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要約

結腸直腸癌(CRC)オルガノイドの門脈注入は、間質に富む肝転移を生じる。CRC肝転移のこのマウスモデルは、腫瘍間質相互作用を研究し、アデノ随伴ウイルス媒介遺伝子治療などの新規間質指向性治療薬を開発するための有用なツールである。

要約

結腸直腸癌(CRC)の肝転移は、癌関連死の主要な原因である。腫瘍微小環境の主要成分であるがん関連線維芽細胞(CAF)は、転移性CRCの進行に重要な役割を果たし、患者の予後不良を予測します。しかしながら、転移性癌細胞とCAFとの間のクロストークを研究するための満足のいくマウスモデルが不足している。ここでは、肝転移の進行が転移ニッチによってどのように調節され、間質指向性治療によって抑制される可能性があるかを調べる方法を提示する。CRCオルガノイドの門脈注入はデスモプラスティック反応を生じ、ヒトCRC肝転移の線維芽細胞に富む組織像を忠実に再現した。このモデルは、脾臓内注射モデルと比較して肝臓の腫瘍量が高い組織特異的であり、マウスの生存率解析を簡素化した。ルシフェラーゼ発現腫瘍オルガノイドを注入することにより、腫瘍増殖動態を in vivo イメージングによってモニターすることができた。さらに、この前臨床モデルは、腫瘍間葉系を標的とする治療薬の有効性を評価するための有用なプラットフォームを提供する。我々は、アデノ随伴ウイルス媒介性腫瘍阻害間質遺伝子の肝細胞への送達が腫瘍微小環境を再構築し、マウスの生存率を改善できるかどうかを調べる方法について説明する。このアプローチは、CRCの肝転移を阻害するための新規治療戦略の開発および評価を可能にする。

概要

結腸直腸癌(CRC)は、世界中の癌死亡率の主要な原因である1。CRC患者の半数以上が門脈播種1を介して起こる肝転移を発症する。現在、進行した肝転移を治すことができる有効な治療法はなく、ほとんどの患者は転移性疾患に屈する。

転移性ニッチまたは腫瘍微小環境は、播種性CRC細胞2の生着および増殖において重要な役割を果たす。腫瘍微小環境の顕著な構成要素である癌関連線維芽細胞(CAF)は、増殖因子の分泌、細胞外マトリックス(ECM)のリモデリング、免疫ランドスケープおよび血管新生の調節を通じて癌の進行を促進または抑制する3、4、5。CAFはまた、化学療法および免疫療法に対する耐性を付与する3.さらに、CAFはCRC肝転移の開始および進行を調節し、CRC3、6、7、8患者の予後を予測する。したがって、CAF関連因子は、CRC肝転移を阻害する治療戦略の開発のために利用され得る。しかしながら、転移性腫瘍間質を研究するための満足のいくマウスモデルの欠如は、間質標的療法を開発する上で大きな障害となってきた。

現在、CRC肝転移を研究する動物モデルには、肝臓への肝転移を自発的に発症する原発性CRCモデルおよび癌細胞移植モデルが含まれる。遺伝子操作されたマウスモデルおよび癌細胞の結腸注射などの初代CRCマウスモデルは、肝臓への転移をめったに示さない9、10、11、12。さらに、肝転移が観察されたとしても、これらのモデルは原発性腫瘍誘導から転移までの潜伏時間が長く、原発性腫瘍量で死亡する可能性がある12。CRC肝転移を効率的に生成するために、培養したCRC細胞を、脾臓内注射、肝臓への直接実質内注射、門脈注射の3つの注射アプローチを用いて肝臓に移植する。脾臓内注射された癌細胞は、脾静脈、門脈、そして最終的には肝臓に広がった13、14。しかしながら、脾臓内注射は、他の移植モデルと比較して低い腫瘍採取比をもたらす15、16。脾臓内注射では、脾臓における癌の増殖を避けるために脾臓の外科的除去が行われ、これは潜在的に免疫細胞成熟を損なう可能性がある17。さらに、脾臓内注射はまた、脾臓および腹腔18において意図しない腫瘍増殖をもたらし得、肝転移分析を複雑にする。肝臓への直接実質内注射は、効率的に肝転移を誘導する16、19、20。それにもかかわらず、このアプローチは、門脈播種を介して自然に起こる肝転移の生物学的ステップを完全には再現しない。肝臓への直接注射を用いて、癌細胞の非門脈への侵入、しかし全身循環はまた、複数の大きな肺転移をもたらし得る16。CRC肝転移を有する患者の大多数は肝臓21に複数の腫瘍結節を示すが、特定の肝葉への直接注射は単一の腫瘍塊19、20を生成する。門脈注射または腸間膜静脈注射は、技術的には困難であるが、患者17において見られる成長パターンを反復する様式で肝臓への腫瘍細胞の効率的な送達を可能にする。この戦略は、二次部位転移の可能性を最小限に抑え、肝臓における癌細胞の急速な増殖を可能にし、マウスの生存率分析を簡素化する。

歴史的に、マウスMC-38、ヒトHT-29、およびSW-620などの結腸直腸癌細胞株は、肝転移22、23のマウスモデルを作製するために使用されていた。しかしながら、これらの結腸直腸癌細胞株は、デスモプラスティック間質反応を誘導しない。腫瘍中の間質含有量が低いと、がん関連線維芽細胞の生物学的役割を調べることが困難になります。CRCオルガノイドとその移植における最近の進歩は、がんの進行における間質の重要な役割を評価するための有用なプラットフォームを提供している24。CRCオルガノイドの肝移植は、線維芽細胞に富む腫瘍微小環境を生成し、間質研究に新たな洞察を提供してきた6,25。現在、オルガノイドの門脈または腸間膜静脈注射は、CRC肝転移を発生させるためのゴールドスタンダードアプローチとなっている6、25、26、27、28。それにもかかわらず、我々の知る限り、結腸直腸腫瘍イドの門脈注入のための詳細な方法を記載した以前の論文はない。ここでは、CRCオルガノイドの門脈注入を用いて、新規アデノ随伴ウイルス(AAV)媒介間質指向療法を開発するための方法論を提示する。

肝細胞は、肝臓における転移性腫瘍微小環境の重要な構成要素であり、転移性癌の進行において重要な役割を果たす29。非腫瘍性患者30、31の肝細胞におけるタンパク質発現を誘導するAAV遺伝子治療アプローチの成功に触発され、我々は同様のアプローチを調査したが、CRC25における肝腫瘍微小環境を改変することを目指した。そのようにして、我々はまた、肝腫瘍微小環境を改変する抗腫瘍化タンパク質の発現を誘導するAAV8の尾静脈注射を本明細書に記載する。ウイルス産生中のウイルス性カプシドタンパク質の選択によって指定されるAAV8血清型は、肝細胞の特異的な高い形質導入効率(すなわち、肝腫瘍微小環境における標的遺伝子発現)をもたらす32。我々は以前、Islr(ロイシンリッチリピートを含む免疫グロブリンスーパーファミリー)が、骨形成タンパク質(BMP)シグナル伝達を誘導し、CRC腫瘍様増殖を減少させ、Lgr5+腸幹細胞分化を促進するCAF特異的遺伝子であることを示した25。我々は、AAV8-Islr治療マウスにおいてCRC腫瘍イドの門脈注射を行うことによって、肝細胞における癌抑制間質遺伝子IslrのAAV8媒介性過剰発現が肝転移進行を減弱させることができるかどうかを試験した。

本稿では、まず肝熱帯性AAVの尾静脈注射手順について説明する。次に、AAV処理マウスへの腫瘍様細胞調製および門脈注入の方法について説明する。最後に、間質指向性治療薬の有効性を評価するために転移性腫瘍の進行をモニターするためのアプローチを提示する。

プロトコル

この記事のすべての動物手順は、南オーストラリア州保健医療研究所動物倫理委員会(承認番号、SAM322)によってレビューおよび承認されました。

1. アデノ随伴ウイルスの尾静脈注射

注:アデノ随伴ウイルス(AAV)は、バイオセーフティレベル1ガイドラインの下でバイオハザードとして扱われるべきです。AAVの調製、精製、および滴定に関する公開プロトコル33を参照してください。肝細胞指向性AAV、AAV834、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター−Islr 遺伝子をコードする、本研究25に使用した。AAV媒介性過剰発現を誘導するために、AAV投与は、プロモーター活性、遺伝子、およびマウス体重に応じて最適化を必要とするかもしれない。

  1. AAVベクターを1.0 x 1011ウイルスゲノムを含む150 μLアリコートに希釈し、滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)を使用し、氷上に保管する。AAVを取り扱うために個人用保護具を着用する必要があります。
    注:凍結と解凍のサイクルを繰り返すと、ウイルス力価が低下するため、避けてください。ストックウイルス溶液は、-80°Cの冷凍庫に保存する必要があります。
  2. ヒートボックス(動物温暖化室)の電源を入れて35°Cに予熱します。
  3. マウスを保持し、尾静脈注射の少なくとも15分前に尾の全長に局所麻酔クリームを塗布する。
    注:これはオプションのステップであり、研究所の動物倫理委員会によって要求されていない場合は、必要でない場合があります。地元の動物倫理委員会によって承認されたプロトコルに従ってください。この実験25では、Rosa26-Cas9マウスをCRCオルガノイドのAAV注射およびその後の門脈注射に使用した。この研究で使用された腫瘍イドがRosa26-Cas9マウス(C57BL/6 x 129の遺伝的背景)に由来することを考えると、このマウス株は腫瘍移植の免疫能力のある同系レシピエントとしても使用された。雄および雌のRosa26-Cas9マウス(6〜24週齢)を用いた。
  4. マウスをヒートボックスに入れます。マウスを最大15分間放置して、尾静脈を温めて拡張します。
  5. マウスをげっ歯類の拘束具に静かに固定します。尾を熱ランプの下に置き、尾静脈が完全に拡張されるようにします。
  6. 150μLの希釈AAV(ステップ1.1で調製)を27〜30G針で低デッドスペース滅菌シリンジに引き込む。
  7. ヒートランプを動かし、尾の側面にある側方尾静脈を特定します。尾がまっすぐになるように指で尾に少し緊張をかけます。
  8. 2〜3mmの針をゆっくりと挿入し、斜めにして静脈に入れます。針は尾とほぼ平行でなければなりません(尾から最大15°)。
    注:注射器への血液流入は、針が静脈に正常に配置されている場合に観察されることがあります。
  9. ゆっくりと注入する。抵抗が感じられたり、皮膚の腫れが観察された場合は、針を外し、最初の部位の上または他の側静脈に再挿入してください。
  10. 注射の完了後約5秒待ってから、ゆっくりと針を抜く。出血が止まるまで、清潔なガーゼまたはペーパータオルで注射部位に直ちに穏やかな圧力をかけてください。
  11. マウスをケージにそっと放します。出血が止まったことを確認するために動物を監視します。
    注:肝臓における遺伝子の過剰発現は、AAV尾静脈注射の1〜2週間後に評価することができる。これは、例えば、RNA in situハイブリダイゼーション(ISH)、免疫組織化学(IHC)、ウェスタンブロッティング、または定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(qRT-PCR;図1A、B)。以前に発表された研究25では、AAV8-Islrを用いて肝細胞においてマウスIslr遺伝子を過剰発現させ、その過剰発現をRNA ISHによって検出した(図1A、B)。

2. 結腸直腸癌オルガノイドの細胞製剤

注:この実験に使用したCRCオルガノイドは、上皮細胞のみを含む。CRCオルガノイドの培養および生成は、以前に記載されている25、35。要するに、正常な結腸上皮細胞を、陰窩単離緩衝液(氷冷PBS中の5mM EDTA(エチレンジアミンテトラアセテート))を用いてRosa26−Cas9マウスの結腸から単離し、次いで基底膜マトリックス培地に包埋し、そして参考文献35に記載されるようにオルガノイド増殖培地中で培養した。次いで、ApcおよびTrp53変異を、レンチウイルス発現プロトコルを用いてApcおよびTrp53を標的とするシングルガイドRNAを過剰発現させることによって結腸上皮細胞に導入した。単一のオルガノイドクローンを厳選した25個。pc Δ/ΔおよびTrp53 Δ/Δ結腸癌オルガノイド(AP腫瘍イド)を、10 μM Y-27632を含む100 μLのPBS中の5.0 x 105個の単一細胞としてマウス1匹当たり門脈に注射し、以下に示すオルガノイド培養および単一細胞調製物を用いた。

  1. 門脈注入の3〜5日前に基底膜マトリックス培地ドーム内のCRCオルガノイドを24ウェルプレートまたは10cmディッシュで培養し、直径50〜400μmのオルガノイドを得た。
  2. 注射のために培養されているオルガノイドの数を消化するのに十分な量のY-27632を10μM濃度に添加して、十分な量の細胞剥離溶液を調製する。37°Cの水浴中で予備加温する。
    注:このプロトコルで使用される細胞剥離溶液は、組換え細胞解離酵素ミックスであり、オルガノイド培養におけるトリプシンの代替物として使用される( 材料表を参照)。これは、トリプシン36と比較して細胞解離によって引き起こされる細胞損傷を減少させる。Y-27632はRhoキナーゼ阻害剤であり、解離誘導細胞死を阻害し、それによって単一細胞生存率を増加させる37。
    1. 最大5匹のマウスに注射するために、約300個のオルガノイド(直径50〜400μm)を含む各ドームを有する10〜24 x 50μLの基底膜マトリックスドームを消化するために、40mLの細胞剥離溶液を含む2本のチューブを調製する、すなわち、各マウスに2〜4.8個のオルガノイド(約600〜1440個のオルガノイドに相当)を注射する。十分な細胞数を得るために必要なオルガノイドの数は、オルガノイド株に依存するため、最適化されるべきである。
      注:2番目の40mLチューブは、解離した単一細胞を得るために、新鮮な細胞剥離溶液による反復消化を可能にする。
  3. 各ウェルからオルガノイド培地を慎重に吸引する。
  4. 24ウェルプレートの各ウェルに1mLの氷冷PBSを加える。10cmの皿を使用する場合は、10mLの氷冷PBSを皿に加える。
  5. P1000ピペットチップを用いて基底膜マトリックス培地を引っ掻き落とす。PBS/培地スラリーを15mL遠沈管に移す。
  6. 各ウェルを同量のPBSですすぎ、基底膜マトリックス断片を収集し、15mLチューブに加えます。
  7. 氷上で5分間インキュベートする。このインキュベーションは、基底膜マトリックス培地を溶解するのに役立つ。
  8. チューブを400 x g で4°Cで5分間遠心分離します。
  9. 上清を吸引し、ペレット状の培地や細胞を乱さないようにする。
  10. ステップ2.2で調製した5 mLの加温済み細胞剥離液をペレットに加え、ペレットを10回再懸濁し、新鮮な予め加温した細胞剥離溶液を含む50 mLチューブに戻した。
  11. チューブを37°Cの水槽に入れる。5分間インキュベートする。
  12. チューブを400 x g で4°Cで3分間遠心分離します。
  13. 手順 2.9 ~ 2.11 を繰り返します。
    注:酵素消化を繰り返すことで、単一細胞への効率的な細胞解離が可能になります。
  14. オルガノイドが単一細胞に解離しているかどうかを確認するには、96穴プレートに100μLをピペッティングし、顕微鏡で観察します。多くのオルガノイドが4つ以上の細胞からなる細胞凝集塊を示す場合、細胞剥離溶液とのより長いインキュベーションおよび10mLピペットによる摩砕による物理的解離が必要な場合がある。
  15. ほとんどの細胞が単一細胞になったら、40mL細胞懸濁液に4mLのウシ胎児血清(FBS)を加えて消化を停止します。40 μm のセルストレーナーを 5 mL PBS ですすいでください。
  16. 細胞懸濁液をセルストレーナーに通して50mLの収集チューブに通し、細胞凝集塊を除去します。
  17. チューブを400 x g で4°Cで5分間遠心分離します。
  18. 上清を吸引する。細胞ペレットに10 mLの冷たいPBSを加え、それを15 mL遠沈管に移す。
  19. チューブを400 x g で4°Cで5分間遠心分離します。
  20. 上清を吸引する。ペレットを10μM Y-27632を含む500μLの冷PBSに再懸濁する。セルを数えます。
  21. 10 μM Y-27632 の PBS を使用して、細胞濃度を5.0 x 105 個の単一細胞/100 μL に調整します。門脈注入が行われるまで、チューブを氷の上に置きます。
    注:解離から4時間以内に解離した細胞を注入することをお勧めします。

3. CRCオルガノイドの門脈注入

注:すべての手術器具および手術用ガーゼは、手術前にオートクレーブ処理または滅菌する必要があります。このプロトコルは、以前のプロトコル17から変更される。この実験25では、ステップ1においてAAV−mRuby2 またはAAV−Islr で処置したRosa26−Cas9マウスを用いて門脈注入を行った。

  1. 加熱パッド上の滅菌ドレープを使用して無菌手術領域を準備する。
  2. 手術器具(はさみと鉗子)、手術用および止血スポンジ、4-0ポリグラクチン縫合糸、綿芽、皮膚ステープラー、ステープラーアプリケーター、生理食塩水、ブプレノルフィン、およびハミルトンシリンジに取り付けられた33G針を準備します。止血スポンジを1.0 cm x 1.0 cmに切ります。
  3. 手術領域を照らすために光源の位置を調整します。
  4. 0.1mg/kg体重のブプレノルフィンをマウスの皮下に注射し、外科的疼痛管理を行う。
  5. 麻酔室でイソフルランでマウスを麻酔する。誘導および維持のためのイソフルラン濃度は、通常、それぞれ5%および2.5%である。次の手順を開始する前に、つま先のピンチに対する反応がないことを確認してください。
  6. マウスの中央から上腹部を電気シェーバーで剃ります。剃毛は、無菌手術領域から離れた領域で行い、毛が部位を汚染するのを避けるべきである。
  7. 切開部位をベタジンと80%エタノールで交互に清掃し、手術領域を滅菌します。これを3回繰り返します。
  8. 維持イソフルラン麻酔で仰臥位で加熱パッド上にマウスを置きます。マウスの腹部に穴の開いた外科用ドレープを置きます。
  9. 鉗子で腹部皮膚を持ち上げ、はさみで正中線に2〜3cmの皮膚切開を行い、皮膚のみを切断する(腹膜の下ではない)。切開部は、中腹部から胸骨の剣状突起までの範囲であるべきである。切開部は、剣状突起の下端より上であってはならない。
  10. 腹膜壁を鉗子で完全に持ち上げ、はさみで腹膜に同様の2〜3cmの切開を行います。腸や横隔膜を切らないでください。
  11. 手術用ガーゼを温かい生理食塩水で浸し、切開部の左側(マウスの体の左側、外科医の右側)に置きます。
  12. 生理食塩水で浸した綿棒を使って内臓(小腸と大腸)をやさしく引き抜きます。生理食塩水で浸したガーゼの上に腸を置きます。
    注:マウスの左側の腸(すなわち、外科医の右側の腸)を最初に引き抜く必要があり、次にマウスの右側の腸(すなわち、外科医の左側の腸)を引き出すことができる。
  13. 腸の位置を調整して門脈を視覚化します。腸を湿らせておくために、追加の湿ったガーゼで腸を覆います。
  14. 濡れたガーゼで腸を左側にそっと引っ張り、左にやさしい緊張を加えます。これにより、門脈の可視化が容易になる(図2A)。
    注:門脈の視覚化が困難な場合は、濡れた綿棒で胃の位置を優しく調整すると、視覚化に役立つ場合があります。
  15. 腫瘍様懸濁液を数回穏やかにピペットし、均質な細胞懸濁液を得た。33G針に取り付けられたハミルトンシリンジに100μLの細胞懸濁液をゆっくりと引き込む。気泡を避けてください。
  16. 針をゆっくりと挿入し、斜めにして門脈に挿入します。針に沿った挿入深さは3〜4mmで、針の角度は門脈とほぼ平行であるべきである。
    注:注射は、門脈のよく視覚化された部分(通常、肝ヒルムから最大2cm離れた部分)に行うべきである。針が門脈に完全に挿入された後は、針の動きを避けてください。
  17. 腫瘍細胞を30秒間注射する。注射は、門脈の閉塞を防ぐためにゆっくりと行うべきである。注射が成功すると、肝臓の色は一時的に赤から白に変わります。
  18. 針をゆっくりと外します。すぐに乾いた綿芽で注射部位に穏やかな圧力をかけ、5分間待ちます。
  19. 綿棒を取り除き、同時に止血スポンジを注射部位に塗布する。綿棒または鉗子で止血スポンジを保持し、さらに5分間穏やかな圧力をかけます。
  20. 止血スポンジへの圧力を取り外し、注射部位からの出血がないことを確認する。
    注:生体吸収性止血スポンジは取り外す必要はありません。ガーゼを取り除こうとすると、注射部位から再出血する可能性があります。
  21. 出血が発生した場合は、直ちに綿棒で約10分間加圧止血を行う。その後、追加の止血スポンジをさらに5分間塗布する。
    注:制御不能な失血が観察された場合、マウスは研究所の動物倫理委員会によって承認されたプロトコルに従って安楽死させるべきです。
  22. 腸の外科用ガーゼを取り除く。5mLの生理食塩水を充填した注射器を用いて、生理食塩水を腸に噴き出し、臓器の癒着を防止する。
    注:門脈注入部位に生理食塩水を塗布しないでください。これは、再出血を引き起こす可能性があります.
  23. 腸を腹腔内にそっと戻します。
  24. 4-0ポリグラクチン縫合糸を用いて腹膜を縫合する。
  25. 鉗子で皮膚の両側を持ち上げます。皮膚の切開部を閉じるために皮膚のステープラーを塗布する。腸をホチキス止めしないように注意してください。
  26. イソフルランをオフにしますが、酸素の流れは流れ続けます。マウスを注意深く監視します。マウスが目を覚ましたら、加熱パッドの空のケージにマウスを置きます。マウスは通常5分以内に目を覚ます。
  27. マウスが意識を持ち、正常に歩行できるようになるまで、マウスを注意深く監視します。
  28. 手術後4時間で0.1mg/kgのブプレノルフィンをマウスに皮下注射する。
  29. 0.1mg/kgのブプレノルフィンを24時間ごとにマウスに注射し、その後2日間投与する。
  30. 手術後1週間、マウスを毎日注意深く監視する。縫合糸と創傷治癒を確認してください。
  31. 手術の数日後、ステープラーリムーバーを使用して皮膚のホッチキスを取り除きます。

4. in vivo 生物発光イメージングによる腫瘍増殖動態の評価

注:ホタル発現ポノノイドを注射に使用する場合、転移性腫瘍の進行は、38、39に記載されているように、in vivoイメージングによって毎週モニターすることができる。癌細胞によって発現されるルシフェラーゼは、癌細胞に対する免疫応答を惹起し、腫瘍増殖を制限する可能性がある40。したがって、ルシフェラーゼ発現腫瘍細胞を用いたマウスモデルにおける免疫表現型および癌進行の解析には注意が必要である。

  1. 滅菌PBSを用いてD-ルシフェリンの30mg/mL溶液を調製する。光から守ってください。D-ルシフェリンは、使用時まで-20°Cのアリコートで保存する必要があります。
  2. 電子シェーバーで腹部と胸部を剃ります。これは、 インビボ イメージングの1日前まで行うことができる。
  3. 150mg/kg体重のD-ルシフェリンをマウス腹腔内に注射する(すなわち、マウスの体重が30gの場合、150μLのD-ルシフェリン溶液を注入する)。
  4. マウスを麻酔室に入れ、麻酔をかける。誘導には5%のイソフルランを使用し、メンテナンスには2%〜3%を使用してください。
  5. 数分後、マウスを横方向の位置(右側を上に)に置きます。先に記載したように インビボ イメージングシステム(IVIS)を用いて生物発光画像を取得する38、39。
    注:マウスは、仰臥位と比較して横方向の位置でより安定している。したがって、横方向の位置は、一貫した焦点面から発光画像を得るのに好ましい。
  6. マウスを空のケージに入れ、回復を監視します。
  7. 38で説明したように、リビングイメージソフトウェアを使用して上腹部の関心領域を定義する。腫瘍細胞数の代理として全フラックスを定量化する。

5. 生存期間解析と組織採取

  1. マウスを注意深く監視して、腹部の露出がずれているような転移の臨床症状を注意深く観察する。
  2. マウスが人道的なエンドポイントに到達したら、CO2 吸入によってマウスを安楽死させる。
    注:研究所の動物倫理委員会によって承認された研究エンドポイントを使用してください。人道的なエンドポイントを決定するために、臨床記録シートが使用された。スコアは、以下の観察のそれぞれの存在について与えられた1点によって計算された:体重減少>15%、直感した姿勢、フリルのあるコート、脱水、運動の減少、腹部の露出、または顔の恨み。スコア3に達したら、マウスを人道的に安楽死させた。
  3. 安楽死の直後に、41に記載されているように、ヒュームフード内の10%ホルマリン30〜50mLで経心経灌流固定を行う。灌流する前に肝臓の正常な部分にハサミでいくつかの小さな切開(それぞれ最大1cm)を行い、血液とホルマリンの出口を生成します。灌流すると、肝臓の色は赤から茶色に変わります。
    注:巨視的に正常な肝臓領域における微小転移が研究対象である場合、研究者は肝臓を切断するのではなく、代わりに上大静脈を刈り取ることをお勧めします。しかし、この方法を使用した場合、肝臓を切断することと比較すると、肝臓の固定が悪いようです。特にRNA in situ ハイブリダイゼーション(ISH)を肝臓切片で行う予定の場合は、前述のようにホルマリンの心臓内注射前に肝臓に切開することをお勧めします。これにより、肝臓組織の十分な固定が可能になり、ISHに対するRNA完全性の保存をもたらす。
  4. 肝臓および肺組織を10%ホルマリンに入れ、一晩固定する。ホルマリンを70%エタノールで置換し、続いてパラフィン包埋を行った。
  5. ヘマトキシリンおよびエオジン染色を行い、腫瘍領域を組織学的に評価する。目的の間質マーカーについて免疫組織化学を行う。ピクロ・サイラス・レッド染色を行い、コラーゲン陽性領域を評価します。
    注:ImageJソフトウェア42 は、免疫組織化学およびピクロシリウスレス染色データを定量するために使用することができる。カラーデコンボリューション機能とMRI線維症ツールを使用して、それぞれ3,3'-ジアミノベンジジン(DAB)陽性領域とピクロシリウス赤陽性領域を評価することができます。

結果

腫瘍抑制間質遺伝子Islr 4,25,43,44のAAV媒介性過剰発現を肝細胞において誘導するために、我々は、IslrコードAAV8を静脈内注射した。0 x1011のAAV8-Islrのウイルスゲノム(vg)、または対照として、AAV8-mRuby2を、成体マウス尾静脈に注射した(図1A)。尾?...

ディスカッション

本研究では、マウスCRCオルガノイドの門脈注射が、ヒトCRC肝転移の組織学的特徴を模倣した線維芽細胞に富む肝転移を再現性よく生成することを示した。さらに、AAV8媒介性遺伝子治療などの間質指向性治療薬と組み合わせると、この前臨床モデルは、マウスの生存および腫瘍増殖に対する治療効果を評価するための有用なツールとして役立つ。

プロトコルには、少なく?...

開示事項

著者らは利益相反がないと宣言しています。

謝辞

この研究は、National Health and Medical Research Council(APP1156391からD.L.W.、S.L.W.)からの助成金によって支援された。(APP1081852からD.L.W.、APP1140236からS.L.W.、APP1099283からD.L.W.、);Cancer Council SA Beat Cancer Projectは、保健省を通じてドナーと南オーストラリア州政府を代表して(MCF0418からS.L.W.、D.L.W.へ)。文部科学省委託科学研究費補助金(基盤研究(B)(20H03467~M.T.)AMED-CREST(独立行政法人日本医療研究開発機構 進化科学技術基盤研究(19gm0810007h0104、19gm1210008s0101~A.E.)、AMEDからがん研究・治療進化プロジェクト(P-CREATE)(19cm0106332h0002~A.E.);日本学術振興会若手研究者海外チャレンジプログラム(所在日)、武田科学財団フェローシップ(所英)、グリートン国際博士課程奨学金(所在日)、ライオンズ医学研究財団奨学金(弊社)

我々は、組換えAAVベクターを作製したChildren's Medical Research Institute (CMRI) (NSW, AUSTRALIA) のVector and Genome Engineering Facility(VGEF)のLeszek Lisowski博士に感謝する。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
10% FormalinSigmaHT501128
15 mL centrifuge tubeCorning430791
33-gauge needleTSKLDS-33013For portal vein injection
4-0 vicryl sutureETHICONJ494G
40-µm cell strainerCorning431750
5 mL SyringeBD302130Used to apply saline to the intestine after portal vein injection
50 mL centrifuge tubeCorning430829
50 mL syringeTERUMOSS*50LELuer lock syringe for perfusion fixation
70% Isopropyl alcohol wipeBriemar5730
Anaesthesia machineDarvall9356
αSMA antibodyDAKOM0851Clone 1A4. 1/500 dilution for immunohistochemistry
BuprenorphineTROYN/Ailium Temvet Injection, 300 µg/ml Buprenorphine
Cotton budsJohnson & JohnsonN/AJohnson's pure cotton bud applicators. Need to be autoclaved before use.
D-luciferinBiosynthL-8220
Electric shaverSold by multiple suppliers
ForcepsSold by multiple suppliers
Hamilton syringeHAMILTON81020For portal vein injection
Heat box (animal warming chamber)DatesandMK3
Heat lampSold by multiple suppliers
Hemostatic spongePfizer09-0891-04-015Gelfoam absorbable gelatin sponge, USP, 12-7 mm
India inkTalens44727000
Injection syringe and needleBD326769For tail vein injection
Islr probe (RNAscope)ACD450041
IsofluraneHenry Schein988-3244
IVIS Spectrum In Vivo Imaging SystemPerkin Elmer124262
Living Image SoftwarePerkin Elmer128113
MatrigelCorning356231
MRI fibrosis toolN/AN/Ahttps://github.com/MontpellierRessourcesImagerie/imagej_macros_and_scripts/wiki/MRI_Fibrosis_Tool
Phosphate-buffered saline (PBS)SigmaD8537
RNAscope kitACD322300
Rodent restrainerSold by multiple suppliers
Rosa26-Cas9 mouseThe Jackson Laboratory024858
SalinePfizerPHA19042010
ScissorsSold by multiple suppliers
Skin staplersAble ScientificAS590289 mm wound clips
Stapler applicatorAble ScientificAS590269 mm wound clip applicator
Stapler removerAble ScientificAS59037Wound clip remover
Surgical drapeMultigate29-220
Surgical gauzeSentry MedicalGS001
Topical anesthesia creamEMLAN/AEMLA 5% cream, 25 mg/g lignocaine and 25 mg/g prilocaine
TrypLE ExpressGibco12605028Recombinant cell-dissociation enzyme mix
Y-27632Tocris1254

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