerol, 99%	Sigma-Aldrich	G5516-1L
Glycine	GoldBio	G-630-1
Hydrochloric acid, ACS reagent	Sigma-Aldrich	320331-2.5L
Isopropanol (2-Propanol)	Sigma	402893-2.5L
LB broth (Miller)	Millipore Sigma	L3522-1KG
LB broth with agar (Miller)	Millipore Sigma	L2897-1KG
Lysozyme	GoldBio	L-040-25
10x MOPS Buffer	Teknova	M2101
Nonidet P-40	Thomas Scientific	9036-19-5
Potassium phosphate, dibasic	Sigma-Aldrich	P3786-1KG
Potassium phosphate, monobasic	Acros Organics	7778-77-0
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Sigma-Aldrich	L3771-500G
Tetramethylethylenediamine (TEMED)	Millipore Sigma	T9281-50ML
Thiamine	Sigma-Aldrich	T4625-100G
100% Trichloroacetic acid	Millipore Sigma	T6399-100G
Tris base	GoldBio	T-400-1
Material/Equipment
Centrifuge tubes (15 mL)	Alkali Scientific	JABG-1019
Erlenmeyer flask (125 mL)	Carolina	726686
Erlenmeyer flask (500 mL)	Carolina	726694
Freezer: -80 °C	Fisher Scientific
Glass beads (0.5 mm)	BioSpec Products	1107-9105
Microcentrifuge	Hermle	Z216MK
Microcentriguge tubes (1.7 mL)	VWR International	87003-294
Microcentriguge tubes (2.0 mL)	Axygen Maxiclear Microtubes	MCT-200-C
Plastic cuvettes	Fischer Scientific	14-377-012
Power supply	ThermoFisher Scientific	EC105
Rocker	Alkali Scientific	RS7235
Shaking incubator (37 °C)	Benchmark Scientific
Small glass plate	Bio-Rad	1653311
Spacer plates (1 mm)	Bio-Rad	1653308
Spectrophotometer	Thermoscientific	3339053
Tabletop centrifuge for 15 mL centrifuge tubes	Beckman-Coulter
Vertical gel electrophoresis chamber	Bio-Rad	1658004
Vortexer	Fisher Vortex Genie 2	12-812
Thermomixer	Benchmark Scientific	H5000-HC
10 well comb	Bio-Rad	1653359