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  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

La inyección de organoides de cáncer colorrectal (CCR) en la vena porta genera metástasis hepáticas ricas en estroma. Este modelo de ratón de metástasis hepática del CCR representa una herramienta útil para estudiar las interacciones tumor-estroma y desarrollar nuevas terapias dirigidas al estroma, como las terapias génicas mediadas por virus adenoasociadas.

Resumen

La metástasis hepática del cáncer colorrectal (CCR) es una de las principales causas de muerte relacionada con el cáncer. Los fibroblastos asociados al cáncer (CAF), un componente importante del microambiente tumoral, desempeñan un papel crucial en la progresión metastásica del CCR y predicen el mal pronóstico del paciente. Sin embargo, hay una falta de modelos de ratón satisfactorios para estudiar la diafonía entre las células cancerosas metastásicas y los CAF. Aquí, presentamos un método para investigar cómo la progresión de la metástasis hepática está regulada por el nicho metastásico y posiblemente podría ser restringida por la terapia dirigida por el estroma. La inyección en la vena porta de organoides del CCR generó una reacción desmoplástica, que recapituló fielmente la histología rica en fibroblastos de las metástasis hepáticas del CCR humano. Este modelo fue específico del tejido con una mayor carga tumoral en el hígado en comparación con un modelo de inyección intraesplénica, lo que simplificó los análisis de supervivencia del ratón. Al inyectar organoides tumorales que expresan luciferasa, la cinética de crecimiento tumoral podría ser monitoreada por imágenes in vivo . Además, este modelo preclínico proporciona una plataforma útil para evaluar la eficacia de las terapias dirigidas al mesénquima tumoral. Se describen métodos para examinar si la administración mediada por virus adenoasociado de un gen estromal inhibidor del tumor a los hepatocitos podría remodelar el microambiente tumoral y mejorar la supervivencia del ratón. Este enfoque permite el desarrollo y la evaluación de nuevas estrategias terapéuticas para inhibir la metástasis hepática del CCR.

Introducción

El cáncer colorrectal (CCR) es una de las principales causas de mortalidad por cáncer en todo el mundo1. Más de la mitad de los pacientes con CCR desarrollan metástasis hepática que se produce a través de la diseminación de la venaporta 1. Actualmente, no existen terapias efectivas que puedan curar la metástasis hepática avanzada, y la mayoría de los pacientes sucumben a la enfermedad metastásica.

El nicho metastásico o microambiente tumoral desempeña un papel clave en el injerto y crecimiento de células ccroscópicas diseminadas2. Los fibroblastos asociados al cáncer (CAF), un componente prominente del microambiente tumoral, promueven o restringen la progresión del cáncer a través de la secreción de factores de crecimiento, la remodelación de la matriz extracelular (ECM) y la modulación de los paisajes inmunes y la angiogénesis 3,4,5. Los CAF también confieren resistencia a las quimioterapias e inmunoterapias3. Además, los CAF regulan el inicio y la progresión de la metástasis hepática del CCR y predicen el pronóstico en pacientes con CCR 3,6,7,8. Por lo tanto, los factores relacionados con CAF podrían ser explotados para el desarrollo de estrategias terapéuticas para inhibir la metástasis hepática del CCR. Sin embargo, la falta de modelos de ratón satisfactorios para estudiar el estroma tumoral metastásico ha sido un obstáculo importante para el desarrollo de terapias dirigidas al estroma.

Actualmente, los modelos animales para estudiar la metástasis hepática del CCR incluyen modelos primarios de CCR que desarrollan espontáneamente metástasis hepáticas y modelos de trasplante de células cancerosas en el hígado. Los modelos primarios de ratón CRC, como los modelos de ratón modificados genéticamente y la inyección colónica de células cancerosas, rara vez muestran metástasis en el hígado 9,10,11,12. Además, incluso si se observa una metástasis hepática, estos modelos muestran una latencia larga desde la inducción del tumor primario hasta la metástasis, y potencialmente mueren de carga tumoral primaria12. Para generar de manera eficiente metástasis hepáticas de CCR, las células de CCR cultivadas se trasplantan al hígado utilizando tres enfoques de inyección: inyección intraesplénica, inyección intraparenquimatosa directa en el hígado e inyección de vena porta. Las células cancerosas inyectadas intraesplenicalmente se diseminan a la vena esplénica, la vena porta y, en última instancia, al hígado13,14. Sin embargo, la inyección intraesplénica arroja una menor proporción de toma tumoral en comparación con otros modelos de trasplante15,16. Con la inyección intraesplénica, se realiza la extirpación quirúrgica del bazo para evitar el crecimiento de cáncer en el bazo, lo que puede comprometer potencialmente la maduración de las células inmunes17. Además, la inyección intraesplénica también puede provocar un crecimiento tumoral no intencionado en el bazo y la cavidad abdominal18, lo que complica los análisis de metástasis hepáticas. La inyección intraparenquimatosa directa en el hígado induce eficientemente la metástasis hepática 16,19,20. Sin embargo, este enfoque no recapitula completamente un paso biológico de la metástasis hepática que ocurre naturalmente a través de la diseminación de la vena porta. Mediante la inyección directa en el hígado, la entrada de células cancerosas en una circulación no portal, pero sistémica también puede dar lugar a múltiples metástasis pulmonares grandes16. Aunque la mayoría de los pacientes con metástasis hepática del CCR muestran múltiples nódulos tumorales en el hígado21, la inyección directa en un lóbulo hepático específico genera una sola masa tumoral19,20. La inyección de vena porta o la inyección de vena mesentérica, aunque técnicamente desafiante, permite la entrega eficiente de células tumorales en el hígado de una manera que recapitula los patrones de crecimiento observados en pacientes17. Esta estrategia puede minimizar la posibilidad de metástasis en el sitio secundario y permite un rápido crecimiento de las células cancerosas en el hígado, simplificando los análisis de supervivencia del ratón.

Históricamente, las líneas celulares de cáncer colorrectal como mc-38 de ratón, HT-29 humana y SW-620 se utilizaron para generar modelos de ratón de metástasis hepática22,23. Sin embargo, estas líneas celulares de cáncer colorrectal no inducen una reacción estromal desmoplástica. El bajo contenido estromal en los tumores dificulta la investigación de las funciones biológicas de los fibroblastos asociados al cáncer. Los avances recientes en los organoides del CCR y su trasplante han ofrecido plataformas útiles para evaluar las funciones vitales del estroma en la progresión del cáncer24. El trasplante hepático de organoides del CCR genera un microambiente tumoral rico en fibroblastos y ha proporcionado nuevos conocimientos sobre la investigación del estroma 6,25. Actualmente, la inyección de organoides en la vena portal o mesentérica se ha convertido en un enfoque estándar de oro para generar metástasis hepáticas de CCR 6,25,26,27,28. Sin embargo, hasta donde sabemos, ningún artículo anterior ha descrito métodos detallados para la inyección de tumores colorrectales en la vena porta. Aquí, presentamos una metodología para usar la inyección en la vena porta de organoides del CCR para desarrollar una nueva terapia dirigida por el estroma mediada por el virus adenoasociado (AAV).

Los hepatocitos son un componente importante del microambiente tumoral metastásico en el hígado y desempeñan un papel crítico en la progresión del cáncer metastásico29. Inspirados por el éxito de los enfoques de terapia génica AAV para inducir la expresión de proteínas en hepatocitos en pacientes no neoplásicos 30,31, investigamos un enfoque similar pero dirigido a modificar el microambiente tumoral hepático en CRC25. Como tal, también describimos aquí la inyección de la vena de la cola de AAV8 para inducir la expresión de proteínas antitumorales para modificar el microambiente tumoral hepático. El serotipo AAV8, designado por la elección de la proteína de la cápside viral durante la producción del virus, conduce a una alta eficiencia de transducción específicamente de los hepatocitos (es decir, la expresión génica dirigida en el microambiente tumoral hepático)32. Anteriormente hemos demostrado que Islr (superfamilia de inmunoglobulinas que contiene repetición rica en leucina) es un gen específico de CAF que induce la señalización de la proteína morfogenética ósea (BMP), reduce el crecimiento tumoroide del CCR y promueve la diferenciación de células madre intestinales Lgr5+ 25. Probamos si la sobreexpresión mediada por AAV8 del gen del estroma que restringe el cáncer, Islr, en hepatocitos podría atenuar la progresión de la metástasis hepática mediante la inyección en la vena porta de tumoroides del CCR en ratones tratados con AAV8-Islr.

En este artículo, primero describimos el procedimiento de inyección de la vena de la cola del AAV trópico hepático. Luego, describimos un método para la preparación de células tumoroides y la inyección de vena porta en los ratones tratados con AAV. Finalmente, presentamos enfoques para monitorear la progresión del tumor metastásico para evaluar la eficacia de la terapéutica dirigida por el estroma.

Protocolo

Todos los procedimientos con animales en este artículo fueron revisados y aprobados por el Comité de Ética Animal del Instituto de Salud e Investigación Médica de Australia del Sur (número de aprobación, SAM322).

1. Inyección en la vena de la cola del virus adenoasociado

NOTA: El virus adenoasociado (AAV) debe manejarse como un riesgo biológico bajo las pautas de Nivel 1 de Bioseguridad. Consulte el protocolo publicado para la preparación, purificación y titulación de AAV33. Eneste estudio se utilizó el AAV hepatocítico-trópico, AAV834, que codifica el gen promotor del citomegalovirus (CMV)-Islr. Para inducir la sobreexpresión mediada por AAV, la dosificación de AAV puede requerir optimización dependiendo de la actividad del promotor, el gen y el peso del ratón.

  1. Diluya el vector AAV en alícuotas de 150 μL que contengan 1,0 x 1011 genomas virales, utilizando solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS) y manténgalo en hielo. Se debe usar equipo de protección personal para manejar el AAV.
    NOTA: El ciclo repetido de congelación y descongelación disminuye el título del virus y debe evitarse. La solución viral madre debe almacenarse en un congelador de -80 °C.
  2. Encienda una caja de calor (cámara de calentamiento de animales) para precalentar a 35 °C.
  3. Sostenga un ratón y aplique una crema de anestesia tópica en toda la longitud de la cola al menos 15 minutos antes de la inyección de la vena de la cola.
    NOTA: Este es un paso opcional y podría no ser necesario si no es requerido por el comité de ética animal del instituto. Siga el protocolo aprobado por el comité local de ética animal. En este experimento25, se utilizó un ratón Rosa26-Cas9 para la inyección de AAV y la posterior inyección de organoides CRC en la vena porta. Dado que los tumoroides utilizados en este estudio se derivaron de un ratón Rosa26-Cas9 (antecedentes genéticos C57BL/6 x 129), esta cepa de ratón también se utilizó como receptores inmunocompetentes y singénicos del trasplante tumoral. Se utilizaron ratones Rosa26-Cas9 machos y hembras (de 6 a 24 semanas de edad).
  4. Coloque el ratón en la caja de calor. Deje que el ratón dure hasta 15 minutos para calentar y dilatar las venas de la cola.
  5. Asegure suavemente el mouse en un retenedor de roedores. Coloque la cola debajo de una lámpara de calor para garantizar la dilatación completa de las venas de la cola.
  6. Extraiga 150 μL de AAV diluido (preparado en la etapa 1.1) en una jeringa estéril de bajo espacio muerto con una aguja de 27-30 G.
  7. Mueva la lámpara de calor e identifique la vena lateral de la cola ubicada a los lados de la cola. Ponga una ligera tensión en la cola con los dedos para que la cola se vuelva recta.
  8. Inserte lentamente 2-3 mm de la aguja, bisel hacia arriba, en la vena. La aguja debe estar casi paralela a la cola (hasta 15° de la cola).
    NOTA: Se puede observar la afluencia de sangre en la jeringa si la aguja se localiza con éxito en la vena.
  9. Inyecte lentamente. Si se siente una resistencia o se observa hinchazón de la piel, retire la aguja y vuelva a insertarla por encima del primer sitio o en la otra vena lateral.
  10. Espere aproximadamente 5 s después de la finalización de la inyección y luego retire lentamente la aguja. Aplique inmediatamente una presión suave en el lugar de la inyección con una gasa limpia o una toalla de papel hasta que se detenga el sangrado.
  11. Suelte suavemente el ratón en su jaula. Controle al animal para asegurarse de que el sangrado se haya detenido.
    NOTA: La sobreexpresión de genes en el hígado se puede evaluar de 1 a 2 semanas después de la inyección de la vena de la cola AAV. Esto puede confirmarse, por ejemplo, mediante hibridación in situ de ARN (ISH), inmunohistoquímica (IHC), western blotting o reacción en cadena cuantitativa de la polimerasa en tiempo real (qRT-PCR; Figura 1A,B). En un estudio publicado previamente25, AAV8-Islr se utilizó para sobreexpresar el gen Islr de ratón en hepatocitos y la sobreexpresión fue detectada por ARN ISH (Figura 1A, B).

2. Preparación celular para organoides de cáncer colorrectal

NOTA: Los organoides del CCR utilizados para este experimento contienen únicamente células epiteliales. El cultivo y generación de organoides del CCR ha sido descrito previamente25,35. En resumen, las células epiteliales colónicas normales se aislaron del colon de un ratón Rosa26-Cas9 utilizando un tampón de aislamiento de cripta (EDTA de 5 mM (etilendiaminatetraacetato) en PBS helado), y luego se incrustaron en el medio de matriz de membrana basal y se cultivaron en medio de crecimiento organoide como se describe en la referencia35. Luego, las mutaciones de Apc y Trp53 se introdujeron en las células epiteliales colónicas mediante la sobreexpresión de ARN de guía única que se dirigen a Apc y Trp53 utilizando el protocolo de expresión de lentivirus. Los clones de organoides individuales fueron seleccionados a dedo25. Se inyectaron 5,Δ y Trp53Δ/Δ organoides de cáncer de colon (tumoroides AP) como 5,0 x 105 células individuales en 100 μL de PBS con 10 μM Y-27632 en la vena porta por ratón, con cultivo de organoides y preparación unicelular que se describen a continuación.

  1. Cultive los organoides CRC en las cúpulas medianas de la matriz de membrana basal en una placa de 24 pocillos o un plato de 10 cm 3-5 días antes de la inyección de la vena porta para obtener organoides de 50-400 μm de diámetro.
  2. Prepare una cantidad suficiente de solución de desprendimiento celular agregando Y-27632 a una concentración de 10 μM, suficiente para digerir el número de organoides que se cultivan para la inyección. Pre-caliente en un baño de agua a 37 °C.
    NOTA: La solución de desprendimiento celular utilizada en este protocolo es una mezcla de enzimas de disociación celular recombinante y se utiliza como sustituto de la tripsina en cultivo de organoides (ver Tabla de Materiales). Reduce el daño celular causado por la disociación celular en comparación con la tripsina36. Y-27632 es un inhibidor de la Rho quinasa e inhibe la muerte celular inducida por disociación, aumentando así la supervivencia unicelular37.
    1. Para la inyección en hasta cinco ratones, prepare dos tubos que contengan 40 ml de la solución de desprendimiento celular para digerir 10-24 x 50 μL de cúpulas de matriz de membrana basal con cada cúpula que contenga aproximadamente 300 organoides (50-400 μm de diámetro), es decir, cada ratón se inyecta con 2-4.8 domos de organoides (equivalente a aproximadamente 600-1440 organoides). El número de organoides necesarios para obtener un número suficiente de células depende de la línea organoide y, por lo tanto, debe optimizarse.
      NOTA: El segundo tubo de 40 ml permite una digestión repetida con solución de desprendimiento de células frescas para obtener células individuales disociadas.
  3. Aspire cuidadosamente el medio organoide de cada pozo.
  4. Agregue 1 ml de PBS helado a cada pozo en una placa de 24 pocillos. Si se usa un plato de 10 cm, agregue 10 ml de PBS helado al plato.
  5. Rasca el medio de la matriz de la membrana basal con una punta de pipeta P1000. Transfiera el PBS/purín medio a un tubo centrífugo de 15 ml.
  6. Enjuague cada pozo con la misma cantidad de PBS para recolectar fragmentos de matriz de membrana basal y agregarlos a los tubos de 15 ml.
  7. Incubar durante 5 min sobre hielo. Esta incubación ayuda a disolver el medio de la matriz de la membrana basal.
  8. Centrifugar el tubo a 400 x g durante 5 min a 4 °C.
  9. Aspire el sobrenadante asegurándose de no perturbar el medio peletizado y las células.
  10. Agregue 5 ml de solución de desprendimiento celular precalentado preparada en el paso 2.2 al pellet, vuelva a suspender el pellet 10 veces y transfiéralo de nuevo a un tubo de 50 ml que contenga una solución de desprendimiento celular fresca y precalentada.
  11. Coloque el tubo en el baño de agua a 37 °C. Incubar durante 5 min.
  12. Centrifugar el tubo a 400 x g durante 3 min a 4 °C.
  13. Repita los pasos 2.9 a 2.11.
    NOTA: La digestión enzimática repetida permite la disociación celular eficiente en células individuales.
  14. Compruebe si los organoides se disocian en células individuales pipeteando 100 μL en una placa de 96 pocillos y observando bajo un microscopio. Si muchos organoides muestran grupos celulares que consisten en más de cuatro células, puede ser necesaria una incubación más larga con la solución de desprendimiento celular y la disociación física por trituración con una pipeta de 10 ml.
  15. Una vez que la mayoría de las células son células individuales, agregue 4 ml de suero fetal bovino (FBS) en la suspensión celular de 40 ml para detener la digestión. Enjuague un colador de células de 40 μm con PBS de 5 ml.
  16. Pase la suspensión celular a través del colador celular en un tubo de recolección de 50 ml para eliminar cualquier grupo celular.
  17. Centrifugar el tubo a 400 x g durante 5 min a 4 °C.
  18. Aspirar el sobrenadante. Agregue 10 ml de PBS frío al pellet celular y transfiéralo a un tubo centrífugo de 15 ml.
  19. Centrifugar el tubo a 400 x g durante 5 min a 4 °C.
  20. Aspirar el sobrenadante. Resuspend el pellet en PBS frío de 500 μL con 10 μM Y-27632. Cuente las celdas.
  21. Ajuste la concentración celular a 5.0 x 105 celdas individuales/100 μL, usando PBS con 10 μM Y-27632. Coloque el tubo sobre hielo hasta que se realice la inyección de la vena porta.
    NOTA: Se recomienda inyectar células disociadas dentro de las 4 h posteriores a la disociación.

3. Inyección en la vena porta de organoides del CCR

NOTA: Todos los instrumentos quirúrgicos y gasas quirúrgicas deben ser esterilizados en autoclave o esterilizados antes de la cirugía. Este protocolo se modifica a partir de un protocolo anterior17. En este experimento25, la inyección de la vena porta se realizó utilizando ratones Rosa26-Cas9 tratados con AAV-mRuby2 o AAV-Islr en el paso 1.

  1. Prepare un área quirúrgica aséptica usando cortinas estériles en una almohadilla térmica.
  2. Prepare instrumentos quirúrgicos (tijeras y fórceps), esponja quirúrgica y hemostática, sutura de poliglactina 4-0, bastoncillos de algodón, grapadoras para la piel, aplicador de grapadora, solución salina, buprenorfina y aguja de 33 G unida a una jeringa Hamilton. Cortar la esponja hemostática en trozos de 1,0 cm x 1,0 cm.
  3. Ajuste la posición de la fuente de luz para iluminar el área quirúrgica.
  4. Inyecte 0,1 mg/kg de buprenorfina por vía subcutánea a un ratón para el manejo quirúrgico del dolor.
  5. Anestesiar al ratón con isoflurano en una cámara de anestesia. La concentración de isoflurano para inducción y mantenimiento suele ser del 5% y el 2,5%, respectivamente. Verifique la ausencia de una reacción al pellizco del dedo del pie antes de comenzar el siguiente procedimiento.
  6. Afeitarse la mitad hasta la parte superior del abdomen del ratón con una afeitadora eléctrica. El afeitado debe realizarse en un área distante del área quirúrgica aséptica para evitar que el cabello contamine el sitio.
  7. Limpie el sitio de la incisión alternando con Betadine y etanol al 80% para esterilizar el área quirúrgica. Repetir tres veces.
  8. Coloque el ratón sobre una almohadilla térmica en posición supina con anestesia de isoflurano de mantenimiento. Coloque una cortina quirúrgica con un orificio sobre el abdomen del ratón.
  9. Levante la piel abdominal con fórceps y haga una incisión cutánea de 2-3 cm en la línea media con tijeras, cortando solo la piel (no el peritoneo subyacente). La incisión debe variar desde la mitad del abdomen hasta el proceso xifoide del esternón. La incisión no debe ir por encima del extremo inferior del proceso xifoide.
  10. Levante completamente la pared peritoneal con fórceps y haga una incisión similar de 2-3 cm al peritoneo con tijeras. Evite cortar el intestino y el diafragma.
  11. Remoje la gasa quirúrgica con solución salina tibia y colóquela en el lado izquierdo de la incisión (en el lado izquierdo del cuerpo del ratón; a la derecha del cirujano).
  12. Extraiga suavemente los órganos internos (intestino delgado y grueso) con un bastoncillo de algodón empapado con solución salina. Coloque los intestinos sobre la gasa empapada con solución salina.
    NOTA: Los intestinos del lado izquierdo del ratón (es decir, los intestinos a la derecha del cirujano) deben extraerse primero, y luego se pueden extraer los intestinos del lado derecho del ratón (es decir, los intestinos a la izquierda del cirujano).
  13. Ajuste la posición de los intestinos para visualizar la vena porta. Cubra los intestinos con una gasa húmeda adicional para mantener los intestinos húmedos.
  14. Tire suavemente del intestino hacia el lado izquierdo con la gasa húmeda y aplique una tensión suave hacia la izquierda. Esto facilita la visualización de la vena porta (Figura 2A).
    NOTA: Si la visualización de la vena porta es difícil, ajustar suavemente la posición del estómago con un bastoncillo de algodón húmedo podría ayudar a la visualización.
  15. Pipetee suavemente la suspensión tumoroide varias veces para obtener una suspensión celular homogénea. Extraiga lentamente 100 μL de la suspensión celular en una jeringa Hamilton conectada a una aguja de 33 G. Evite las burbujas de aire.
  16. Inserte lentamente la aguja, biselada, en la vena porta. La profundidad de inserción a lo largo de la aguja debe ser de 3-4 mm, con el ángulo de la aguja casi paralelo a la vena porta.
    NOTA: La inyección debe realizarse en la parte bien visualizada de la vena porta (generalmente hasta 2 cm de distancia del hilio hepático). Evite el movimiento de la aguja después de que se inserte completamente en la vena porta.
  17. Inyecte células tumorales durante 30 s. La inyección debe realizarse lentamente para evitar la oclusión de la vena porta. Si la inyección es exitosa, el color del hígado cambia temporalmente de rojo a blanco.
  18. Retire la aguja lentamente. Aplique inmediatamente una presión suave en el lugar de la inyección con un bastoncillo de algodón seco y espere 5 minutos.
  19. Retire el bastoncillo de algodón y aplique simultáneamente una esponja hemostática en el lugar de la inyección. Sostenga la esponja hemostática con un bastoncillo de algodón o fórceps y aplique una presión suave durante 5 minutos más.
  20. Retire la presión a la esponja hemostática y confirme que no hay sangrado del sitio de inyección.
    NOTA: La esponja hemostática bioabsorbible no necesita ser removida. Tratar de quitar la gasa podría causar un nuevo sangrado del sitio de la inyección.
  21. Si se produce sangrado, realice inmediatamente la hemostasia a presión con un bastoncillo de algodón durante aproximadamente 10 minutos. Luego, aplique una esponja hemostática adicional durante otros 5 minutos.
    NOTA: Si se observa una pérdida de sangre incontrolable, el ratón debe ser sacrificado de acuerdo con el protocolo aprobado por el comité de ética animal del instituto.
  22. Retire las gasas quirúrgicas en los intestinos. Usando una jeringa llena de solución salina de 5 ml, arroje solución salina a los intestinos para prevenir la adhesión de órganos.
    NOTA: No aplique solución salina en el sitio de inyección de la vena porta. Esto podría causar un nuevo sangrado.
  23. Coloque suavemente los intestinos dentro de la cavidad abdominal.
  24. Sutura el peritoneo usando 4-0 suturas de poliglactina.
  25. Levante ambos lados de la piel con fórceps. Aplique grapadoras para la piel para cerrar la incisión en la piel. Tenga cuidado de no grapar el intestino.
  26. Apague el isoflurano pero mantenga el flujo de oxígeno en funcionamiento. Controle cuidadosamente el ratón. Cuando el ratón se despierte, colóquelo en una jaula vacía sobre una almohadilla térmica. El ratón normalmente se despierta en 5 minutos.
  27. Controle cuidadosamente al ratón hasta que esté consciente y deambulando normalmente.
  28. Inyecte por vía subcutánea 0,1 mg/kg de buprenorfina al ratón 4 h después de la cirugía.
  29. Inyecte 0,1 mg/kg de buprenorfina al ratón cada 24 horas durante los 2 días siguientes.
  30. Controle cuidadosamente a los ratones diariamente durante una semana después de la cirugía. Revise las suturas y la cicatrización de heridas.
  31. días después de la cirugía, retire las grapadoras de piel con un removedor de grapadora.

4. Evaluación de la cinética de crecimiento tumoral mediante imágenes bioluminiscentes in vivo

NOTA: Si se utilizan tumoroides que expresan luciérnagas para la inyección, la progresión del tumor metastásico se puede controlar semanalmente mediante imágenes in vivo como se describe38,39. La luciferasa expresada por las células cancerosas podría provocar respuestas inmunes contra las células cancerosas y limitar el crecimiento tumoral40. Por lo tanto, se justifica la precaución al analizar los fenotipos inmunes y la progresión del cáncer en un modelo de ratón utilizando células tumorales que expresan luciferasa.

  1. Prepare una solución de 30 mg/ml de D-luciferina usando PBS estéril. Protégelo de la luz. La D-luciferina debe almacenarse en alícuotas a -20 °C hasta su uso.
  2. Afeitarse el abdomen y el tórax con una afeitadora electrónica. Esto se puede hacer hasta 1 día antes de la obtención de imágenes in vivo .
  3. Inyectar 150 mg/kg de peso corporal de D-luciferina por vía intraperitoneal en ratones (es decir, si el peso corporal del ratón es de 30 g, inyectar 150 μL de la solución de D-luciferina).
  4. Coloque a los ratones en una cámara de anestesia y anestéselos. Utilice un 5% de isoflurano para la inducción y un 2%-3% para el mantenimiento.
  5. Min más tarde, coloque los ratones en una posición lateral (lado derecho hacia arriba). Adquirir imágenes de bioluminiscencia utilizando un sistema de imagen in vivo (IVIS) como se describió anteriormente38,39.
    NOTA: Los ratones son más estables en una posición lateral en comparación con la posición supina. Por lo tanto, una posición lateral es preferible para obtener una imagen de luminiscencia a partir de un plano focal consistente.
  6. Coloque a los ratones en una jaula vacía y controle su recuperación.
  7. Defina las regiones de interés en la parte superior del abdomen utilizando Living Image Software como se describe38. Cuantificar el flujo total como sustituto del número de células tumorales.

5. Análisis de supervivencia y recolección de tejidos

  1. Monitoree cuidadosamente a los ratones para detectar síntomas clínicos de metástasis como un abdomen distendido.
  2. Sacrificar a un ratón por inhalación de CO2 una vez que alcanza puntos finales humanos.
    NOTA: Utilice un criterio de valoración del estudio aprobado por el comité de ética animal del instituto. Para determinar un criterio de valoración humano, se utilizó una hoja de registro clínico; las puntuaciones se calcularon por un punto dado para la presencia de cada una de las siguientes observaciones: pérdida de peso > 15%, postura encorvada, pelaje con volantes, deshidratación, disminución del movimiento, abdomen distendido o mueca facial. Una vez que se alcanzó una puntuación de 3, los ratones fueron sacrificados humanamente.
  3. Inmediatamente después de la eutanasia, realizar la fijación de perfusión transcárdica con 30-50 mL de formalina al 10% en una campana de humos, como se describe41. Haga varias incisiones pequeñas (hasta 1 cm cada una) con tijeras en la parte normal del hígado antes de la perfusión para generar salidas para la sangre y la formalina. Tras la perfusión, el color del hígado cambiará de rojo a marrón.
    NOTA: Si las micrometástasis en áreas hepáticas macroscópicamente normales son un tema de estudio, recomendamos a los investigadores que no corten el hígado, sino que corten la vena cava superior. Sin embargo, cuando hemos utilizado este método, la fijación del hígado parece más pobre en comparación con cortar el hígado. Especialmente si se planea realizar hibridación in situ de ARN (ISH) en secciones hepáticas, recomendamos hacer incisiones en el hígado antes de la inyección intracardíaca de formalina, como se describió anteriormente. Esto permite una fijación suficiente del tejido hepático, lo que resulta en la preservación de la integridad del ARN para ISH.
  4. Coloque el hígado y los tejidos pulmonares en formalina al 10% y fije durante la noche. Reemplace la formalina con etanol al 70%, seguido de incrustación de parafina.
  5. Realizar tinción de hematoxilina y eosina para evaluar histológicamente el área tumoral. Realizar inmunohistoquímica para marcadores estromales de interés. Realice la tinción de Picro-Sirus Red para evaluar las áreas positivas para el colágeno.
    NOTA: El software ImageJ42 se puede utilizar para cuantificar datos de inmunohistoquímica y tinción de Picro-Sirius Res. Se puede utilizar una función de deconvolución de color y la herramienta de fibrosis por resonancia magnética para evaluar las áreas positivas para 3,3'-diaminobenzidina (DAB) y las áreas rojas positivas de Picro-Sirius, respectivamente.

Resultados

Para inducir la sobreexpresión mediada por AAV de un gen del estroma que restringe el tumor, Islr 4,25,43,44, en hepatocitos, inyectamos por vía intravenosa AAV8 que codifica Islr. 1.0 x 1011 genomas virales (vg) de AAV8-Islr, o como control, AAV8-mRuby2, se inyectaron en la vena de la cola del ratón adulto (Figura 1A

Discusión

En este estudio, hemos demostrado que la inyección en la vena porta de organoides del CCR de ratón genera de forma reproducible metástasis hepáticas ricas en fibroblastos que imitan las características histológicas de las metástasis hepáticas del CCR humano. Además, cuando se combina con terapias dirigidas por el estroma, como la terapia génica mediada por AAV8, este modelo preclínico sirve como una herramienta útil para evaluar los efectos terapéuticos sobre la supervivencia del ratón y el crecimiento tumo...

Divulgaciones

Los autores declaran que no hay conflictos de intereses.

Agradecimientos

Este estudio fue apoyado por subvenciones del Consejo Nacional de Salud e Investigación Médica (APP1156391 a D.L.W., S.L.W.) (APP1081852 a D.L.W., APP1140236 a S.L.W., APP1099283 a D.L.W.,); Cancer Council SA Beat Cancer Project en nombre de sus donantes y el Gobierno del Estado de Australia del Sur a través del Departamento de Salud (MCF0418 a S.L.W., D.L.W.); una subvención para la investigación científica (B) (20H03467 a M.T.) encargada por el Ministerio de Educación, Cultura, Deportes, Ciencia y Tecnología del Japón; AMED-CREST (Agencia Japonesa de Investigación y Desarrollo Médico, Core Research for Evolutional Science and Technology (19gm0810007h0104 y 19gm1210008s0101 a A.E.); el Proyecto para la Investigación del Cáncer y la Evolución Terapéutica (P-CREATE) de AMED (19cm0106332h0002 a A.E.); Japan Society for the Promotion of Science Overseas Challenge Program for Young Researchers (a H.K.), Takeda Science Foundation Fellowship (a H.K.), Greaton International Ph.D. Scholarship (a H.K.), Lions Medical Research Foundation Scholarship (a K.G.).

Agradecemos al Dr. Leszek Lisowski en Vector and Genome Engineering Facility (VGEF), Children's Medical Research Institute (CMRI) (NSW, AUSTRALIA) por producir vectores AAV recombinantes.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
10% FormalinSigmaHT501128
15 mL centrifuge tubeCorning430791
33-gauge needleTSKLDS-33013For portal vein injection
4-0 vicryl sutureETHICONJ494G
40-µm cell strainerCorning431750
5 mL SyringeBD302130Used to apply saline to the intestine after portal vein injection
50 mL centrifuge tubeCorning430829
50 mL syringeTERUMOSS*50LELuer lock syringe for perfusion fixation
70% Isopropyl alcohol wipeBriemar5730
Anaesthesia machineDarvall9356
αSMA antibodyDAKOM0851Clone 1A4. 1/500 dilution for immunohistochemistry
BuprenorphineTROYN/Ailium Temvet Injection, 300 µg/ml Buprenorphine
Cotton budsJohnson & JohnsonN/AJohnson's pure cotton bud applicators. Need to be autoclaved before use.
D-luciferinBiosynthL-8220
Electric shaverSold by multiple suppliers
ForcepsSold by multiple suppliers
Hamilton syringeHAMILTON81020For portal vein injection
Heat box (animal warming chamber)DatesandMK3
Heat lampSold by multiple suppliers
Hemostatic spongePfizer09-0891-04-015Gelfoam absorbable gelatin sponge, USP, 12-7 mm
India inkTalens44727000
Injection syringe and needleBD326769For tail vein injection
Islr probe (RNAscope)ACD450041
IsofluraneHenry Schein988-3244
IVIS Spectrum In Vivo Imaging SystemPerkin Elmer124262
Living Image SoftwarePerkin Elmer128113
MatrigelCorning356231
MRI fibrosis toolN/AN/Ahttps://github.com/MontpellierRessourcesImagerie/imagej_macros_and_scripts/wiki/MRI_Fibrosis_Tool
Phosphate-buffered saline (PBS)SigmaD8537
RNAscope kitACD322300
Rodent restrainerSold by multiple suppliers
Rosa26-Cas9 mouseThe Jackson Laboratory024858
SalinePfizerPHA19042010
ScissorsSold by multiple suppliers
Skin staplersAble ScientificAS590289 mm wound clips
Stapler applicatorAble ScientificAS590269 mm wound clip applicator
Stapler removerAble ScientificAS59037Wound clip remover
Surgical drapeMultigate29-220
Surgical gauzeSentry MedicalGS001
Topical anesthesia creamEMLAN/AEMLA 5% cream, 25 mg/g lignocaine and 25 mg/g prilocaine
TrypLE ExpressGibco12605028Recombinant cell-dissociation enzyme mix
Y-27632Tocris1254

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