门静脉注射结直肠癌类器官研究肝转移基质

摘要

门静脉注射结直肠癌 （CRC） 类器官可产生富含基质的肝转移。这种CRC肝转移的小鼠模型代表了研究肿瘤 - 基质相互作用和开发新型基质导向疗法（如腺相关病毒介导的基因疗法）的有用工具。

摘要

结直肠癌（CRC）的肝转移是癌症相关死亡的主要原因。癌症相关成纤维细胞（CAFs）是肿瘤微环境的主要组成部分，在转移性CRC进展中起着至关重要的作用，并预测患者预后不良。然而，缺乏令人满意的小鼠模型来研究转移性癌细胞和CAFs之间的串扰。在这里，我们提出了一种方法来研究肝转移进展如何受到转移位的调节，并且可能通过基质定向治疗来抑制。门静脉注射CRC类器官产生促肾上腺皮质反应，忠实地概括了人CRC肝转移的富含成纤维细胞的组织学。与脾内注射模型相比，该模型是组织特异性的，肝脏中的肿瘤负荷更高，简化了小鼠生存分析。通过注射表达荧光素酶的肿瘤类器官，可以通过 体内 成像监测肿瘤生长动力学。此外，这种临床前模型为评估靶向肿瘤间充质的治疗效果提供了一个有用的平台。我们描述了检查腺相关病毒介导的肿瘤抑制基质基因递送到肝细胞的方法是否可以重塑肿瘤微环境并提高小鼠存活率。这种方法能够开发和评估新的治疗策略，以抑制CRC的肝转移。

引言

结直肠癌（CRC）是全球癌症死亡的主要原因¹.超过一半的CRC患者发生肝转移，通过门静脉播散¹发生。目前，尚无有效的治疗方法可以治愈晚期肝转移，大多数患者死于转移性疾病。

转移性生态位或肿瘤微环境在播散性CRC细胞的移植和生长中起关键作用²。癌症相关成纤维细胞（CAFs）是肿瘤微环境的重要成分，通过分泌生长因子，重塑细胞外基质（ECM）以及调节免疫景观和血管生成来促进或抑制癌症进展^3，4，5。CAFs还赋予化疗和免疫疗法耐药性³。此外，CAF 调节结直肠癌肝转移的开始和进展，并预测结直肠癌^{3、6、7、8} 患者的预后。因此，CAF相关因子可用于开发抑制CRC肝转移的治疗策略。然而，缺乏令人满意的小鼠模型来研究转移性肿瘤基质一直是开发基质靶向疗法的主要障碍。

目前，研究CRC肝转移的动物模型包括自发发生肝转移的原发性CRC模型和癌细胞移植到肝脏的模型。原代CRC小鼠模型，如基因工程小鼠模型和癌细胞结肠注射，很少显示向肝脏转移^{9，10，11，12}。此外，即使观察到肝转移，这些模型也显示出从原发性肿瘤诱导到转移的长潜伏期，并且可能死于原发性肿瘤负担¹²。为了有效地产生CRC肝转移，使用三种注射方法将培养的CRC细胞移植到肝脏中:脾内注射，直接在实质内注射到肝脏和门静脉注射。脾内注射癌细胞扩散到脾静脉，门静脉，并最终扩散到肝脏^13，14。然而，与其他移植模型相比，脾内注射产生的肿瘤摄取率较低^15，16。通过脾内注射，进行脾脏手术切除以避免脾脏中的癌症生长，这可能潜在地损害免疫细胞成熟¹⁷。此外，脾内注射也会导致脾脏和腹腔¹⁸中意外的肿瘤生长，使肝转移分析复杂化。直接在实质内注射到肝脏中有效诱导肝转移^16，19，20。然而，这种方法并不能完全概括通过门静脉播散自然发生的肝转移的生物学步骤。使用直接注射到肝脏，癌细胞进入非门户，但体循环也可导致多个大的肺转移¹⁶。虽然大多数CRC肝转移患者在肝脏中显示多个肿瘤结节²¹，但直接注射到特定的肝叶中会产生单个肿瘤肿块^19，20。门静脉注射或肠系膜静脉注射虽然在技术上具有挑战性，但允许肿瘤细胞以一种概括患者生长模式的方式有效地将肿瘤细胞递送到肝脏中¹⁷.该策略可以最大限度地减少继发部位转移的可能性，并使肝脏中癌细胞的快速生长，简化小鼠存活分析。

从历史上看，使用小鼠MC-38，人HT-29和SW-620等结直肠癌细胞系来生成肝脏转移的小鼠模型^22，23。然而，这些结直肠癌细胞系不会诱导促成膜基质反应。肿瘤中的低基质含量使得难以研究癌症相关成纤维细胞的生物学作用。CRC类器官及其移植的最新进展为评估基质在癌症进展中的重要作用提供了有用的平台²⁴。CRC类器官的肝移植产生富含成纤维细胞的肿瘤微环境，并为基质研究提供了新的见解^6，25。目前，门静脉或肠系膜静脉注射类器官已成为产生CRC肝转移的金标准方法^{6，25，26，27，28}。尽管如此，据我们所知，以前的论文都没有描述结肠直肠类肿瘤门静脉注射的详细方法。在这里，我们提出了一种使用CRC类器官的门静脉注射来开发新型腺相关病毒（AAV）介导的基质导向疗法的方法。

肝细胞是肝脏转移性肿瘤微环境的重要组成部分，在转移性癌症进展中起关键作用²⁹。受AAV基因治疗方法在非肿瘤患者^30，31中诱导肝细胞中蛋白质表达的成功启发，我们研究了类似的方法，但旨在改变CRC²⁵中的肝肿瘤微环境。因此，我们还在本文中描述了尾静脉注射AAV8以诱导抗肿瘤蛋白的表达以修饰肝脏肿瘤的微环境。AAV8血清型，通过在病毒产生过程中选择病毒衣壳蛋白来指定，导致肝细胞特异性的高转导效率（即，肝肿瘤微环境中的靶向基因表达）³²。我们之前已经证明Islr（含有富含亮氨酸的免疫球蛋白超家族重复序列）是一种CAF特异性基因，可诱导骨形态发生蛋白（BMP）信号传导，减少CRC类瘤生长，并促进LGR5 ⁺肠道干细胞分化²⁵。我们测试了AAV8介导的肝细胞中抑制癌基质基因Islr的过表达是否可以通过在AAV8-Islr处理的小鼠中进行CRC类肿瘤的门静脉注射来减弱肝转移进展。

在本文中，我们首先描述了肝热带AAV的尾静脉注射程序。然后，我们描述了一种用于拟肿瘤细胞制备和门静脉注射到AAV处理的小鼠中的方法。最后，我们提出了监测转移性肿瘤进展的方法，以评估基质靶向治疗的疗效。

研究方案

本文中的所有动物程序均由南澳大利亚州健康和医学研究所动物伦理委员会（批准号，SAM322）审查和批准。

1. 尾静脉注射腺相关病毒

注:腺相关病毒（AAV）应根据生物安全1级指南作为生物危害处理。请参阅已发布的 AAV 制备、纯化和滴定方案³³。肝细胞 - 热带AAV，AAV8³⁴，编码巨细胞病毒（CMV）启动子Islr 基因，用于本研究²⁵。为了诱导 AAV 介导的过表达，AAV 给药可能需要优化，具体取决于启动子活性、基因和小鼠体重。

1. 使用无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS）将AAV载体稀释到含有1.0 x^{10 11} 病毒基因组的150μL等分试样中，并将其保存在冰上。应穿戴个人防护装备以处理AAV。
   注意:反复冷冻和解冻循环会降低病毒滴度，应避免使用。储备病毒溶液应储存在-80°C冰箱中。
2. 打开加热箱（动物加热室）预热至35°C。
3. 握住小鼠，在尾静脉注射前至少15分钟将局部麻醉霜涂抹在尾巴的整个长度上。
   注意:这是一个可选步骤，如果该研究所的动物伦理委员会不要求，则可能不是必需的。遵循当地动物伦理委员会批准的协议。在该实验²⁵中，使用Rosa26-Cas9小鼠进行AAV注射和随后的CRC类器官的门静脉注射。鉴于本研究中使用的类瘤来自Rosa26-Cas9小鼠（C57BL / 6 x 129遗传背景），该小鼠菌株也被用作肿瘤移植的免疫功能正常的同源受体。使用雄性和雌性Rosa26-Cas9小鼠（6至24周龄）。
4. 将鼠标放入加热盒中。让鼠标保持长达15分钟，以温暖和扩张尾静脉。
5. 轻轻地将鼠标固定在啮齿动物约束器中。将尾巴放在加热灯下，以确保尾静脉完全扩张。
6. 用27-30G针头将150μL稀释的AAV（在步骤1.1中制备）吸入低死区无菌注射器中。
7. 移动加热灯并识别位于尾部两侧的侧尾静脉。用手指在尾巴上稍微张开，使尾巴变直。
8. 慢慢地将2-3毫米的针头，斜面向上插入静脉。针应几乎平行于尾巴（与尾巴最多15°）。
   注意:如果针头成功定位到静脉中，则可能会观察到血液流入注射器。
9. 慢慢注射。如果感觉到阻力或观察到皮肤肿胀，请取下针头并重新插入第一个部位上方或其他侧静脉。
10. 注射完成后等待约5秒，然后慢慢取出针头。立即用干净的纱布或纸巾轻轻按压注射部位，直到出血停止。
11. 轻轻地将鼠标释放到笼子中。监测动物以确保出血已经停止。
    注意:肝脏中的基因过表达可以在AAV尾静脉注射后1至2周进行评估。例如，这可以通过RNA原位杂交（ISH），免疫组织化学（IHC），蛋白质印迹或定量实时聚合酶链反应（qRT-PCR;图1A、B）。在先前发表的研究²⁵中，AAV8-Islr用于在肝细胞中过表达小鼠Islr基因，并且过表达由RNA ISH检测（图1A，B）。

2. 结直肠癌类器官的细胞制备

注意:用于本实验的CRC类器官仅含有上皮细胞。CRC类器官的培养和产生先前已经描述过^25，35。简而言之，使用隐窝分离缓冲液（冰冷PBS中5mM EDTA（乙二胺四乙酸酯））从Rosa26-Cas9小鼠的结肠中分离正常结肠上皮细胞，然后嵌入基底膜基质培养基中，并在参考³⁵中描述的类器官生长培养基中培养。然后，通过使用慢病毒表达方案过表达靶向Apc和Trp53的单导RNA，将Apc和Trp53突变引入结肠上皮细胞。手工挑选单个类器官克隆²⁵个。将pc^{Δ / Δ}和Trp53^{Δ / Δ}结肠癌类器官（AP类肿瘤）注射为5.0 x 10⁵单细胞，在100μLPBS中用10μM Y-27632进入每只小鼠的门静脉，具有如下所述的类器官培养和单细胞制备。

1. 在门静脉注射前3-5天，在24孔板或10cm培养皿中的基底膜基质中等圆顶中培养CRC类器官，以获得50-400μm直径的类器官。
2. 通过向10μM浓度加入Y-27632来制备足够量的细胞分离溶液，足以消化用于注射培养的类器官的数量。在37°C水浴中预热。
   注意:该方案中使用的细胞分离溶液是重组细胞解离酶混合物，在类器官培养中用作胰蛋白酶的替代品（见 材料表）。与胰蛋白酶³⁶相比，它减少了由细胞解离引起的细胞损伤。Y-27632是一种Rho激酶抑制剂，可抑制解离诱导的细胞死亡，从而提高单细胞^存活率37。
   1. 为了注射到最多五只小鼠中，制备两个含有40mL细胞分离溶液的管子以消化10-24×50μL基底膜基质圆顶，每个圆顶含有约300个类器官（直径50-400μm），即每只小鼠注射2-4.8个类器官圆顶（相当于约600-1440个类器官）。获得足够细胞数量所需的类器官数量取决于类器官系，因此应进行优化。
      注意:第二个40 mL管能够用新鲜的细胞分离溶液重复消化，以获得解离的单细胞。
3. 小心地从每个孔中吸取类器官培养基。
4. 向24孔板中的每个孔中加入1mL冰冷的PBS。如果使用10厘米的培养皿，则在培养皿中加入10毫升冰冷的PBS。
5. 使用P1000移液器吸头刮掉基底膜基质培养基。将PBS/培养基浆液转移到15 mL离心管中。
6. 用相同量的PBS冲洗每个孔，以收集基底膜基质片段并添加到15 mL管中。
7. 在冰上孵育5分钟。这种孵育有助于溶解基底膜基质介质。
8. 在4°C下以400× g 离心管5分钟。
9. 吸出上清液，确保不干扰沉淀培养基和细胞。
10. 向沉淀中加入5mL在步骤2.2中制备的预热细胞分离溶液，重悬沉淀10次，并将其转移回含有新鲜预热细胞分离溶液的50mL管中。
11. 将管置于37°C水浴中。孵育5分钟。
12. 在4°C下以400× g 离心管3分钟。
13. 重复步骤 2.9-2.11。
    注意:重复的酶消化允许细胞有效地解离成单个细胞。
14. 通过将100μL移液到96孔板中并在显微镜下观察来检查类器官是否解离成单个细胞。如果许多类器官显示由四个以上细胞组成的细胞团块，则可能需要使用细胞分离溶液进行更长时间的孵育，并通过用10 mL移液管研磨进行物理解离。
15. 一旦大多数细胞是单细胞，将4mL胎牛血清（FBS）加入40mL细胞悬浮液中以停止消化。用5 mL PBS冲洗40μm细胞过滤器。
16. 将细胞悬浮液通过细胞过滤器进入50 mL收集管中以除去任何细胞团块。
17. 在4°C下以400× g 离心管5分钟。
18. 吸出上清液。向细胞沉淀中加入10mL冷PBS并将其转移到15mL离心管中。
19. 在4°C下以400× g 离心管5分钟。
20. 吸出上清液。将沉淀重悬于500μL冷PBS中，用10μM Y-27632。计数细胞。
21. 使用带有10μM Y-27632的PBS将细胞浓度调节至^5.0 x 10 5个单细胞/ 100μL。将管子放在冰上，直到进行门静脉注射。
    注意:建议在解离后4小时内注射解离的细胞。

3. 门静脉注射CRC类器官

注意:所有手术器械和手术纱布必须在手术前进行高压灭菌或灭菌。该协议是从以前的协议^{17修改而来的}。在该实验²⁵中，使用步骤1中用AAV-mRuby2或AAV-Islr处理的Rosa26-Cas9小鼠进行门静脉注射。

1. 使用加热垫上的无菌窗帘准备无菌手术区域。
2. 准备手术器械（剪刀和镊子），手术和止血海绵，4-0聚乳素缝合线，棉签，皮肤订书机，吻合器施用器，盐水，丁丙诺啡和连接到汉密尔顿注射器的33G针头。将止血海绵切成1.0厘米x 1.0厘米的碎片。
3. 调整光源的位置以照亮手术区域。
4. 皮下注射0.1mg / kg体重的丁丙诺啡给小鼠进行手术疼痛管理。
5. 在麻醉室中用异氟醚麻醉小鼠。用于诱导和维持的异氟醚浓度通常分别为5%和2.5%。在开始下一个程序之前，检查脚趾捏合没有反应。
6. 用电动剃须刀剃除鼠标的中腹部至上腹部。剃须应在远离无菌手术区域的区域进行，以避免头发污染该部位。
7. 用Betadine和80%乙醇交替清洁切口部位，以对手术区域进行灭菌。重复三次。
8. 将小鼠置于加热垫上，以仰卧姿势进行维持异氟醚麻醉。在小鼠腹部放置一个带有孔的手术垂坠。
9. 用镊子抬起腹部皮肤，用剪刀在中线做一个2-3厘米的皮肤切口，只切开皮肤（不切下面的腹膜）。切口的范围应从中腹部到胸骨的xiphoid过程。切口不应高于剑突的下端。
10. 用镊子完全抬起腹膜壁，并用剪刀在腹膜上做一个类似的2-3厘米的切口。避免切开肠道和隔膜。
11. 用温盐水浸泡手术纱布，并将其放在切口的左侧（小鼠身体的左侧;外科医生的右侧）。
12. 用浸泡有盐水的棉签轻轻地将内脏（小肠和大肠）拉出。将肠道放在浸泡有盐水的纱布上。
    注意:应首先拔出小鼠的左侧肠（即外科医生右侧的肠），然后可以拔出小鼠的右侧肠（即外科医生左侧的肠）。
13. 调整肠道的位置以可视化门静脉。用额外的湿纱布覆盖肠道，以保持肠道湿润。
14. 用湿纱布轻轻地将肠道拉向左侧，并向左侧施加轻柔的张力。这有利于门静脉的可视化（图2A）。
    注意:如果门静脉的可视化很困难，用湿棉签轻轻调整胃的位置可能有助于可视化。
15. 轻轻移液类肿瘤悬浮液几次，以获得均匀的细胞悬浮液。慢慢地将100μL细胞悬浮液吸入连接到33G针头上的Hamilton注射器中。避免气泡。
16. 慢慢地将针头向上插入门静脉。沿针的插入深度应为3-4mm，针角几乎与门静脉平行。
    注意:注射应进行到门静脉的可视化部分（通常距离肝肺门2厘米）。避免针头在完全插入门静脉后移动。
17. 注射肿瘤细胞30秒。应缓慢进行注射，以防止门静脉闭塞。如果注射成功，肝脏的颜色暂时从红色变为白色。
18. 慢慢取下针头。立即用干燥的棉签对注射部位施加轻柔的压力，等待5分钟。
19. 取下棉签，同时将止血海绵涂抹在注射部位。用棉签或镊子握住止血海绵，再按压5分钟。
20. 消除止血海绵的压力，并确认注射部位没有出血。
    注意:生物可吸收的止血海绵不需要去除。试图去除纱布可能会导致注射部位再次出血。
21. 如果发生出血，立即用棉签进行压力止血约10分钟。然后，再涂抹额外的止血海绵5分钟。
    注意:如果观察到无法控制的失血，则应根据该研究所动物伦理委员会批准的协议对小鼠实施安乐死。
22. 取下肠道上的手术纱布。使用装有5 mL盐水的注射器，将盐水喷射到肠道以防止器官粘连。
    注意:不要将盐水施用于门静脉注射部位。这可能会导致再出血。
23. 轻轻地将肠道放回腹腔内。
24. 使用4-0个聚乳素缝合线缝合腹膜。
25. 用镊子抬起皮肤的两侧。使用皮肤吻合器关闭皮肤切口。注意不要缝合肠道。
26. 关闭异氟醚，但保持氧气流动。仔细监视鼠标。当鼠标醒来时，将鼠标放在加热垫上的空笼子中。小鼠通常在5分钟内醒来。
27. 仔细监视鼠标，直到它清醒并正常行走。
28. 手术后4小时皮下注射0.1mg / kg丁丙诺啡给小鼠。
29. 每24小时向小鼠注射0.1mg / kg丁丙诺啡，持续2天。
30. 手术后每天仔细监测小鼠一周。检查缝合线和伤口愈合。
31. 手术后几天，使用吻合器去除器去除皮肤吻合器。

4. 通过 体内 生物发光成像评估肿瘤生长动力学

注意:如果使用表达萤火虫的类肿瘤进行注射，则可以通过 体内 成像每周监测转移性肿瘤进展，如^38，39所述。癌细胞表达的荧光素酶可以引发针对癌细胞的免疫反应并限制肿瘤生长⁴⁰。因此，在使用表达荧光素酶的肿瘤细胞分析小鼠模型中的免疫表型和癌症进展时需要谨慎。

1. 使用无菌PBS制备30mg / mL的D-荧光素溶液。保护它免受光照。D-荧光素应以等分试样在-20°C下储存直至使用。
2. 用电子剃须刀剃除腹部和胸部。这可以在 体内 成像前1天完成。
3. 腹膜内注射150mg / kg体重的D-荧光素到小鼠体内（即，如果小鼠体重为30g，则注射150μLD-荧光素溶液）。
4. 将小鼠置于麻醉室中并麻醉它们。使用5%的异氟醚进行诱导，2%-3%用于维护。
5. 分钟后，将小鼠置于横向位置（右侧朝上）。使用如前所述^38，39的体内成像系统（IVIS）获取生物发光图像。
   注意:与仰卧位相比，小鼠在侧位更稳定。因此，横向位置优选从一致的焦平面获得发光图像。
6. 将小鼠放在空笼子中并监测它们的恢复情况。
7. 使用生活图像软件定义上腹部的感兴趣区域，如³⁸所述。量化总通量作为肿瘤细胞数的替代物。

5. 存活分析和组织收集

1. 仔细监测小鼠的转移的临床症状，如腹部膨胀。
2. 一旦小鼠达到人道终点，通过CO₂ 吸入对小鼠实施安乐死。
   注意:使用该研究所动物伦理委员会批准的研究终点。为了确定人道终点，使用了临床记录表;评分通过以下每个观察结果给出一个点来计算:体重减轻>15%，驼背姿势，褶皱的外套，脱水，运动减少，腹部膨胀或面部鬼脸。一旦达到3分，小鼠就被人道地安乐死。
3. 安乐死后，立即在通风橱中用30-50 mL的10%福尔马林进行经心灌注固定，如上所述⁴¹。在灌注之前，用剪刀在肝脏的正常部位做几个小切口（每个切口最多1厘米），以产生血液和福尔马林的出口。灌注后，肝脏颜色将从红色变为棕色。
   注意:如果宏观正常肝脏区域的微转移是研究对象，我们建议研究人员不要切开肝脏，而是剪掉上腔静脉。然而，当我们使用这种方法时，与切割肝脏相比，肝脏的固定似乎更差。特别是如果计划在肝脏切片上进行RNA 原位 杂交（ISH），我们建议在心脏内注射福尔马林之前切口肝脏，如上所述。这使得肝脏组织能够充分固定，从而保持ISH的RNA完整性。
4. 将肝脏和肺组织放入10%福尔马林中，固定过夜。用70%乙醇代替福尔马林，然后包埋石蜡。
5. 进行苏木精和曙红染色，以组织学评估肿瘤区域。对感兴趣的基质标志物进行免疫组化。进行Picro-Sirus红色染色以评估胶原蛋白阳性区域。
   注意:ImageJ 软件⁴² 可用于量化免疫组化和 Picro-Sirius Res 染色数据。颜色反卷积函数和MRI纤维化工具可用于分别评估3，3'-二氨基联苯胺（DAB）阳性区域和Picro-Sirius红色阳性区域。

结果

为了在肝细胞中诱导AAV介导的肿瘤抑制基质基因Islr^{4，25，43，44}的过表达，我们静脉注射编码AAV8的Islr。将AAV8-Islr的1.0×^{10 11}病毒基因组（vg）或作为对照，AAV8-mRuby2注射到成年小鼠尾静脉中（图1A）。尾静脉注射两周后，收获肝脏以验证Islr

讨论

在这项研究中，我们已经表明，门静脉注射小鼠CRC类器官可重复地产生富含成纤维细胞的肝脏转移，其类似于人CRC肝转移的组织学特征。此外，当与基质靶向治疗（如AAV8介导的基因治疗）结合使用时，该临床前模型可作为评估对小鼠生存和肿瘤生长的治疗效果的有用工具。

协议中至少有两个关键步骤。首先，重要的是通过完全胰蛋白酶消化类器官并使用网状过滤器去除细胞?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% Formalin	Sigma	HT501128
15 mL centrifuge tube	Corning	430791
33-gauge needle	TSK	LDS-33013	For portal vein injection
4-0 vicryl suture	ETHICON	J494G
40-µm cell strainer	Corning	431750
5 mL Syringe	BD	302130	Used to apply saline to the intestine after portal vein injection
50 mL centrifuge tube	Corning	430829
50 mL syringe	TERUMO	SS*50LE	Luer lock syringe for perfusion fixation
70% Isopropyl alcohol wipe	Briemar	5730
Anaesthesia machine	Darvall	9356
αSMA antibody	DAKO	M0851	Clone 1A4. 1/500 dilution for immunohistochemistry
Buprenorphine	TROY	N/A	ilium Temvet Injection, 300 µg/ml Buprenorphine
Cotton buds	Johnson & Johnson	N/A	Johnson's pure cotton bud applicators. Need to be autoclaved before use.
D-luciferin	Biosynth	L-8220
Electric shaver			Sold by multiple suppliers
Forceps			Sold by multiple suppliers
Hamilton syringe	HAMILTON	81020	For portal vein injection
Heat box (animal warming chamber)	Datesand	MK3
Heat lamp			Sold by multiple suppliers
Hemostatic sponge	Pfizer	09-0891-04-015	Gelfoam absorbable gelatin sponge, USP, 12-7 mm
India ink	Talens	44727000
Injection syringe and needle	BD	326769	For tail vein injection
Islr probe (RNAscope)	ACD	450041
Isoflurane	Henry Schein	988-3244
IVIS Spectrum In Vivo Imaging System	Perkin Elmer	124262
Living Image Software	Perkin Elmer	128113
Matrigel	Corning	356231
MRI fibrosis tool	N/A	N/A	https://github.com/MontpellierRessourcesImagerie/imagej_macros_and_scripts/wiki/MRI_Fibrosis_Tool
Phosphate-buffered saline (PBS)	Sigma	D8537
RNAscope kit	ACD	322300
Rodent restrainer			Sold by multiple suppliers
Rosa26-Cas9 mouse	The Jackson Laboratory	024858
Saline	Pfizer	PHA19042010
Scissors			Sold by multiple suppliers
Skin staplers	Able Scientific	AS59028	9 mm wound clips
Stapler applicator	Able Scientific	AS59026	9 mm wound clip applicator
Stapler remover	Able Scientific	AS59037	Wound clip remover
Surgical drape	Multigate	29-220
Surgical gauze	Sentry Medical	GS001
Topical anesthesia cream	EMLA	N/A	EMLA 5% cream, 25 mg/g lignocaine and 25 mg/g prilocaine
TrypLE Express	Gibco	12605028	Recombinant cell-dissociation enzyme mix
Y-27632	Tocris	1254