Portal Injeção de Veia de Organoides de Câncer Colorretal para Estudar o Estroma metástase hepática

Resumo

A injeção de veia portal de organoides de câncer colorretal (CRC) gera metástase hepática rica em estroma. Este modelo de camundongos de metástase hepática crc representa uma ferramenta útil para estudar interações tumorais-estroma e desenvolver novas terapêuticas dirigidas a estroma, como terapias genéticas mediadas por vírus associados ao adeno.

Resumo

A metástase hepática do câncer colorretal (CRC) é uma das principais causas de morte relacionada ao câncer. Os fibroblastos associados ao câncer (CAFs), um dos principais componentes do microambiente tumoral, desempenham um papel crucial na progressão metastática do CRC e predizem um prognóstico ruim do paciente. No entanto, há falta de modelos satisfatórios de camundongos para estudar o crosstalk entre células cancerígenas metastáticas e CAFs. Aqui, apresentamos um método para investigar como a progressão da metástase hepática é regulada pelo nicho metastático e possivelmente poderia ser contida pela terapia dirigida por estroma. A injeção de veia portal de organoides crc gerou uma reação desmoplástica, que recapitulou fielmente a histologia rica em fibroblasto de metástases hepáticas crc humanas. Este modelo foi específico do tecido com maior carga tumoral no fígado quando comparado a um modelo de injeção intra-esplênica, simplificando as análises de sobrevivência do camundongo. Ao injetar organoides tumorais que expressam luciferase, a cinética de crescimento tumoral poderia ser monitorada por imagens in vivo . Além disso, este modelo pré-clínico fornece uma plataforma útil para avaliar a eficácia da terapêutica voltada para o mesenquime tumoral. Descrevemos métodos para examinar se a entrega mediada por vírus adeno de um gene estromal inibidor de tumores para hepatócitos poderia remodelar o microambiente tumoral e melhorar a sobrevivência do camundongo. Essa abordagem permite o desenvolvimento e a avaliação de novas estratégias terapêuticas para inibir a metástase hepática do CRC.

Introdução

O câncer colorretal (CRC) é uma das principais causas de mortalidade por câncer em todo o mundo¹. Mais da metade dos pacientes do CRC desenvolve metástase hepática que ocorre através da disseminação venosa^{do portal 1}. Atualmente, não há terapêuticas eficazes que possam curar metástase hepática avançada, e a maioria dos pacientes sucumbe à doença metastática.

O nicho metastático ou microambiente tumoral desempenha um papel fundamental no enenxermento e crescimento das células CRC disseminadas². Os fibroblastos associados ao câncer (CAFs), um componente proeminente do microambiente tumoral, promovem ou restringem a progressão do câncer através de fatores de crescimento secretos, remodelação da matriz extracelular (ECM) e modulação de paisagens imunes e angiogênese ^3,4,5. Os CAFs também conferem resistência às quimioterapias e imunoterápicos³. Além disso, os CAFs regulam a iniciação e progressão da metástase hepática do CRC e prevêem prognóstico em pacientes com C CRC 3,6,7,8. Assim, fatores relacionados ao CAF poderiam ser explorados para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas para inibir a metástase hepática do CRC. No entanto, a falta de modelos satisfatórios de camundongos para estudar o estromoma tumoral metastático tem sido um grande obstáculo para o desenvolvimento de terapias direcionadas ao estroma.

Atualmente, modelos animais para estudar metástase hepática crc incluem modelos primários de CRC que desenvolvem espontaneamente modelos de metástase hepática e transplante de células cancerosas no fígado. Modelos primários de camundongos CRC, como modelos de camundongos geneticamente modificados e injeção cólon de células cancerosas, raramente apresentam metástase no fígado 9,10,11,12. Além disso, mesmo que seja observada uma metástase hepática, esses modelos mostram longa latência desde a indução do tumor primário até a metástase, e potencialmente morrem de carga tumoral primária¹². Para gerar eficientemente metástases hepáticas crc, células de CRC cultivadas são transplantadas no fígado usando três abordagens de injeção: injeção intra-esplênica, injeção intra-parenchímal direta no fígado e injeção de veia portal. Células cancerígenas injetadas intra-esplenticamente se espalharam pela veia esplênica, a veia portal, e, finalmente, para o fígado^13,14. No entanto, a injeção intra-esplênica produz uma menor relação de dor tumoral em comparação com outros modelos de transplante^15,16. Com injeção intra-esplênica, a remoção cirúrgica do baço é realizada para evitar o crescimento do câncer no baço, o que pode comprometer potencialmente a maturação das células imunes¹⁷. Além disso, a injeção intra-esplênica também pode resultar em crescimento tumoral não intencional no baço e cavidade abdominal¹⁸, complicando as análises de metástase hepática. A injeção intra-pareínrima direta no fígado induz eficientemente a metástase hepática 16,19,20. No entanto, essa abordagem não recapitula totalmente um passo biológico de metástase hepática que ocorre naturalmente através da disseminação da veia portal. Usando injeção direta no fígado, a entrada de células cancerígenas em um não-portal, mas a circulação sistêmica também pode resultar em múltiplas metástases pulmonares^{grandes 16}. Embora a maioria dos pacientes com metástase hepática CRC apresentem nódulos tumorais múltiplos no fígado²¹, a injeção direta em um lobo hepático específico gera uma única massa tumoral^19,20. A injeção de veia portal ou injeção de veia mesentérico, embora tecnicamente desafiadora, permite a entrega eficiente de células tumorais no fígado de forma a recapitular os padrões de crescimento vistos em pacientes¹⁷. Essa estratégia pode minimizar a possibilidade de metástases de local secundário e permite o rápido crescimento de células cancerígenas no fígado, simplificando as análises de sobrevivência do camundongo.

Historicamente, linhas de células cancerígenas colorretais como o mouse MC-38, o HT-29 humano e o SW-620 foram usadas para gerar modelos de camundongos de metástase hepática^22,23. No entanto, essas linhas de células cancerígenas colorretais não induzem uma reação escromato desmoplástica. O baixo teor estroma nos tumores dificulta a investigação dos papéis biológicos dos fibroblastos associados ao câncer. Os recentes avanços nos organoides de CRC e seus transplantes têm oferecido plataformas úteis para avaliar papéis vitais do estroma na progressão^{do câncer 24}. O transplante de fígado de organoides CRC gera um microambiente tumoral rico em fibroblasto e forneceu novas informações sobre a pesquisa estromal ^6,25. Atualmente, a injeção de veias mesentóricas de organoides tornou-se uma abordagem padrão-ouro para gerar metástase hepática CRC 6,25,26,27,28. No entanto, pelo que sabemos, nenhum trabalho anterior descreveu métodos detalhados para a injeção venosa portal de tumoróides colorretais. Aqui, apresentamos uma metodologia para o uso da injeção venosa portal de organoides CRC para desenvolver uma nova terapia orientada a adeno -mediada pelo estromoma ..

Os hepatócitos são um importante constituinte do microambiente tumoral metastático no fígado e desempenham um papel crítico na progressão do câncer metastático²⁹. Inspirados pelo sucesso das abordagens da terapia genética AAV para induzir a expressão proteica em hepatocitos em pacientes não neoplásicos^30,31, investigamos uma abordagem semelhante, mas que visava modificar o microambiente do tumor hepático no CRC²⁵. Como tal, também descrevemos aqui a injeção da veia da cauda do AAV8 para induzir a expressão de proteínas anti-tumorigênicas para modificar o microambiente tumoral hepático. O sorotipo AAV8, designado pela escolha da proteína capsida viral durante a produção do vírus, leva à alta eficiência de transdução especificamente dos hepatócitos (ou seja, expressão genética direcionada no microambiente do tumor hepático)³². Já mostramos anteriormente que islr (superfamília imunoglobulina contendo repetição rica em leucina) é um gene específico da CAF que induz a sinalização de proteína morfogenética óssea (BMP), reduz o crescimento tumoróide do CRC e promove a diferenciação de células-tronco intestinais Lgr5⁺²⁵. Testamos se a superexpressão mediada pelo AAV8 do gene estromal que restringe o câncer, Islr, em hepatócitos poderia atenuar a progressão da metástase hepática realizando a injeção de veia portal de tumoróides CRC em camundongos tratados com AAV8-Islr.

Neste artigo, descrevemos primeiro o procedimento de injeção da veia da cauda do AAV trópico hepático. Em seguida, descrevemos um método de preparação de células tumoróides e injeção de veia portal nos camundongos tratados com AAV. Por fim, apresentamos abordagens para monitorar a progressão do tumor metastático para avaliar a eficácia da terapêutica dirigida ao estroma.

Protocolo

Todos os procedimentos animais deste artigo foram revisados e aprovados pelo Comitê de Ética Animal do Instituto de Saúde e Pesquisa Médica da Austrália do Sul (número de aprovação, SAM322).

1. Injeção de veia de cauda do vírus associado ao adeno

NOTA: O vírus associado ao Adeno (AAV) deve ser tratado como um risco biológico sob as diretrizes de Nível 1 de Biossegurança. Consulte o protocolo publicado para preparação, purificação e titulação³³ da AAV. Hepatocyte-trópico AAV, AAV8³⁴, codificando o gene promotor-Islr citomegalovírus (CMV), foi utilizado neste estudo²⁵. Para induzir a superexpressão mediada pelo AAV, a dosagem AAV pode exigir otimização dependendo da atividade do promotor, do gene e do peso do mouse.

1. Diluir o vetor AAV em 150 alíquotas μL contendo 1,0 x 10¹¹ genomas virais, usando soro fisiológico estéril tamponado de fosfato (PBS) e mantê-lo no gelo. Os equipamentos de proteção individual devem ser usados para manusear o AAV.
   NOTA: O ciclo repetido de congelamento e degelo diminui o titulação do vírus e deve ser evitado. A solução viral de estoque deve ser armazenada em um congelador de -80 °C.
2. Ligue uma caixa de calor (câmara de aquecimento animal) para pré-aquecer a 35 °C.
3. Segure um mouse e aplique um creme de anestesia tópico em toda a extensão da cauda pelo menos 15 minutos antes da injeção da veia da cauda.
   NOTA: Esta é uma etapa opcional e pode não ser necessária se não for exigida pelo comitê de ética animal do instituto. Siga o protocolo aprovado pelo comitê local de ética animal. Neste experimento²⁵, um rato Rosa26-Cas9 foi usado para injeção de AAV e subsequente injeção de veia portal de organoides CRC. Dado que os tumoróides utilizados neste estudo foram derivados de um camundongo Rosa26-Cas9 (fundo genético C57BL/6 x 129), esta cepa de camundongos também foi utilizada como imunocompetente, receptores síngênicos do transplante tumoral. Foram utilizados camundongos Rosa26-Cas9 masculinos e femininos (de 6 a 24 semanas de idade).
4. Coloque o mouse na caixa de calor. Deixe o mouse por até 15 minutos para aquecer e dilatar as veias da cauda.
5. Segure suavemente o mouse em um cabisto de roedores. Coloque a cauda sob uma lâmpada de calor para garantir a dilatação total das veias da cauda.
6. Desenhe 150 μL de AAV diluído (preparado na etapa 1.1) em uma seringa estéril de espaço baixo com uma agulha de 27-30 G.
7. Mova a lâmpada de calor e identifique a veia traseira lateral localizada nas laterais da cauda. Coloque uma leve tensão na cauda com os dedos para que a cauda fique reta.
8. Insira lentamente 2-3 mm da agulha, bisbida para cima, na veia. A agulha deve ser quase paralela à cauda (até 15° da cauda).
   NOTA: O fluxo sanguíneo na seringa pode ser observado se a agulha estiver localizada com sucesso na veia.
9. Injete lentamente. Se for observada uma resistência ou o inchaço da pele, remova a agulha e reinsira acima do primeiro local ou da outra veia lateral.
10. Aguarde cerca de 5 s após a conclusão da injeção e, em seguida, remova lentamente a agulha. Aplique imediatamente pressão suave no local da injeção com uma gaze limpa ou papel toalha até que o sangramento pare.
11. Solte suavemente o mouse em sua gaiola. Monitore o animal para garantir que o sangramento tenha parado.
    NOTA: A superexpressão genética no fígado pode ser avaliada de 1 a 2 semanas após a injeção da veia da cauda AAV. Isso pode ser confirmado, por exemplo, por RNA in situ hibridização (ISH), imunohistoquímica (IHC), mancha ocidental ou reação quantitativa em cadeia de polimerase em tempo real (qRT-PCR; Figura 1A,B). Em um estudo publicado anteriormente²⁵, a AAV8-Islr foi usada para sobreexpressar o gene islr do rato em hepatócitos e a superexpressão foi detectada pelo RNA ISH (Figura 1A,B).

2. Preparação celular para organoides de câncer colorretal

NOTA: Os organoides crc utilizados para este experimento contêm apenas células epiteliais. A cultura e geração de organoides de CRC foi descrita anteriormente^25,35. Em suma, as células epiteliais coloniais normais foram isoladas do cólon de um rato Rosa26-Cas9 usando um tampão de isolamento cripto (5 mM EDTA (ethylenodiaminetetraacetatato) em PBS gelado), e então incorporada na matriz média da membrana do porão, e cultivada em meio de crescimento organoide, conforme descrito na referência³⁵. Em seguida, mutações Apc e Trp53 foram introduzidas nas células epiteliais coloniais, superexpressando RNAs de guia único que visam Apc e Trp53 usando protocolo de expressão de lentivírus. Os clones organoides foram escolhidos a dedo²⁵. Umpc^Δ/Δe Trp53^{Δ/Δ tumoróides} de câncer de cólon (tumoróides AP), foram injetados como 5,0 x 10⁵ células únicas em 100 μL de PBS com 10 μM Y-27632 na veia portal por rato, com cultura organoide e preparação unicelular descrita abaixo.

1. Cultura os organoides CRC na matriz de membrana do porão cúpulas médias em uma placa de 24 poços ou 10 cm prato 3-5 dias antes da injeção de veia portal para obter organoides de 50-400 μm de diâmetro.
2. Prepare quantidade suficiente de solução de descolamento celular adicionando concentração de Y-27632 a 10 μM, o suficiente para digerir o número de organoides que estão sendo cultivados para a injeção. Pré-aqueça em um banho de água de 37 °C.
   NOTA: A solução de descolamento celular utilizada neste protocolo é uma mistura de enzimas de dissociação celular recombinante e é usada como um substituto para a trippsina na cultura organoide (ver Tabela de Materiais). Reduz os danos celulares causados pela dissociação celular em comparação com a trippsina³⁶. Y-27632 é um inibidor de Rho quinase e inibe a morte celular induzida pela dissociação, aumentando assim a sobrevivência de^{células únicas 37}.
   1. Para injeção em até cinco camundongos, prepare dois tubos contendo 40 mL da solução de descolamento celular para digerir 10-24 x 50 μL de cúpulas de matriz de membrana de porão com cada cúpula contendo aproximadamente 300 organoides (50-400 μm de diâmetro), ou seja, cada rato é injetado com 2-4,8 cúpulas de organoides (equivalente a cerca de 600-1440 organoides). O número de organoides necessários para obter número celular suficiente depende da linha organoide e, portanto, deve ser otimizado.
      NOTA: O segundo tubo de 40 mL permite uma digestão repetida com solução de descolamento de células frescas para obter células únicas dissociadas.
3. Aspire cuidadosamente o meio organoide de cada poço.
4. Adicione 1 mL de PBS gelado a cada poço em uma placa de 24 poços. Se um prato de 10 cm for usado, adicione 10 mL de PBS gelado ao prato.
5. Risque o meio da matriz da membrana do porão usando uma ponta de pipeta P1000. Transfira o pbs/chorume médio para um tubo de centrífuga de 15 mL.
6. Enxágüe cada poço com a mesma quantidade de PBS para coletar fragmentos da matriz da membrana do porão e adicionar ao tubo de 15 mL(s).
7. Incubar por 5 minutos no gelo. Esta incubação ajuda a dissolver o meio da matriz da membrana do porão.
8. Centrifugar o tubo a 400 x g por 5 min a 4 °C.
9. Aspire o supernascido garantindo não perturbar o meio e as células pelleted.
10. Adicione 5 mL de solução de descolamento de células pré-aquecidas preparada na etapa 2.2 à pelota, resuspenque a pelota 10 vezes e transfira-a de volta para um tubo de 50 mL contendo solução de descolamento celular fresca e pré-aquecida.
11. Coloque o tubo no banho de água de 37 °C. Incubar por 5 minutos.
12. Centrifugar o tubo a 400 x g por 3 min a 4 °C.
13. Repetir as etapas 2.9-2.11.
    NOTA: A digestão enzimática repetida permite a dissociação celular eficiente em células únicas.
14. Verifique se os organoides são dissociados em células únicas, pipetando 100 μL em uma placa de 96 poços e observando sob um microscópio. Se muitos organoides apresentarem aglomerados celulares constituídas por mais de quatro células, pode ser necessária uma maior incubação com a solução de descolamento celular e dissociação física por trituração com uma pipeta de 10 mL.
15. Uma vez que a maioria das células são células únicas, adicione 4 mL de soro bovino fetal (FBS) na suspensão celular de 40 mL para parar a digestão. Enxágüe um coador de células de 40 μm com PBS de 5 mL.
16. Passe a suspensão celular através do coador de células em um tubo de coleta de 50 mL para remover qualquer aglomerado de células.
17. Centrifugar o tubo a 400 x g por 5 min a 4 °C.
18. Aspire o supernatante. Adicione 10 mL de PBS frio à pelota celular e transfira-a para um tubo de centrífuga de 15 mL.
19. Centrifugar o tubo a 400 x g por 5 min a 4 °C.
20. Aspire o supernatante. Resuspenda a pelota em PBS frio de 500 μL com 10 μM Y-27632. Conte as células.
21. Ajuste a concentração celular para 5,0 x 10⁵ células únicas/100 μL, utilizando PBS com 10 μM Y-27632. Coloque o tubo no gelo até que a injeção venosa do portal seja realizada.
    NOTA: Recomenda-se injetar células dissociadas dentro de 4h de dissociação.

3. Portal de injeção venosa de organoides CRC

NOTA: Todos os instrumentos cirúrgicos e gazes cirúrgicas devem ser autoclavados ou esterilizados antes da cirurgia. Este protocolo é modificado a partir de um protocolo anterior¹⁷. Neste experimento²⁵, a injeção de veia portal foi realizada utilizando-se camundongos Rosa26-Cas9 tratados com AAV-mRuby2 ou AAV-Islr na etapa 1.

1. Prepare uma área cirúrgica asséptica usando cortinas estéreis em uma almofada de aquecimento.
2. Prepare instrumentos cirúrgicos (tesouras e fórceps), esponja cirúrgica e hemostática, sutura de poliglactina 4-0, botões de algodão, grampeadores de pele, aplicador de grampeador, soro fisiológico, buprenorfina e agulha de 33 G presa a uma seringa Hamilton. Corte a esponja hemostática em pedaços de 1,0 cm x 1,0 cm.
3. Ajuste a posição da fonte de luz para iluminar a área cirúrgica.
4. Injete 0,1 mg/kg de peso corporal de buprenorfina subcutânea em um rato para o tratamento cirúrgico da dor.
5. Anestesiar o rato com isoflurano em uma câmara de anestesia. A concentração de isoflurane para indução e manutenção costuma ser de 5% e 2,5%, respectivamente. Verifique se há ausência de uma reação ao aperto do dedo antes de iniciar o próximo procedimento.
6. Raspe o meio para o abdômen superior do mouse com uma máquina de barbear elétrica. A barba deve ser realizada em uma área distante da área cirúrgica asséptica para evitar que o cabelo contamine o local.
7. Limpe o local de incisão alternando com Betadine e 80% de etanol para esterilizar a área cirúrgica. Repita três vezes.
8. Coloque o mouse em uma almofada de aquecimento em uma posição supina com anestesia isoflurane de manutenção. Coloque uma cortina cirúrgica com um orifício sobre o abdômen do rato.
9. Levante a pele abdominal com fórceps e faça uma incisão de pele de 2-3 cm na linha média com uma tesoura, cortando apenas a pele (não subjacente ao peritônio). A incisão deve variar do abdômen médio ao processo xiphoide do esterno. A incisão não deve ir acima da extremidade inferior do processo xiphoide.
10. Levante totalmente a parede peritoneal com fórceps e faça uma incisão semelhante de 2-3 cm ao peritônio com uma tesoura. Evite cortar o intestino e o diafragma.
11. Mergulhe a gaze cirúrgica com soro fisiológico quente e coloque-a no lado esquerdo da incisão (no lado esquerdo do corpo do camundongo; à direita do cirurgião).
12. Puxe suavemente os órgãos internos (intestinos pequenos e grandes) usando um broto de algodão encharcado com soro fisiológico. Coloque os intestinos sobre a gaze encharcada com soro fisiológico.
    NOTA: Os intestinos do lado esquerdo do camundongo (ou seja, intestinos à direita do cirurgião) devem ser retirados primeiro, e então os intestinos do lado direito do rato (ou seja, intestinos à esquerda do cirurgião) podem ser retirados.
13. Ajuste a posição dos intestinos para visualizar a veia do portal. Cubra os intestinos com gaze molhada adicional para manter os intestinos úmidos.
14. Puxe suavemente o intestino para o lado esquerdo com a gaze molhada e aplique uma tensão suave à esquerda. Isso facilita a visualização da veia portal (Figura 2A).
    NOTA: Se a visualização da veia do portal for difícil, ajustar suavemente a posição do estômago com um broto de algodão molhado pode ajudar na visualização.
15. Suspensão tumoróide de pipeta suavemente várias vezes para obter uma suspensão celular homogênea. Desenhe lentamente 100 μL da suspensão da célula em uma seringa Hamilton presa a uma agulha de 33 G. Evite bolhas de ar.
16. Insira lentamente a agulha, bisbisse para cima, na veia portal. A profundidade de inserção ao longo da agulha deve ser de 3-4 mm, com o ângulo da agulha quase paralelo à veia portal.
    NOTA: A injeção deve ser realizada na parte bem visualizada da veia portal (geralmente até 2 cm de distância do hilum hepático). Evite o movimento da agulha depois de totalmente inserida na veia portal.
17. Injete células tumorais por 30 anos. A injeção deve ser realizada lentamente para evitar a oclusão da veia portal. Se a injeção for bem sucedida, a cor do fígado muda temporariamente de vermelho para branco.
18. Remova a agulha lentamente. Aplique imediatamente pressão suave no local da injeção com um broto de algodão seco e espere por 5 min.
19. Retire o broto de algodão e aplique simultaneamente uma esponja hemostática no local da injeção. Segure a esponja hemostática com um broto de algodão ou fórceps e aplique pressão suave por mais 5 minutos.
20. Remova a pressão para a esponja hemostática e confirme que não há sangramento do local da injeção.
    NOTA: A esponja hemostática bio absorvível não precisa ser removida. Tentar remover a gaze pode causar hemorragia do local da injeção.
21. Se ocorrer sangramento, realize imediatamente hemostase de pressão com um broto de algodão por cerca de 10 minutos. Em seguida, aplique uma esponja hemostática adicional por mais 5 minutos.
    NOTA: Se observar a perda de sangue incontrolável, o camundongo deve ser eutanizado de acordo com o protocolo aprovado pelo comitê de ética animal do instituto.
22. Remova as gazes cirúrgicas nos intestinos. Usando uma seringa cheia de soro fisiológico de 5 mL, esguiche soro fisiológico nos intestinos para evitar a adesão dos órgãos.
    NOTA: Não aplique soro fisiológico no site de injeção de veias do portal. Isso pode causar hemorragia.
23. Coloque suavemente os intestinos de volta dentro da cavidade abdominal.
24. Sutura o peritônio usando suturas de poliglactina 4-0.
25. Levante os dois lados da pele com fórceps. Aplique grampos de pele para fechar a incisão da pele. Tenha cuidado para não grampear o intestino.
26. Desligue o isoflurane, mas mantenha o fluxo de oxigênio funcionando. Monitore cuidadosamente o mouse. Quando o mouse acordar, coloque o mouse em uma gaiola vazia em uma almofada de aquecimento. O rato normalmente acorda dentro de 5 minutos.
27. Monitore cuidadosamente o mouse até que ele esteja consciente e ambulando normalmente.
28. Injete subcutâneamente 0,1 mg/kg de buprenorfina no camundongo 4h após a cirurgia.
29. Injete 0,1 mg/kg de buprenorfina no mouse a cada 24 horas durante os 2 dias seguintes.
30. Monitore cuidadosamente os ratos diariamente durante uma semana após a cirurgia. Verifique suturas e cicatrização de feridas.
31. dias após a cirurgia, remova os grampeadores da pele usando um removedor de grampeador.

4. Avaliação da cinética de crescimento tumoral por imagem bioluminescente in vivo

NOTA: Se os tumoróides que expressam firefly forem usados para injeção, a progressão do tumor metastático pode ser monitorada semanalmente por imagens in vivo, conforme descrito^38,39. A luciferase expressa por células cancerosas poderia provocar respostas imunes contra as células cancerosas e limitar o crescimento do tumor⁴⁰. Assim, a cautela é justificada na análise de fenótipos imunológicos e progressão do câncer em um modelo de camundongo usando células tumorais que expressam a luciferase.

1. Prepare uma solução de 30 mg/mL de D-luciferin utilizando PBS estéril. Proteja-o da luz. A d-luciferina deve ser armazenada em alíquotas a -20 °C até o uso.
2. Raspe o abdômen e o tórax com uma máquina de barbear eletrônica. Isso pode ser feito até 1 dia antes da imagem in vivo .
3. Injete 150 mg/kg de peso corporal de D-luciferin intraperitoneal em camundongos (ou seja, se o peso corporal do rato for de 30 g, injete 150 μL da solução D-luciferina).
4. Coloque os ratos em uma câmara de anestesia e anestesia-os. Use 5% de isoflurane para indução e 2%-3% para manutenção.
5. min depois, coloque os ratos em uma posição lateral (lado direito para cima). Adquira imagens de bioluminescência usando um sistema de imagem in vivo (IVIS) conforme descrito anteriormente^38,39.
   NOTA: Os ratos são mais estáveis em uma posição lateral em comparação com a posição supina. Portanto, uma posição lateral é preferível para obter uma imagem de luminescência de um plano focal consistente.
6. Coloque os ratos em uma gaiola vazia e monitore sua recuperação.
7. Defina regiões de interesse no abdômen superior usando o Living Image Software como descrito³⁸. Quantifique o fluxo total como substituto para o número de células tumorais.

5. Análise de sobrevivência e coleta de tecidos

1. Monitore os camundongos cuidadosamente para sintomas clínicos de metástases, como um abdômen distendido.
2. Eutanize um rato por inalação de CO₂ quando atingir pontos finais humanos.
   NOTA: Utilize um ponto final de estudo aprovado pelo comitê de ética animal do instituto. Para determinar um ponto final humano, foi utilizada uma ficha de registro clínico; os escores foram calculados por um ponto para a presença de cada uma das seguintes observações: perda de peso > 15%, postura curvada, casaco de babados, desidratação, diminuição do movimento, abdômen distendido ou careta facial. Uma vez que uma pontuação de 3 foi alcançada, os ratos foram humanamente eutanizados.
3. Imediatamente após a eutanásia, realize a fixação da perfusão transcárdia com 30-50 mL de 10% de formalina em um capô de fumaça, como descrito⁴¹. Faça várias pequenas incisões (até 1 cm cada) com tesoura na parte normal do fígado antes da perfusão para gerar saídas para sangue e formalina. Após a perfusão, a cor do fígado mudará de vermelho para marrom.
   NOTA: Se micrometastases em áreas hepáticas macroscopicamente normais são objeto de estudo, recomendamos aos pesquisadores que não cortem o fígado, mas cortem a cava vena superior. No entanto, quando usamos este método, a fixação do fígado parece mais pobre quando comparada com o corte do fígado. Especialmente se o RNA in situ hibridização (ISH) for planejado para ser realizado em seções hepáticas, recomendamos fazer incisões no fígado antes da injeção intra-cardíaca de formalina, como descrito acima. Isso permite fixação suficiente do tecido hepático, resultando na preservação da integridade do RNA para ISH.
4. Coloque os tecidos hepáticos e pulmonares em 10% de formalina e fixe durante a noite. Substitua a formalina por 70% de etanol, seguida de incorporação de parafina.
5. Realizar a coloração de hematoxilina e eosina para avaliar histologicamente a área do tumor. Realize a imunohistoquímica para marcadores estromatrais de interesse. Realize a coloração picro-sirus vermelha para avaliar áreas positivas de colágeno.
   NOTA: O software ImageJ⁴² pode ser usado para quantificar os dados de coloração da imunohistoquímica e do Picro-Sirius Res. Uma função de desconvolução de cores e a ferramenta de fibrose de ressonância magnética podem ser usadas para avaliar áreas positivas de 3,3'-Diaminobenzidina (DAB) e áreas vermelho-positivas picro-sirius, respectivamente.

Resultados

Para induzir a superexpressão mediada pelo AAV de um gene escroto de contenção de tumores, Islr 4,25,43,44, em hepatócitos, injetamos intravenosamente AAV8 codificadora de Islr. 1.0 x 10¹¹ genomas virais (vg) de AAV8-Islr, ou como controle, AAV8-mRuby2, foi injetado na veia da cauda do rato adulto (Figura 1A). Duas...

Discussão

Neste estudo, mostramos que a injeção de veia portal de organoides de CRC do camundongo gera reproduzivelmente metástases hepáticas ricas em fibroblastos que imitam características histológicas de metástases hepáticas crc humanas. Além disso, quando combinado com terapêuticas dirigidas ao estroma, como a terapia genética mediada pelo AAV8, este modelo pré-clínico serve como uma ferramenta útil para avaliar os efeitos terapêuticos sobre a sobrevivência do camundongo e o crescimento do tumor.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% Formalin	Sigma	HT501128
15 mL centrifuge tube	Corning	430791
33-gauge needle	TSK	LDS-33013	For portal vein injection
4-0 vicryl suture	ETHICON	J494G
40-µm cell strainer	Corning	431750
5 mL Syringe	BD	302130	Used to apply saline to the intestine after portal vein injection
50 mL centrifuge tube	Corning	430829
50 mL syringe	TERUMO	SS*50LE	Luer lock syringe for perfusion fixation
70% Isopropyl alcohol wipe	Briemar	5730
Anaesthesia machine	Darvall	9356
αSMA antibody	DAKO	M0851	Clone 1A4. 1/500 dilution for immunohistochemistry
Buprenorphine	TROY	N/A	ilium Temvet Injection, 300 µg/ml Buprenorphine
Cotton buds	Johnson & Johnson	N/A	Johnson's pure cotton bud applicators. Need to be autoclaved before use.
D-luciferin	Biosynth	L-8220
Electric shaver			Sold by multiple suppliers
Forceps			Sold by multiple suppliers
Hamilton syringe	HAMILTON	81020	For portal vein injection
Heat box (animal warming chamber)	Datesand	MK3
Heat lamp			Sold by multiple suppliers
Hemostatic sponge	Pfizer	09-0891-04-015	Gelfoam absorbable gelatin sponge, USP, 12-7 mm
India ink	Talens	44727000
Injection syringe and needle	BD	326769	For tail vein injection
Islr probe (RNAscope)	ACD	450041
Isoflurane	Henry Schein	988-3244
IVIS Spectrum In Vivo Imaging System	Perkin Elmer	124262
Living Image Software	Perkin Elmer	128113
Matrigel	Corning	356231
MRI fibrosis tool	N/A	N/A	https://github.com/MontpellierRessourcesImagerie/imagej_macros_and_scripts/wiki/MRI_Fibrosis_Tool
Phosphate-buffered saline (PBS)	Sigma	D8537
RNAscope kit	ACD	322300
Rodent restrainer			Sold by multiple suppliers
Rosa26-Cas9 mouse	The Jackson Laboratory	024858
Saline	Pfizer	PHA19042010
Scissors			Sold by multiple suppliers
Skin staplers	Able Scientific	AS59028	9 mm wound clips
Stapler applicator	Able Scientific	AS59026	9 mm wound clip applicator
Stapler remover	Able Scientific	AS59037	Wound clip remover
Surgical drape	Multigate	29-220
Surgical gauze	Sentry Medical	GS001
Topical anesthesia cream	EMLA	N/A	EMLA 5% cream, 25 mg/g lignocaine and 25 mg/g prilocaine
TrypLE Express	Gibco	12605028	Recombinant cell-dissociation enzyme mix
Y-27632	Tocris	1254