간 전이 스트로마를 연구하기 위해 대장암 오가노이드의 포털 정맥 주사

요약

결장직장암(CRC) 오가노이드의 포털 정맥 주사는 스트로마가 풍부한 간 전이를 일으킨다. CRC 간 전이의 이러한 마우스 모델은 종양-스트로마 상호작용을 연구하고 아데노-관련 바이러스-매개 유전자 요법과 같은 신규한 스트로마-지시 치료제를 개발하는데 유용한 도구를 나타낸다.

초록

대장암(CRC)의 간 전이는 암 관련 사망의 주요 원인이다. 종양 미세환경의 주요 구성 요소인 암 관련 섬유아세포(CAFs)는 전이성 CRC 진행에 중요한 역할을 하며 불량한 환자 예후를 예측합니다. 그러나, 전이성 암세포와 CAF 사이의 누화를 연구하기에 만족스러운 마우스 모델이 부족하다. 여기에서, 우리는 간 전이 진행이 전이성 틈새 시장에 의해 어떻게 조절되고 아마도 스트로마 지향 요법에 의해 억제 될 수 있는지를 조사하는 방법을 제시합니다. CRC 오가노이드의 포털 정맥 주사는 desmoplastic 반응을 일으켰고, 이는 인간 CRC 간 전이의 섬유아세포가 풍부한 조직학을 충실하게 되풀이했다. 이 모델은 비장내 주사 모델과 비교했을 때 간에서 더 높은 종양 부담을 갖는 조직 특이적이었으며, 마우스 생존 분석을 단순화하였다. 루시페라아제-발현 종양 오가노이드를 주입함으로써, 종양 성장 동역학은 생체내 영상화에 의해 모니터링될 수 있었다. 더욱이, 이러한 전임상 모델은 종양 중간엽을 표적화하는 치료제의 효능을 평가하는데 유용한 플랫폼을 제공한다. 우리는 간세포에 종양을 억제하는 기질 유전자의 아데노-관련 바이러스 매개 전달이 종양 미세환경을 리모델링하고 마우스 생존을 향상시킬 수 있는지 여부를 조사하는 방법을 기술한다. 이 접근법은 CRC의 간 전이를 억제하기위한 새로운 치료 전략의 개발 및 평가를 가능하게합니다.

서문

대장암(CRC)은 전 세계적으로 암 사망률의 주요 원인이다¹. CRC 환자의 절반 이상이 문맥 정맥 보급을 통해 발생하는 간 전이를 일으킨다¹. 현재, 진행된 간 전이를 치료할 수 있는 효과적인 치료제는 없으며, 대부분의 환자들은 전이성 질환에 굴복한다.

전이성 틈새 또는 종양 미세환경은 보급된 CRC 세포²의 생착 및 성장에 중요한 역할을 한다. 암 관련 섬유아세포(CAFs)는 종양 미세환경의 두드러진 성분으로, 성장 인자 분비, 세포외 기질(ECM) 리모델링, 면역 환경 및 혈관 신생^{조절 3,4,5}를 통해 암 진행을 촉진 또는 억제한다. CAF는 또한 화학 요법 및 면역 요법에 대한 내성을 부여합니다³. 또한, CAF는 CRC 간 전이의 개시 및 진행을 조절하고 CRC 3,6,7,8 환자의 예후를 예측합니다. 따라서, CAF 관련 인자는 CRC 간 전이를 억제하기 위한 치료 전략의 개발을 위해 이용될 수 있었다. 그러나, 전이성 종양 스트로마를 연구하기에 만족스러운 마우스 모델의 부족은 스트로마 표적 치료법 개발에 주요한 장애물이 되어 왔다.

현재, CRC 간 전이를 연구하는 동물 모델에는 간으로의 간 전이 및 암 세포 이식 모델을 자발적으로 개발하는 일차 CRC 모델이 포함됩니다. 유전자 조작 마우스 모델 및 암세포의 결장 주입과 같은 일차 CRC 마우스 모델은 간으로의 전이를 거의 나타내지 않습니다 9,10,11,12. 더욱이, 간 전이가 관찰되더라도, 이들 모델은 원발성 종양 유도로부터 전이까지의 긴 잠복기를 보여주고, 잠재적으로 원발성 종양 부담으로 사망한다⁽¹²). CRC 간 전이를 효율적으로 생성하기 위해 배양 된 CRC 세포는 비장 내 주사, 간으로의 직접 실질 내 주사 및 문맥 정맥 주사의 세 가지 주사 방법을 사용하여 간으로 이식됩니다. 비장 주사된 암세포는 비장 정맥, 문맥 정맥으로 확산되고, 궁극적으로는 간(^13,14)으로 퍼진다. 그러나, 비장내 주사는 다른 이식 모델^15,16에 비해 더 낮은 종양 취수율을 산출한다. 비장 내 주사를 사용하면 비장의 암 성장을 피하기 위해 비장의 외과 적 제거가 수행되며, 이는 잠재적으로 면역 세포 성숙을 손상시킬 수 있습니다¹⁷. 또한, 비장 내 주사는 또한 비장 및 복강⁽¹⁸)에서 의도하지 않은 종양 성장을 초래할 수 있으며, 이는 간 전이 분석을 복잡하게 만든다. 간으로의 직접 실질 내 주사는 간전이를 효율적으로 유도한다^16,19,20. 그럼에도 불구하고,이 접근법은 문맥 정맥 보급을 통해 자연적으로 발생하는 간 전이의 생물학적 단계를 완전히 회복시키지 못합니다. 간으로의 직접 주사를 사용하여, 암세포를 비포털로 진입시키지만, 전신 순환은 또한 다수의 큰 폐 전이를 초래할 수 있다⁽¹⁶). CRC 간 전이를 가진 대다수의 환자가 간(²¹)에서 다수의 종양 결절을 보이지만, 특정 간엽으로의 직접 주사는 단일 종양 질량^(19,20)을 생성한다. 포털 정맥 주사 또는 장간막 정맥 주사는 기술적으로 도전적이지만, 환자¹⁷에서 보이는 성장 패턴을 되살리는 방식으로 종양 세포를 간으로 효율적으로 전달할 수 있습니다. 이 전략은 이차 부위 전이의 가능성을 최소화하고 간에서 암세포의 급속한 성장을 가능하게하여 마우스 생존 분석을 단순화 할 수 있습니다.

역사적으로, 마우스 MC-38, 인간 HT-29, 및 SW-620과 같은 결장직장암 세포주는 간 전이^22,23의 마우스 모델을 생성하는데 사용되었다. 그러나, 이들 결장직장암 세포주는 탈생물성 기질 반응을 유도하지 않는다. 종양에서 기질 함량이 낮으면 암 관련 섬유아세포의 생물학적 역할을 조사하기가 어렵습니다. CRC 오가노이드 및 이들의 이식에서의 최근의 발전은 암 진행(²⁴)에서 스트로마의 중요한 역할을 평가하는 유용한 플랫폼을 제공하였다. CRC 오가노이드의 간 이식은 섬유아세포가 풍부한 종양 미세환경을 생성하며 기질 연구 ^6,25에 대한 새로운 통찰력을 제공하였다. 현재, 오가노이드의 문맥 또는 장간막 정맥 주사는 CRC 간 전이 6,25,26,27,28을 생성하는 황금 표준 접근법이되었습니다. 그럼에도 불구하고, 우리의 지식에 따르면, 이전의 논문은 대장 종양의 포털 정맥 주사에 대한 자세한 방법을 설명하지 않았습니다. 여기에서, 우리는 CRC 오가노이드의 문맥 정맥 주사를 사용하여 새로운 아데노 관련 바이러스 (AAV) 매개 스트로마 지시 요법을 개발하기위한 방법론을 제시합니다.

간세포는 간에서 전이성 종양 미세환경의 중요한 구성성분이며 전이성 암 진행에 중요한 역할을 한다⁽²⁹). 비신생물성 환자^30,31명에서 간세포에서 단백질 발현을 유도하기 위한 AAV 유전자 치료 접근법의 성공에 영감을 얻어^, CRC²⁵에서 간 종양 미세환경을 변형시키는 것을 목표로 유사한 접근법을 조사하였다. 이와 같이, 우리는 또한 간 종양 미세환경을 변형시키기 위해 항종양원성 단백질의 발현을 유도하기 위한 AAV8의 꼬리 정맥 주사를 본원에 기술한다. 바이러스 생산 동안 바이러스 캡시드 단백질의 선택에 의해 지정된 AAV8 혈청형은 간세포 특이적으로 높은 형질도입 효율(즉, 간 종양 미세환경에서의 표적화된 유전자 발현)³²을 유도한다. 우리는 이전에 Islr (류신이 풍부한 반복을 포함하는 면역 글로불린 수퍼 패밀리)이 골형성 단백질 (BMP) 신호 전달을 유도하고, CRC 종양 성장을 감소시키고, Lgr5⁺ 장 줄기 세포 분화를 촉진하는 CAF 특이적 유전자임을 보여주었습니다²⁵. 간세포에서 암-억제 기질 유전자인 Islr의 AAV8 매개된 과발현이 AAV8-Islr 처리된 마우스에서 CRC 종양형의 문맥 정맥 주사를 수행함으로써 간 전이 진행을 약화시킬 수 있는지 여부를 시험하였다.

이 논문에서는 먼저 간 열대 AAV의 꼬리 정맥 주입 절차를 설명합니다. 이어서, AAV 처리된 마우스로의 종양성 세포 제제 및 문맥 정맥 주사를 위한 방법을 설명한다. 마지막으로, 우리는 스트로마 지향 치료제의 효능을 평가하기 위해 전이성 종양 진행을 모니터링하는 접근법을 제시한다.

프로토콜

이 기사의 모든 동물 절차는 사우스 오스트레일리아 보건 의학 연구소 동물 윤리위원회 (승인 번호, SAM322)에 의해 검토되고 승인되었습니다.

1. 아데노 관련 바이러스의 꼬리 정맥 주사

참고: 아데노 관련 바이러스(AAV)는 생물안전 레벨 1 지침에 따라 생물학적 위험으로 취급해야 합니다. AAV 제조, 정제 및 적정을 위해 공개된 프로토콜(³³)을 참조한다. 간세포-트로픽 AAV, AAV8³⁴, 사이토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터-Islr 유전자를 코딩하고, 본 연구²⁵에 사용하였다. AAV 매개 과발현을 유도하기 위해, AAV 투약은 프로모터 활성, 유전자 및 마우스 중량에 따라 최적화를 필요로 할 수 있다.

1. AAV 벡터를 멸균 포스페이트 완충 식염수 (PBS)를 사용하여 1.0 x 10¹¹ 바이러스 게놈을 함유하는 150 μL 분취량으로 희석하고 얼음 위에 보관하십시오. AAV를 처리하기 위해 개인 보호 장비를 착용해야합니다.
   참고: 동결 및 해동 주기를 반복하면 바이러스 역가가 감소하므로 피해야 합니다. 상기 원바이러스 용액은 -80°C 냉동고에 보관해야 한다.
2. 히트 박스(동물 온난화 챔버)를 켜서 35°C로 예열한다.
3. 마우스를 잡고 꼬리 정맥 주사 최소 15 분 전에 꼬리의 전체 길이에 국소 마취 크림을 바르십시오.
   참고 : 이것은 선택적 단계이며 연구소의 동물 윤리위원회에서 요구하지 않는 경우 필요하지 않을 수 있습니다. 지역 동물 윤리위원회가 승인 한 프로토콜을 따르십시오. 본 실험²⁵에서, Rosa26-Cas9 마우스를 CRC 오가노이드의 AAV 주사 및 후속 문맥 정맥 주사에 사용하였다. 본 연구에 사용된 종양형이 Rosa26-Cas9 마우스(C57BL/6 x 129 유전적 배경)로부터 유래되었다는 것을 감안할 때, 이 마우스 균주는 또한 종양 이식의 면역적격, syngeneic 수용자로서 사용되었다. 수컷 및 암컷 Rosa26-Cas9 마우스(6- 내지 24주령)를 사용하였다.
4. 마우스를 히트 박스에 넣습니다. 꼬리 정맥을 따뜻하게하고 팽창시키기 위해 마우스를 최대 15 분 동안 그대로 두십시오.
5. 설치류 제대에 마우스를 부드럽게 고정하십시오. 꼬리 정맥이 완전히 팽창하도록 열 램프 아래에 꼬리를 놓습니다.
6. 150 μL의 희석된 AAV (단계 1.1에서 제조됨)를 27-30 G 바늘이 있는 낮은 죽은 공간 멸균 주사기 내로 끌어올린다.
7. 열 램프를 움직이고 꼬리의 측면에있는 측면 꼬리 정맥을 확인하십시오. 꼬리가 곧게 펴지도록 손가락으로 꼬리에 약간의 긴장을 가하십시오.
8. 천천히 2-3mm의 바늘을 삽입하고 위로 비스듬히 정맥에 넣으십시오. 바늘은 꼬리와 거의 평행해야합니다 (꼬리에서 최대 15 °).
   참고 : 바늘이 정맥에 성공적으로 위치하면 주사기로 혈액 유입이 관찰 될 수 있습니다.
9. 천천히 주입하십시오. 저항력이 느껴지거나 피부 붓기가 관찰되면 바늘을 제거하고 첫 번째 부위 위 또는 다른 측 정맥에 다시 삽입하십시오.
10. 주사가 완료된 후 약 5 초 동안 기다린 다음 바늘을 천천히 제거하십시오. 출혈이 멈출 때까지 깨끗한 거즈 또는 종이 타월로 주사 부위에 즉시 부드러운 압력을 가하십시오.
11. 마우스를 케이지에 부드럽게 놓습니다. 출혈이 멈췄는지 확인하기 위해 동물을 모니터링하십시오.
    참고 : 간에서의 유전자 과발현은 AAV 꼬리 정맥 주사 후 1 ~ 2 주 후에 평가할 수 있습니다. 이는 예를 들어, RNA 계내 혼성화 (ISH), 면역조직화학 (IHC), 웨스턴 블롯팅, 또는 정량적 실시간 중합효소 연쇄 반응 (qRT-PCR; 그림 1A, B). 이전에 발표된 연구²⁵에서, AAV8-Islr은 간세포에서 마우스 Islr 유전자를 과발현하는데 사용되었고, 과발현은 RNA ISH에 의해 검출되었다(도 1A, B).

2. 대장암 오가노이드에 대한 세포 준비

참고: 이 실험에 사용된 CRC 오가노이드는 상피 세포만을 함유한다. CRC 오가노이드의 배양 및 생성은 이전에 기술되었다^25,35. 요컨대, 정상 결장 상피 세포를 크립트 분리 완충액 (빙냉 PBS 중의 5 mM EDTA(에틸렌디아민테트라아세테이트))을 사용하여 Rosa26-Cas9 마우스의 결장으로부터 단리하고, 기저막 매트릭스 배지에 포매한 다음, 참고문헌³⁵에 기재된 바와 같이 오가노이드 성장 배지에서 배양하였다. 이어서, Apc 및 Trp53 돌연변이를 렌티바이러스 발현 프로토콜을 사용하여 Apc 및 Trp53을 표적으로 하는 단일 가이드 RNA를 과발현시킴으로써 결 장 상피 세포에 도입하였다. 단일 오가노이드 클론을²⁵개 엄선하였다. pc Δ/Δ 및 Trp53 Δ^/Δ 결장암 오가노이드 (AP tumoroids)를 마우스 당 포탈 정맥 내로 10 μM Y-27632와 함께 PBS 100 μL에 5.0 x 10⁵ 단일 세포로 주사하였고, 아래에 설명된 오가노이드 배양 및 단일 세포 제제를 사용하였다.

1. CRC 오가노이드를 24-웰 플레이트 또는 10 cm 디쉬에서 기저막 매트릭스 배지 돔에서 배양하여 문맥 정맥 주입 3-5일 전에 50-400 μm 직경의 오가노이드를 얻었다.
2. 주사를 위해 배양되는 오가노이드의 수를 소화하기에 충분한 양의 Y-27632를 10 μM 농도로 첨가하여 충분한 양의 세포 분리 용액을 준비하십시오. 37°C 수조에서 예열한다.
   참고: 이 프로토콜에 사용된 세포 분리 용액은 재조합 세포-해리 효소 혼합물이며 오가노이드 배양에서 트립신의 대체물로 사용됩니다( 표 참조). 트립신³⁶에 비해 세포 해리로 인한 세포 손상을 감소시킵니다. Y-27632는 Rho 키나제 억제제이며 해리 유발 세포 사멸을 억제하여 단일 세포 생존³⁷을 증가시킵니다.
   1. 최대 5마리의 마우스에 주입하기 위해, 약 300개의 오가노이드(직경 50-400 μm)를 함유하는 각 돔과 함께 10-24 x 50 μL의 기저막 매트릭스 돔을 소화하기 위해 40 mL의 세포 분리 용액을 함유하는 2개의 튜브를 준비하고, 즉, 각 마우스에 2-4.8개의 오가노이드(약 600-1440개의 오가노이드에 해당)를 주입한다. 충분한 세포 수를 얻기 위해 필요한 오가노이드의 수는 오가노이드 라인에 의존하며, 따라서 최적화되어야 한다.
      참고: 두 번째 40 mL 튜브는 해리된 단일 세포를 얻기 위해 신선한 세포 분리 용액으로 반복 소화를 가능하게 합니다.
3. 각 웰에서 오가노이드 배지를 조심스럽게 흡인하십시오.
4. 얼음처럼 차가운 PBS 1 mL를 24-웰 플레이트의 각 웰에 첨가한다. 10cm 접시를 사용하는 경우 얼음처럼 차가운 PBS 10mL를 접시에 넣으십시오.
5. P1000 피펫 팁을 사용하여 기저막 매트릭스 배지를 긁어낸다. PBS/배지 슬러리를 15 mL 원심분리 튜브로 옮긴다.
6. 동일한 양의 PBS로 각 웰을 헹구어 기저막 매트릭스 단편을 수집하고 15 mL 튜브(들)에 첨가한다.
7. 얼음 위에서 5 분 동안 배양하십시오. 이러한 인큐베이션은 기저막 매트릭스 배지를 용해시키는 것을 돕는다.
8. 튜브를 4°C에서 5분 동안 400 x g 에서 원심분리한다.
9. 펠릿화된 배지 및 세포를 교란하지 않도록 상청액을 흡인한다.
10. 단계 2.2에서 제조된 미리 가온된 세포 분리 용액 5 mL를 펠렛에 첨가하고, 펠렛을 10회 재현탁한 다음, 이를 다시 신선하고 미리 가온된 세포 분리 용액이 들어있는 50 mL 튜브로 옮긴다.
11. 튜브를 37°C 수조에 놓는다. 5 분 동안 배양하십시오.
12. 튜브를 4°C에서 3분 동안 400 x g 에서 원심분리한다.
13. 2.9-2.11단계를 반복합니다.
    참고 : 반복적 인 효소 소화는 단일 세포로의 효율적인 세포 해리를 허용합니다.
14. 100 μL를 96-웰 플레이트에 피펫팅하고 현미경으로 관찰하여 오가노이드가 단일 세포로 해리되는지 여부를 확인하십시오. 많은 오가노이드가 네 개 이상의 세포로 구성된 세포 덩어리를 나타내는 경우, 세포 분리 용액으로 더 긴 배양과 10 mL 피펫으로 분쇄에 의한 물리적 해리가 필요할 수 있다.
15. 대부분의 세포가 단일 세포가 되면, 40 mL의 세포 현탁액에 소 태아 혈청(FBS) 4 mL를 첨가하여 소화를 중지시킨다. 40 μm 세포 스트레이너를 5 mL PBS로 헹구십시오.
16. 세포 현탁액을 세포 스트레이너를 통해 50 mL 수집 튜브에 통과시켜 임의의 세포 덩어리를 제거한다.
17. 튜브를 4°C에서 5분 동안 400 x g 에서 원심분리한다.
18. 상층액을 흡인하십시오. 차가운 PBS 10 mL를 세포 펠릿에 첨가하고 이를 15 mL 원심분리 튜브로 옮긴다.
19. 튜브를 4°C에서 5분 동안 400 x g 에서 원심분리한다.
20. 상층액을 흡인하십시오. 펠렛을 10 μM Y-27632로 500 μL 차가운 PBS에 재현탁시켰다. 셀 수를 계산합니다.
21. 10 μM Y-27632가 있는 PBS를 사용하여 세포 농도를 5.0 x 10⁵ 단일 세포/100 μL로 조정한다. 포털 정맥 주입이 수행 될 때까지 튜브를 얼음 위에 놓습니다.
    참고 : 해리 후 4 시간 이내에 해리 된 세포를 주입하는 것이 좋습니다.

3. CRC 오가노이드의 포털 정맥 주사

참고: 모든 수술기구와 수술용 거즈는 수술 전에 오토클레이브 또는 멸균해야 합니다. 이 프로토콜은 이전 프로토콜¹⁷에서 수정되었습니다. 본 실험²⁵에서, 문맥 정맥 주사는 단계 1에서 AAV-mRuby2 또는 AAV-Islr로 처리된 Rosa26-Cas9 마우스를 사용하여 수행되었다.

1. 가열 패드에 멸균 커튼을 사용하여 무균 수술 영역을 준비하십시오.
2. 해밀턴 주사기에 부착된 수술기구(가위 및 포셉), 수술 및 지혈 스폰지, 4-0 폴리글락틴 봉합사, 면봉, 피부 스테이플러, 스테이플러 어플리케이터, 식염수, 부프레노르핀 및 33G 바늘을 준비합니다. 지혈 스폰지를 1.0cm x 1.0cm 조각으로 자릅니다.
3. 광원의 위치를 조정하여 수술 영역을 비춥니다.
4. 0.1 mg/kg 체중의 부프레노르핀을 수술적 통증 관리를 위해 마우스에 피하 주사하십시오.
5. 마취실에서 이소플루란으로 마우스를 마취하십시오. 유도 및 유지를 위한 이소플루란 농도는 일반적으로 각각 5% 및 2.5%이다. 다음 절차를 시작하기 전에 발가락 꼬집음에 대한 반응이 없는지 확인하십시오.
6. 전기 면도기로 마우스의 중복부를 면도하십시오. 면도는 모발이 부위를 오염시키지 않도록 무균 수술 영역에서 멀리 떨어진 영역에서 수행해야합니다.
7. Betadine과 80 % 에탄올로 번갈아 절개 부위를 청소하여 수술 부위를 살균하십시오. 세 번 반복하십시오.
8. 마우스를 유지 이소플루란 마취와 함께 수핀 위치의 가열 패드 위에 놓습니다. 마우스의 복부 위에 구멍이있는 외과 용 커튼을 놓습니다.
9. 포셉으로 복부 피부를 들어 올리고 가위로 중간 선에서 2-3cm 피부를 절개하여 피부 만 자릅니다 (복막의 밑이 아님). 절개는 복부 중간에서 흉골의 xiphoid 과정에 이르기까지 다양해야합니다. 절개는 xiphoid 과정의 하단을 넘어서서는 안됩니다.
10. 포셉으로 복막 벽을 완전히 들어 올리고 가위로 복막과 비슷한 2-3cm 절개를하십시오. 창자와 횡격막을 자르지 마십시오.
11. 따뜻한 식염수로 수술 거즈를 담그고 절개 왼쪽(마우스 몸의 왼쪽, 외과 의사의 오른쪽)에 놓습니다.
12. 식염수에 적신 면봉을 사용하여 내부 장기 (소장 및 대장)를 부드럽게 당겨냅니다. 식염수에 담근 거즈에 창자를 놓습니다.
    참고 : 마우스의 왼쪽 창자 (즉, 외과 의사의 오른쪽 창자)를 먼저 뽑아 낸 다음 마우스의 오른쪽 창자 (즉, 외과 의사의 왼쪽에있는 창자)를 뽑아 낼 수 있습니다.
13. 창자의 위치를 조정하여 포털 정맥을 시각화하십시오. 내장을 촉촉하게 유지하기 위해 젖은 거즈로 장을 덮으십시오.
14. 젖은 거즈로 장을 왼쪽으로 부드럽게 당기고 왼쪽에 부드러운 장력을 가하십시오. 이렇게 하면 포털 정맥의 시각화가 용이해집니다(그림 2A).
    참고: 포털 정맥의 시각화가 어려운 경우, 젖은 면봉으로 위장의 위치를 부드럽게 조정하면 시각화에 도움이 될 수 있습니다.
15. 종양성 현탁액을 여러 번 부드럽게 피펫하여 균질한 세포 현탁액을 얻었다. 100 μL의 세포 현탁액을 33 G 바늘에 부착된 해밀턴 주사기 내로 천천히 끌어올린다. 기포를 피하십시오.
16. 천천히 바늘을 삽입하고 위로 비스듬히 포털 정맥에 넣으십시오. 바늘을 따라 삽입 깊이는 3-4mm이어야하며 바늘 각도는 포털 정맥과 거의 평행해야합니다.
    참고 : 주사는 포털 정맥의 잘 시각화 된 부분 (일반적으로 간 틈새에서 최대 2cm 떨어져 있음)에 수행되어야합니다. 바늘이 포털 정맥에 완전히 삽입 된 후 바늘의 움직임을 피하십시오.
17. 종양 세포를 30 초 동안 주입하십시오. 포털 정맥의 폐색을 방지하기 위해 주사를 천천히 수행해야합니다. 주사가 성공하면 간장의 색이 일시적으로 빨간색에서 흰색으로 바뀝니다.
18. 바늘을 천천히 제거하십시오. 즉시 마른 면봉으로 주사 부위에 부드러운 압력을 가하고 5 분 동안 기다리십시오.
19. 면봉을 제거하고 동시에 지혈 스폰지를 주사 부위에 바르십시오. 지혈 스폰지를 면봉이나 포셉으로 잡고 5 분 동안 부드러운 압력을 가하십시오.
20. 지혈 스폰지에 압력을 제거하고 주사 부위에서 출혈이 없는지 확인하십시오.
    참고 : 생체 흡수성 지혈 스폰지는 제거 할 필요가 없습니다. 거즈를 제거하려고하면 주사 부위에서 다시 출혈이 발생할 수 있습니다.
21. 출혈이 발생하면 즉시 약 10 분 동안면봉으로 압력 지혈을 수행하십시오. 그런 다음 추가 지혈 스폰지를 5 분 동안 적용하십시오.
    참고 : 통제 할 수없는 혈액 손실이 관찰되면 연구소의 동물 윤리위원회가 승인 한 프로토콜에 따라 마우스를 안락사시켜야합니다.
22. 장의 외과 거즈를 제거하십시오. 5 mL 식염수로 채워진 주사기를 사용하여, 장내 식염수를 장으로 분출하여 장기 부착을 방지한다.
    참고: 포털 정맥 주사 부위에 식염수를 바르지 마십시오. 이로 인해 다시 출혈이 발생할 수 있습니다.
23. 부드럽게 내장을 복강 안쪽으로 다시 놓습니다.
24. 4-0 폴리글락틴 봉합사를 사용하여 복막을 봉합한다.
25. 포셉으로 피부의 양쪽을 들어 올립니다. 피부 절개를 닫기 위해 피부 스테이플러를 바르십시오. 장을 스테이플하지 않도록주의하십시오.
26. 이소플루란을 끄고 산소 흐름을 계속 유지하십시오. 마우스를 주의 깊게 모니터링합니다. 마우스가 깨어나면 마우스를 가열 패드의 빈 케이지에 놓습니다. 마우스는 일반적으로 5 분 이내에 깨어납니다.
27. 마우스가 의식이 있고 정상적으로 외출 할 때까지 마우스를주의 깊게 모니터링하십시오.
28. 수술 후 4 시간 후에 마우스에 0.1 mg / kg buprenorphine을 피하 주사하십시오.
29. 이후 2 일 동안 24 시간마다 0.1 mg / kg buprenorphine을 마우스에 주사하십시오.
30. 수술 후 일주일 동안 매일 마우스를주의 깊게 모니터링하십시오. 봉합사와 상처 치유를 확인하십시오.
31. 수술 후 며칠 후, 스테이플러 리무버를 사용하여 피부 스테이플러를 제거하십시오.

4. 생체 내 생체 발광 영상에 의한 종양 성장 동역학 평가

참고: Firefly-expressing tumoroids가 주사에 사용되는 경우, 전이성 종양 진행은^38,39에 기술된 바와 같이 생체내 영상화에 의해 매주 모니터링될 수 있다. 암세포에 의해 발현된 루시퍼라아제는 암세포에 대한 면역 반응을 유도하고 종양 성장을 제한할 수 있다⁽⁴⁰). 따라서, 루시페라아제-발현 종양 세포를 사용하는 마우스 모델에서 면역 표현형 및 암 진행을 분석할 때 주의가 보장된다.

1. 멸균 PBS를 사용하여 D-루시페린 30mg/mL 용액을 준비합니다. 빛으로부터 보호하십시오. D-루시페린은 사용 전까지 -20°C에서 분취량으로 보관해야 한다.
2. 전자 면도기로 복부와 흉부를 면도하십시오. 이는 생체내 영상화 1일 전까지 행해질 수 있다.
3. 150 mg/kg 체중의 D-루시페린을 마우스에 복강내 주사한다(즉, 마우스 체중이 30g인 경우, D-루시페린 용액 150μL를 주입).
4. 마우스를 마취실에 넣고 마취하십시오. 유도를 위해 이소플루란의 5 %를 사용하고 유지 보수를 위해 2 % -3 %를 사용하십시오.
5. 분 후, 마우스를 측면 위치 (오른쪽 위쪽)에 놓습니다. 앞서 기술한 바와 같이 생체내 이미징 시스템(IVIS)을 이용하여 생체발광 이미지를 획득한다(^38,39).
   참고 : 마우스는 수핀 위치에 비해 측면 위치에서 더 안정적입니다. 따라서, 횡방향 위치는 일관된 초점면으로부터 발광 이미지를 얻는 것이 바람직하다.
6. 쥐를 빈 새장에 넣고 회복을 모니터링하십시오.
7. ^{도 38}에 기재된 바와 같이 Living Image Software를 사용하여 상복부에 관심 영역을 정의한다. 종양 세포 수에 대한 대리자로서 총 플럭스를 정량화한다.

5. 생존 분석 및 조직 수집

1. 마우스를 복부 팽창과 같은 전이의 임상 증상에 대해 신중하게 모니터링하십시오.
2. 마우스가 인간적 종말점에 도달하면_CO2 흡입에 의해 안락사시킨다.
   참고 : 연구소의 동물 윤리위원회에서 승인 한 연구 종점을 사용하십시오. 인간적 종말점을 결정하기 위해, 임상 기록 시트가 사용되었다; 점수는 다음과 같은 관찰 각각의 존재에 대해 주어진 한 점으로 계산되었다 : 체중 감소 > 15 %, 구부러진 자세, 주름진 코트, 탈수, 운동 감소, 복부 이탈 또는 안면 찡그린 얼굴. 일단 스코어 3에 도달하면, 마우스는 인간적으로 안락사되었다.
3. 안락사 직후에,⁴¹에 기재된 바와 같이, 흄 후드에서 10% 포르말린 30-50 mL로 심내 관류 고정을 수행한다. 관류 전에 가위로 여러 개의 작은 절개 (각각 최대 1cm)를 간장의 정상 부분으로 만들어 혈액과 포르말린의 배출구를 생성하십시오. 관류시 간 색이 빨간색에서 갈색으로 바뀝니다.
   참고 : 거시적으로 정상적인 간 부위의 미세 전이가 연구 대상이라면 연구자가 간을 자르지 말고 대신 우수한 베나 카바를 자르는 것이 좋습니다. 그러나 우리가이 방법을 사용했을 때, 간을 자르는 것과 비교할 때 간장의 고정이 더 나빠 보입니다. 특히 RNA in situ hybridization (ISH)이 간 절편에서 수행 될 계획이라면 위에서 설명한 것처럼 포르말린을 심장 내 주사하기 전에 간을 절개하는 것이 좋습니다. 이것은 간 조직의 충분한 고정을 가능하게 하여, ISH에 대한 RNA 완전성의 보존을 초래한다.
4. 간과 폐 조직을 10 % 포르말린에 넣고 밤새 고정하십시오. 포르말린을 70% 에탄올로 교체한 다음, 파라핀 임베딩을 실시한다.
5. 헤마톡실린 및 에오신 염색을 수행하여 종양 면적을 조직학적으로 평가한다. 관심있는 기질 마커에 대해 면역조직화학을 수행한다. Picro-Sirus Red 염색을 수행하여 콜라겐 양성 부위를 평가합니다.
   참고: ImageJ 소프트웨어⁽⁴² )는 면역조직화학 및 피크로-시리우스 레스 염색 데이터를 정량화하는데 사용될 수 있다. 컬러 디컨볼루션 기능과 MRI 섬유증 도구를 사용하여 각각 3,3'-디아미노벤지딘(DAB) 양성 영역과 피크로-시리우스 적색 양성 영역을 평가할 수 있습니다.

결과

간세포에서 종양-억제 기질 유전자인 Islr ^4,25,43,44의 AAV 매개 과발현을 유도하기 위해^, 우리는 AAV8을 코딩하는 Islr을 정맥내 주사하였다. AAV8-Islr의 1.0 x^{10 11} 바이러스 게놈 (vg), 또는 대조군으로서, AAV8-mRuby2, 성인 마우스 꼬리 정맥에 주사하였다 (도 1A

토론

이 연구에서, 우리는 마우스 CRC 오가노이드의 문맥 정맥 주사가 인간 CRC 간 전이의 조직학적 특징을 모방하는 섬유아세포가 풍부한 간 전이를 재현가능하게 생성한다는 것을 보여주었다. 또한, AAV8 매개 유전자 요법과 같은 스트로마 지향 치료제와 조합될 때, 이 전임상 모델은 마우스 생존 및 종양 성장에 대한 치료 효과를 평가하는 데 유용한 도구로서 작용한다.

프로토콜에...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% Formalin	Sigma	HT501128
15 mL centrifuge tube	Corning	430791
33-gauge needle	TSK	LDS-33013	For portal vein injection
4-0 vicryl suture	ETHICON	J494G
40-µm cell strainer	Corning	431750
5 mL Syringe	BD	302130	Used to apply saline to the intestine after portal vein injection
50 mL centrifuge tube	Corning	430829
50 mL syringe	TERUMO	SS*50LE	Luer lock syringe for perfusion fixation
70% Isopropyl alcohol wipe	Briemar	5730
Anaesthesia machine	Darvall	9356
αSMA antibody	DAKO	M0851	Clone 1A4. 1/500 dilution for immunohistochemistry
Buprenorphine	TROY	N/A	ilium Temvet Injection, 300 µg/ml Buprenorphine
Cotton buds	Johnson & Johnson	N/A	Johnson's pure cotton bud applicators. Need to be autoclaved before use.
D-luciferin	Biosynth	L-8220
Electric shaver			Sold by multiple suppliers
Forceps			Sold by multiple suppliers
Hamilton syringe	HAMILTON	81020	For portal vein injection
Heat box (animal warming chamber)	Datesand	MK3
Heat lamp			Sold by multiple suppliers
Hemostatic sponge	Pfizer	09-0891-04-015	Gelfoam absorbable gelatin sponge, USP, 12-7 mm
India ink	Talens	44727000
Injection syringe and needle	BD	326769	For tail vein injection
Islr probe (RNAscope)	ACD	450041
Isoflurane	Henry Schein	988-3244
IVIS Spectrum In Vivo Imaging System	Perkin Elmer	124262
Living Image Software	Perkin Elmer	128113
Matrigel	Corning	356231
MRI fibrosis tool	N/A	N/A	https://github.com/MontpellierRessourcesImagerie/imagej_macros_and_scripts/wiki/MRI_Fibrosis_Tool
Phosphate-buffered saline (PBS)	Sigma	D8537
RNAscope kit	ACD	322300
Rodent restrainer			Sold by multiple suppliers
Rosa26-Cas9 mouse	The Jackson Laboratory	024858
Saline	Pfizer	PHA19042010
Scissors			Sold by multiple suppliers
Skin staplers	Able Scientific	AS59028	9 mm wound clips
Stapler applicator	Able Scientific	AS59026	9 mm wound clip applicator
Stapler remover	Able Scientific	AS59037	Wound clip remover
Surgical drape	Multigate	29-220
Surgical gauze	Sentry Medical	GS001
Topical anesthesia cream	EMLA	N/A	EMLA 5% cream, 25 mg/g lignocaine and 25 mg/g prilocaine
TrypLE Express	Gibco	12605028	Recombinant cell-dissociation enzyme mix
Y-27632	Tocris	1254