프로테오독성 스트레스로 대장균 치료 후 단백질 골재의 추출 및 시각화

요약

이 프로토콜은 프로테오독성 항균제로 치료 한 후 대장균에서 집계 및 수용성 단백질의 추출 및 시각화를 설명합니다. 이 절차에 따라 다른 세균성 균주 및 /또는 치료 사이에 생체 내에서 단백질 골집 형성의 질적 비교를 할 수 있습니다.

초록

환경 및 세포 스트레스에 살아있는 유기체의 노출은 수시로 단백질 항상성에 있는 중단을 일으키는 원인이 되고 단백질 응집귀귀착될 수 있습니다. 세균성 세포에 있는 단백질 응집체의 축적은 성장 비율, 응력 저항 및 독성에 있는 감소를 포함하여 세포 표현성 행동에 있는 중요한 변경으로 이끌어 낼 수 있습니다. 이러한 스트레스 매개 표현형의 검사를 위한 몇몇 실험적인 절차가 존재합니다. 이 논문은 은 루테늄 함유 항균제로 치료 후 다른 대장균 균주에서 골재 및 수용성 단백질의 추출 및 시각화에 최적화된 분석서를 설명합니다. 이 화합물은 반응성 산소 종을 생성하고 광범위한 단백질 응집을 일으키는 것으로 알려져 있습니다.

이 방법은 치료 및 처리되지 않은 세포로부터 단백질 골재 및 용해성 단백질의 원심분리 계 분리를 나트륨 도데실 황산염-폴리아크라이아미드 젤 전기포진(SDS-PAGE) 및 쿠마시 염색에 의한 후속 분리 및 시각화와 결합한다. 이 접근법은 간단하고 빠르며, 다른 대장균 균주에서 단백질 골체 형성의 질적 비교를 허용합니다. 방법론은 광범위한 박테리아에서 생체 내 단백질 응집에 대한 다른 프로테오독성 항균제의 영향을 조사할 수 있는 가능성을 포함하여 광범위한 응용 분야가 있습니다. 더욱이, 프로토콜은 프로테오독성 물질에 대한 저항증가에 기여하는 유전자를 식별하는 데 사용될 수 있다. 젤 밴드는 특히 응집되기 쉬운 단백질의 후속 식별에 사용할 수 있습니다.

서문

박테리아는 필연적으로 환경 스트레스의 무수한에 노출, 낮은 pH(예를 들어, 포유류 위장)^1,2,반응성 산소 및 염소 종(ROS/RCS) (예를 들어, 식신구의 산화 파열 중)^3,4,5,높은 온도(예를 들어, 온천 또는 열 충격 시)^6,7,및 몇 가지 강력한 항균(예를 들어, 이^{프로토콜)}및 몇 가지 강력한 항균(예를 들어, 이 규약) 및 몇 가지 강력한 항균(예를 들어, 이 에 사용됨) 단백질은 이러한 스트레스에 특히 취약하며, 노출은 단백질을 분리/오도하여 다음 씨앗 응집을 유발할 수 있습니다. 모든 유기체는 단백질 잘못 접는^9에대처할 수 있는 보호 시스템을 사용합니다. 그러나, 가혹한 긴장은 단백질 질 관리 기계를 압도하고 궁극적으로 단백질을 비활성화하는 단백질의 이차 및/또는 삼차 구조를 방해할 수 있습니다. 결과적으로, 단백질 응집체는 세균성 성장 및 생존, 스트레스 저항 및 독성^10에필요한 중요한 세포 기능을 심각하게 손상시킬 수 있다. 따라서, 단백질 집계및 박테리아에 있는 그것의 결과에 집중하는 연구는 전염병 통제에 그것의 잠재적인 충격 때문에 관련 주제입니다.

열 유도 단백질 전개 및 응집은 종종 가역^7. 대조적으로, 산화 스트레스와 같은 다른 프로테오독성 응력은 특정 아미노산 사이드 체인의 산화를 통해 돌이킬 수 없는 단백질 변형을 유발하여 단백질을 비/오폴딩시키고, 결국 단백질 응집^4를초래할 수 있다. 응력 유발 단백질 골재의 형성은 효모 및 박테리아^{11,12,13에서}분자 보호자 및 보호 기능의 맥락에서 광범위하게 연구되고^있다. 여러 프로토콜은 용해성 단백질 골재의 격리 및 분석을 위한 다양한 생화학적 기술을 활용하는 것으로^{14,15,16,17을}공표되었다. 기존 프로토콜은 주로 열 충격 및/또는 분자 보호자의 식별시 세균성 단백질 응집체를 연구하는 데 사용되었습니다. 이러한 프로토콜은 확실히 필드에 발전되었지만, 세포 파괴기, 프랑스 언론 및/또는 초음파처리^14,15,17또는 (iii) 시간 반복의 사용을 포함하여 (i) 최대 10 L^14,17, (ii) 복잡한 물리적 중단 과정의 큰 세균 배양 부피를 필요로하기 때문에 실험 적 절차에 몇 가지 주요 불편이 있다. 세탁 및 인큐베이션 단계^15,16,17.

본 논문은 이전 접근법의 한계를 해결하는 것을 목표로 하는 수정된 프로토콜을 설명하고 프로테오독성 항균 표면 코팅으로 치료 후 두 가지 다른 대장균 균주에서 형성된 단백질 골재의 양을 분석할 수 있게 한다. 코팅은 금속-은(Ag)과 루테늄(Ru)으로 구성되며, 아스코르브산으로 조절되며, 그 항균 활성은 반응성 산소 종^8,18의생성에 의해 달성된다. 본명 에서 항균 화합물을 가진 치료 후 세균 배양의 제조에 대한 상세한 설명과 뚜렷한 감수성 프로파일을 가진 두 개의 대장균 균주의 노출 시 단백질 응집 상태의 비교가 항균제의 농도를 증가시키는 것이다. 설명된 방법은 저렴하고 빠르며 재현가능하며 다른 프로테오독성 화합물이 있는 상태에서 단백질 응집을 연구하는 데 사용될 수 있다. 또한, 프로토콜은 다양한 상이한 박테리아에서 특정 유전자 삭제가 단백질 응집에 미치는 영향을 분석하도록 수정될 수 있다.

프로토콜

1. 대장균 균주 MG1655 및 CFT073의 스트레스 치료

1. 리소게니 국물 (LB) 배지의 접종 5 mL 는 대장균 균주 MG1655 및 비뇨기요법 대장균 (UPEC) 균주 CFT073의 단일 콜로니를 가진 배지, 각각 37 °C 및 300 rpm에서 14-16 h (하룻밤)에 대한 배양.
   참고: 대장균 CFT073은 인간 병원체입니다. CFT073의 처리는 생물 안전 수준-2 인증 실험실에서 적절한 생물 안전 조치를 통해 수행해야 합니다.
2. 각 균주는 3-(N-morpholino)의 프로판설포닉산(MOPS)-포도당(MOPS-g)의 70mL를 함유한 500mL 플라스크로 희석(표1)600nm(OD₆₀₀₎값에서 광학 밀도에 중간을 한다. 중간 로그 단계에 도달할 때까지 37°C 및 300 rpm에서 배양한다(OD₆₀₀ = 0.5-0.55).
3. 각 배양20mL를 3개의 예온125mL 플라스크로 옮기고 37°C, 300rpm에서 2분 동안 배양한다.
   참고: 시료의 적시 처리가 필요하므로 한 번에 6배 이하의 배양식을 처리하지 않습니다.
4. 2 mg/mL의 농도에서 MOPS-g 배지에서 항균 화합물 용액을 준비합니다. 표시된 농도에 도달하기 위해 각 배양에 항균을 추가합니다. 처리되지 않은 컨트롤의 경우 필요한 양의 MOPS-g 배지를 추가합니다.
   참고: 화합물 입자의 균등한 분포를 허용하고 침전을 피하기 위해 2 mg/mL 항균 용액을 소용돌이.
5. 37°C및 300rpm에서 45분 동안 배양합니다.

그림 1: 대장균 스트레스 치료. 세균 배양은 MOPS-g에서 재배되고 중간 로그 상에 도달하면 은 루테늄 함유 항균제의 표시 농도로 처리된다. 약어: LB = 리소제니 국물; Ag-Ru = 실버 루테늄; MOPS-g = 3-(N-모르폴리노)프로파네설포닉산(MOPS)-포도당. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

2. 세균 세포 샘플 수집

1. 45분 의 스트레스 치료 후 각 배양의 OD_600을 결정합니다. 각 샘플에 대해, 수확 세포는 4mL의 OD₆₀₀ = 15mL 원심분리기 튜브에서 1에 3,000 × g 및 4°C에서 15분 동안 원심분리에 의해 1에 해당한다.
2. 상체를 완전히 제거하고 얼음 냉기 용해 버퍼(표 1)의50 μL에서 세포 펠릿을 다시 분리합니다. 얼음에 30 분 동안 샘플을 배양.
   참고: 이 리시스 단계는 펩티도글리칸 층을 저하시다. 항상 갓 준비된 용해 버퍼를 사용하십시오.
3. 샘플을 1.7mL 마이크로센심심분리기 튜브로 옮기습니다. 추가 사용이 될 때까지 -80 °C에서 동결하십시오.

그림 2: 세균 샘플 수집. 셀 샘플은 원심분리에 의해 수확되고 리시스 버퍼에서 다시 리시 버퍼로 재장매되고 -80 °C에서 저장하십시오.

3. 용해성 단백질 응집체 추출

1. 얼음에 샘플을 해동.
   참고: 동결 해동 주기는 세포 용해에 기여합니다.
2. 얼음 차가운 버퍼 A(표 1)의360 μL을 추가하고 파이펫팅하여 부드럽게 섞습니다.
   참고: 삼투압 쇼크는 세포 리시스에도 영향을 줄 것입니다.
3. 샘플을 0.5mm 유리 구슬의 ~200 μL을 함유한 2mL 마이크로센심심분리기 튜브로 이송합니다. 1,400 rpm에서 흔들리는 열믹서에서 8 °C에서 30 분 동안 배양하십시오.
   참고: 이 단계는 셀의 물리적 중단을 초래합니다. 프로테아제 억제제는 단백질 분해를 최소화하는 데 사용될 수 있다. 중단은 4°C에서 수행될 수 있다. 유리 구슬의 사용은 효모^(19)에서단백질의 작은 부분 집합의 응집을 유도하기 위해보고되었다.
4. 유리 구슬을 정착시키기 위해 흔들리지 않고 얼음에 5 분 동안 배양하십시오. 셀 리세이트 200 μL을 1.7mL 마이크로센심분리기 튜브로 옮기습니다.
   참고: 유리 구슬의 전송을 피하십시오.
5. 원심분리기는 16,000× g, 4°C에서 20분 동안. 수용성 단백질을 포함하는 상체를 수집하고 섹션 4로 진행하십시오.
6. 파이펫을 사용하여 200 μL의 얼음 냉간 버퍼A(표 1)에서펠릿을 다시 중단합니다. 원심분리기는 16,000× g, 4°C에서 20분 동안. 신중하게 완전히 상체를 제거합니다.
7. 얼음 냉간 버퍼 B 200 μL(표 1 및 재료 표참조)을 추가하고 파이펫팅으로 펠릿을 조심스럽게 재보페수합니다.
   참고: 비이온 세제는 막 단백질을 용해시킵니다.
8. 원심분리를 16,000× g, 4°C에서 20분 동안 반복한다. 상체를 조심스럽게 제거합니다.
9. 페펫팅에 의해 200 μL의 냉완충제A(표 1)에서펠릿을 다시 놓습니다. 원심분리기는 16,000× g, 4°C에서 20분 동안. 상체를 완전히 제거합니다.
10. 1x의 100 μL에서 펠릿을 재연하여 SDS 샘플버퍼(표 1)를감소시키고 써모믹서에서 95°C에서 5분간 끓입니다.
11. 샘플을 -20°C에 저장하여 분리를 위해 SDS 폴리아크라이글라미드 젤에 나중에 또는 즉시 로드합니다.

그림 3: 용해성 단백질 골재의 추출. 단백질 응집체의 추출은 세포 중단, 수용성 단백질에서 단백질 응집물의 분리, 막 단백질의 용해성 및 세척을 포함하여 일련의 단계를 포함합니다. 약어: SDS = 나트륨 도데실 황산염. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

4. 수용성 단백질 샘플 준비

1. 100% 트리클로로아세트산(TCA)의 1부피를 3.6단계에서 수용성 단백질 샘플 4부와 혼합한다.
   참고: TCA를 처리하려면 연기 후드와 개인 보호 장비 및 승인된 폐기물 처리 절차가 필요합니다.
2. 단백질 강수량을 허용하기 위해 4 °C에서 10 분 동안 배양하십시오.
   참고: 백색 침전제가 곧 나타납니다.
3. 원심분리기는 21,000× g및 4°C에서 5분 동안 침전시키고 상체를 제거한다. 200μL의 얼음-차가운 아세톤으로 펠릿을 세척하여 셀룰러 이물질을 제거합니다. 원심분리기는 21,000× g및 4°C에서 5분 동안 상복부를 제거한다. 총 3단계에서 이러한 작업을 총 세 번 반복합니다.
4. 37°C의 써모믹서에 열린 뚜껑이 있는 마이크로센심분리기 튜브를 배치하여 펠릿에서 나머지 아세톤을 제거합니다.
   참고: 5분 이상의 배큐베이션은 단백질 펠릿의 용해도를 감소시킬 수 있다.
5. SDS버퍼(표 1)를줄이고 펠릿을 완전히 용해시키는 1x의 100 μL을 추가합니다. 95°C에서 5분간 시료를 끓입니다.
6. 샘플을 -20°C에 저장하여 분리를 위해 SDS 폴리아크라이글라미드 젤에 나중에 또는 즉시 로드합니다.

그림 4: 용해성 단백질의 준비. 수용성 단백질의 준비는 삼열산과 함께 강수 단계를 포함하고 얼음 차가운 아세톤으로 반복세척한다. 약어: TCA = 트리클로로아세트산; SDS = 나트륨 도데실 황산염. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

5. SDS-PAGE를 사용하여 추출된 단백질 골재의 분리 및 시각화

1. 12% SDS-폴리아크라이알라미드 젤을 준비합니다.
   1. 두 개의 분리 젤의 경우, 파이펫 5.1 mL의 이중 증류수 (ddH₂O), 3.75 mL 의 Tris-HCl (pH 8.8), 7.5 mL 20 % (w /v) SDS, 6mL 의 30% 아크릴아미드/비사크라이엘라미드(29:1) 용액, 75mL w/v 암모늄 감산, 10mL의 테트라메틸레틸렌디아민(TEMED)을 15mL 원심분리튜브에 넣고 공기버블을 도입하지 않고 부드럽게 섞는다. 유리 판 내 1mL 파이프를 사용하여 젤을 붓고 혼합물의 상부 2cm를 자유롭게 둡니다. 분리 젤 의 상단에 70 % 에탄올을 추가하고 두 층 사이의 균일 한 인터페이스를 허용합니다.
   2. 분리 겔의 중합 후, ddH₂O의 1.535 mL을 배관하여 스태킹 젤을 준비, 625mL 의 Tris-HCl (pH 6.8), 12.5 mL 20 % (w / v) SDS, 335 mL 30 % 아크릴 아미드 / 비사 크라이 라미드 (29:1) 용액, 12.5 mL 12.5 mL 10% w / v 암몬늄 persul. 분리 젤에서 에탄올을 제거하고 스태킹 젤 용액을 추가합니다. 기포를 도입하지 않고 원하는 포켓 수의 빗을 삽입합니다. 20-30 분 동안 중합을 허용하십시오.
2. 각 시료와 단백질 사다리의 4 μL을 별도의 우물에 적재하고 실온에서 45분 동안 트리스-글리신 러닝버퍼(표 1)에서젤을 실행합니다.
   참고: 브로모페놀 밴드가 젤에서 마이그레이션하려고 할 때 젤을 중지합니다.
3. 젤을 전예 페어뱅크스 솔루션A(표 1)에서로커에서 30분 동안 염색합니다.
4. 미리 워진 페어뱅크스 용액D(표 1)에서원하는 배경(예: 하룻밤)까지 로커에서 젤을 탈색한다.

그림 5: 단백질 분리 및 시각화. 샘플은 SDS-PAGE로 분리되고 Coomassie 염색에 의해 시각화됩니다. 약어: SDS-PAGE = 나트륨 도데딜 황산염-폴리아크라이알라미드 젤 전기포고증. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

결과

도 6: 대장균 균주 MG1655 및 UPEC 균주 CFT073에서 항균 유도 단백질 응집의 대표적인 결과. 대장균 균주 MG1655 및 CFT073은 37°C및 300 rpm에서 OD₆₀₀= 0.5-0.55로 성장한 후 MOPS-g 미디어에서 표시 농도(-, 0 mg/mL; +, 175 mg/mL; +, +, 200 mg/mL; ++, 200 mg/mL)의 항균으로 치료하였...

토론

이 프로토콜은 프로테오독성 항균제로 상이한 대장균 균주를 치료한 후 단백질 골체 형성을 분석하기 위한 최적화된 방법론을 설명한다. 이 프로토콜은 치료 및 치료되지 않은 대장균 세포로부터 불용성 및 용해성 단백질 분획을 동시에 추출할 수 있게 합니다. 세포로부터의 단백질 골재 절연을 위한 기존 프로토콜에 비해^14,15,

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals/Reagents
Acetone	Fisher Scientific	67-64-1
30% Acrylamide/Bisacrylamide solution 29:1	Bio-Rad	1610156
Ammonium persulfate	Millipore Sigma	A3678-100G
Benzonase nuclease	Sigma	E1014-5KU
Bluestain 2 Protein ladder, 5-245 kDa	GoldBio	P008-500
β-mercaptoethanol	Millipore Sigma	M6250-100ML
Bromophenol blue	GoldBio	B-092-25
Coomassie Brilliant Blue R-250	MP Biomedicals LLC	821616
D-Glucose	Millipore Sigma	G8270-1KG
D-Sucrose	Acros Organics	57-50-1
Ethylenediamine tetra acetic acid (EDTA)	Sigma-Aldrich	SLBT9686
Glacial Acetic acid	Millipore Sigma	ARK2183-1L
Glycerol, 99%	Sigma-Aldrich	G5516-1L
Glycine	GoldBio	G-630-1
Hydrochloric acid, ACS reagent	Sigma-Aldrich	320331-2.5L
Isopropanol (2-Propanol)	Sigma	402893-2.5L
LB broth (Miller)	Millipore Sigma	L3522-1KG
LB broth with agar (Miller)	Millipore Sigma	L2897-1KG
Lysozyme	GoldBio	L-040-25
10x MOPS Buffer	Teknova	M2101
Nonidet P-40	Thomas Scientific	9036-19-5
Potassium phosphate, dibasic	Sigma-Aldrich	P3786-1KG
Potassium phosphate, monobasic	Acros Organics	7778-77-0
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Sigma-Aldrich	L3771-500G
Tetramethylethylenediamine (TEMED)	Millipore Sigma	T9281-50ML
Thiamine	Sigma-Aldrich	T4625-100G
100% Trichloroacetic acid	Millipore Sigma	T6399-100G
Tris base	GoldBio	T-400-1
Material/Equipment
Centrifuge tubes (15 mL)	Alkali Scientific	JABG-1019
Erlenmeyer flask (125 mL)	Carolina	726686
Erlenmeyer flask (500 mL)	Carolina	726694
Freezer: -80 °C	Fisher Scientific
Glass beads (0.5 mm)	BioSpec Products	1107-9105
Microcentrifuge	Hermle	Z216MK
Microcentriguge tubes (1.7 mL)	VWR International	87003-294
Microcentriguge tubes (2.0 mL)	Axygen Maxiclear Microtubes	MCT-200-C
Plastic cuvettes	Fischer Scientific	14-377-012
Power supply	ThermoFisher Scientific	EC105
Rocker	Alkali Scientific	RS7235
Shaking incubator (37 °C)	Benchmark Scientific
Small glass plate	Bio-Rad	1653311
Spacer plates (1 mm)	Bio-Rad	1653308
Spectrophotometer	Thermoscientific	3339053
Tabletop centrifuge for 15 mL centrifuge tubes	Beckman-Coulter
Vertical gel electrophoresis chamber	Bio-Rad	1658004
Vortexer	Fisher Vortex Genie 2	12-812
Thermomixer	Benchmark Scientific	H5000-HC
10 well comb	Bio-Rad	1653359