JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Инъекция органоидов колоректального рака (CRC) в воротную вену генерирует богатые стромой метастазы в печень. Эта мышиная модель метастазирования печени CRC представляет собой полезный инструмент для изучения взаимодействий опухоли и стромы и разработки новых терапевтических средств, направленных на строму, таких как генная терапия, опосредованная аденоассоциированным вирусом.

Аннотация

Метастазы колоректального рака в печени (CRC) являются основной причиной смерти, связанной с раком. Связанные с раком фибробласты (CAF), основной компонент микроокружения опухоли, играют решающую роль в прогрессировании метастатического CRC и предсказывают плохой прогноз пациента. Тем не менее, не хватает удовлетворительных мышиных моделей для изучения перекрестных помех между метастатическими раковыми клетками и КАФ. Здесь мы представляем метод исследования того, как прогрессирование метастазирования в печени регулируется метастатической нишей и, возможно, может быть ограничено терапией, направленной на строму. Инъекция органоидов CRC в воротную вену вызвала десмопластическую реакцию, которая точно повторяла богатую фибробластами гистологию метастазов в печени CRC человека. Эта модель была тканеспецифичной с более высокой опухолевой нагрузкой в печени по сравнению с моделью внутриселезеночной инъекции, что упрощало анализ выживаемости мышей. Путем инъекции органоидов опухоли, экспрессирующих люциферазу, кинетика роста опухоли может контролироваться с помощью визуализации in vivo . Кроме того, эта доклиническая модель обеспечивает полезную платформу для оценки эффективности терапевтических средств, нацеленных на мезенхиму опухоли. Мы описываем методы изучения того, может ли аденоассоциированная вирусом доставка ингибирующего опухоль стромального гена к гепатоцитам реконструировать микроокружение опухоли и улучшить выживаемость мышей. Этот подход позволяет разрабатывать и оценивать новые терапевтические стратегии для ингибирования метастазирования CRC в печени.

Введение

Колоректальный рак (CRC) является основной причиной смертности от рака во всем мире1. Более чем у половины пациентов с КРР развиваются печеночные метастазы, которые возникают через диссеминацию портальной вены1. В настоящее время не существует эффективных терапевтических средств, которые могут вылечить прогрессирующие метастазы в печень, и большинство пациентов поддаются метастатическому заболеванию.

Метастатическая ниша или микроокружение опухоли играет ключевую роль в приживлении и росте диссеминированных CRC-клеток2. Связанные с раком фибробласты (CAF), важный компонент микроокружения опухоли, способствуют или сдерживают прогрессирование рака путем секреции факторов роста, ремоделирования внеклеточного матрикса (ECM) и модуляции иммунных ландшафтов и ангиогенеза 3,4,5. CAF также придают устойчивость к химиотерапии и иммунотерапии3. Кроме того, ЦАФ регулируют инициацию и прогрессирование метастазирования КРР в печень и прогнозируют прогноз у пациентов с КРР 3,6,7,8. Таким образом, факторы, связанные с CAF, могут быть использованы для разработки терапевтических стратегий для ингибирования метастазирования CRC в печень. Тем не менее, отсутствие удовлетворительных мышиных моделей для изучения метастатической опухолевой стромы было основным препятствием для разработки терапии, нацеленной на строму.

В настоящее время животные модели для изучения метастазов в печени CRC включают первичные модели CRC, которые спонтанно развивают метастазы в печени и модели трансплантации раковых клеток в печень. Первичные мышиные модели CRC, такие как генетически модифицированные мышиные модели и инъекции в толстую кишку раковых клеток, редко показывают метастазирование в печень 9,10,11,12. Более того, даже если наблюдается метастазирование в печени, эти модели показывают длительную латентность от первичной индукции опухоли до метастазирования и потенциально умирают от первичной опухолевойнагрузки 12. Для эффективного образования метастазов в печени культивируемые CRC-клетки трансплантируются в печень с использованием трех инъекционных подходов: внутриселезеночная инъекция, прямая внутрипенхимальная инъекция в печень и инъекция воротной вены. Внутриплодно введенные раковые клетки распространяются в селезеночную вену, воротную вену и, в конечном счете, в печень13,14. Тем не менее, внутриселезеночная инъекция дает более низкое соотношение взятия опухоли по сравнению с другими моделями трансплантации15,16. При внутриселезеночной инъекции выполняется хирургическое удаление селезенки, чтобы избежать роста рака в селезенке, который потенциально может поставить под угрозу созревание иммунных клеток17. Кроме того, внутриселезеночная инъекция может также привести к непреднамеренному росту опухоли в селезенке и брюшной полости18, что усложняет анализ метастазирования в печень. Прямая внутричерепная инъекция в печень эффективно индуцирует метастазирование в печени 16,19,20. Тем не менее, этот подход не полностью повторяет биологический этап метастазирования в печень, который естественным образом происходит через распространение в портальных венах. Используя прямую инъекцию в печень, проникновение раковых клеток в непортальный, но системный кровоток также может привести к множественным крупным метастазам в легкие16. Хотя у большинства пациентов с метастазами в печень CRC обнаруживаются множественные опухолевые узелки в печени21, прямая инъекция в определенную долю печени генерирует одну опухолевую массу19,20. Инъекция в воротную вену или инъекция в брыжеечную вену, хотя и технически сложная, позволяет эффективно доставлять опухолевые клетки в печень таким образом, чтобы повторить паттерны роста, наблюдаемые у пациентов17. Эта стратегия может свести к минимуму возможность метастазов вторичного сайта и обеспечивает быстрый рост раковых клеток в печени, упрощая анализ выживаемости мышей.

Исторически сложилось так, что линии клеток колоректального рака, такие как мышиный MC-38, человеческий HT-29 и SW-620, использовались для создания мышиных моделей метастазирования в печени22,23. Однако эти клеточные линии колоректального рака не вызывают десмопластическую стромальную реакцию. Низкое содержание стромы в опухолях затрудняет исследование биологических ролей связанных с раком фибробластов. Недавние достижения в области органоидов CRC и их трансплантации предложили полезные платформы для оценки жизненно важной роли стромы в прогрессировании рака24. Трансплантация в печени органоидов CRC генерирует богатое фибробластами микроокружение опухоли и дала новое представление о стромальных исследованиях 6,25. В настоящее время инъекция органоидов в портальные или брыжеечные вены стала золотым стандартом для генерации метастазов в печениCRC 6,25,26,27,28. Тем не менее, насколько нам известно, ни в одной из предыдущих работ не описывались подробные методы инъекции в воротные вены колоректальных опухолей. Здесь мы представляем методологию использования портальной инъекции органоидов CRC в вену для разработки новой аденоассоциированной вирусной (AAV)-опосредованной стромой терапии.

Гепатоциты являются важным компонентом микроокружения метастатической опухоли в печени и играют решающую роль в прогрессировании метастатического рака29. Вдохновленные успехом подходов генной терапии AAV для индуцирования экспрессии белка в гепатоцитах у неопухолевых пациентов 30,31, мы исследовали аналогичный подход, но направленный на модификацию микроокружения опухоли печени в CRC25. Таким образом, мы также описываем в настоящем описании инъекцию AAV8 в хвостовую вену для индуцирования экспрессии противоопухолевых белков для модификации микроокружения опухоли печени. Серотип AAV8, обозначаемый выбором белка вирусного капсида во время производства вируса, приводит к высокой эффективности трансдукции конкретно гепатоцитов (т.е. целевой экспрессии генов в микроокружении опухоли печени)32. Ранее мы показали, что Islr (суперсемейство иммуноглобулинов, содержащее богатый лейцином повтор) является CAF-специфическим геном, который индуцирует передачу сигналов костного морфогенетического белка (BMP), уменьшает рост опухолевых опухолей CRC и способствует дифференцировке кишечных стволовых клеток Lgr5+ 25. Мы проверили, может ли AAV8-опосредованная сверхэкспрессия сдерживающего рак стромального гена Islr в гепатоцитах ослабить прогрессирование метастазирования в печени путем выполнения инъекции в воротные вены опухолей CRC у мышей, получавших AAV8-Islr.

В этой статье мы сначала опишем процедуру инъекции хвостовой вены тропического AAV печени. Затем мы описываем метод подготовки опухолевых клеток и инъекции воротной вены мышам, обработанным AAV. Наконец, мы представляем подходы к мониторингу прогрессирования метастатической опухоли для оценки эффективности терапии, направленной на строму.

протокол

Все процедуры для животных в этой статье были рассмотрены и одобрены Комитетом по этике животных Южно-Австралийского института здравоохранения и медицинских исследований (номер одобрения, SAM322).

1. Инъекция аденоассоциированного вируса в хвостовую вену

ПРИМЕЧАНИЕ: Аденоассоциированный вирус (ААВ) следует рассматривать как биологическую опасность в соответствии с руководящими принципами уровня 1 по биобезопасности. Пожалуйста, обратитесь к опубликованному протоколу для получения, очистки и титрования AAV33. Гепатоцит-тропическая AAV, AAV834, кодирующая ген промотора-islr цитомегаловируса (ЦМВ), была использована в этом исследовании25. Чтобы вызвать AAV-опосредованную сверхэкспрессию, дозировка AAV может потребовать оптимизации в зависимости от активности промотора, гена и веса мыши.

  1. Разбавьте вектор AAV в 150 мкл аликвот, содержащих 1,0 х 1011 вирусных геномов, используя стерильный фосфат-буферный физиологический раствор (PBS) и удерживайте его на льду. Средства индивидуальной защиты следует носить для управления AAV.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Повторный цикл замораживания и оттаивания снижает титр вируса и его следует избегать. Исходный вирусный раствор следует хранить в морозильной камере при температуре -80 °C.
  2. Включите тепловую коробку (камеру для обогрева животных) для предварительного нагрева до 35 °C.
  3. Подержите мышь и нанесите крем для местной анестезии на всю длину хвоста по крайней мере за 15 минут до инъекции хвостовой вены.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это необязательный шаг и может не понадобиться, если это не требуется комитетом по этике животных института. Следуйте протоколу, утвержденному местным комитетом по этике животных. В этом эксперименте25 мышь Rosa26-Cas9 использовалась для инъекции AAV и последующей инъекции органоидов CRC в воротные вены. Учитывая, что опухоли, используемые в этом исследовании, были получены от мыши Rosa26-Cas9 (генетический фон C57BL / 6 x 129), этот штамм мыши также использовался в качестве иммунокомпетентных, сингенных реципиентов трансплантации опухоли. Использовались самцы и самки мышей Rosa26-Cas9 (от 6 до 24 недель).
  4. Поместите мышь в тепловую коробку. Оставьте мышь на срок до 15 минут, чтобы согреть и расширить хвостовые жилки.
  5. Аккуратно закрепите мышь в ограничителе для грызунов. Поместите хвост под тепловую лампу, чтобы обеспечить полное расширение хвостовых жилок.
  6. Извлеките 150 мкл разбавленного AAV (приготовленного на этапе 1.1) в стерильный шприц с малым мертвым пространством с иглой 27-30 Г.
  7. Переместите тепловую лампу и определите боковую хвостовую жилку, расположенную по бокам хвоста. Приложите небольшое натяжение на хвост пальцами, чтобы хвост стал прямым.
  8. Медленно вставьте 2-3 мм иглы, скосните вверх, в вену. Игла должна быть почти параллельна хвосту (до 15° от хвоста).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Приток крови в шприц может наблюдаться, если игла успешно расположена в вене.
  9. Вводят медленно. Если ощущается сопротивление или наблюдается отек кожи, удалите иглу и повторно вставьте над первым участком или в другую боковую вену.
  10. Подождите около 5 с после завершения инъекции, а затем медленно извлеките иглу. Немедленно нанесите мягкое давление на место инъекции чистой марлей или бумажным полотенцем до тех пор, пока кровотечение не прекратится.
  11. Осторожно отпустите мышь в клетку. Следите за животным, чтобы убедиться, что кровотечение остановилось.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Гиперэкспрессия генов в печени может быть оценена через 1-2 недели после инъекции AAV в хвостовую вену. Это может быть подтверждено, например, гибридизацией РНК in situ (ISH), иммуногистохимией (IHC), вестерн-блоттингом или количественной полимеразной цепной реакцией в реальном времени (qRT-PCR; Рисунок 1А,В). В ранее опубликованном исследовании25 AAV8-Islr использовался для сверхэкспрессии мышиного гена Islr в гепатоцитах, и сверхэкспрессия была обнаружена РНК ISH (рисунок 1A, B).

2. Клеточная подготовка к органоидам колоректального рака

ПРИМЕЧАНИЕ: Органоиды CRC, используемые для этого эксперимента, содержат исключительно эпителиальные клетки. Культура и генерация органоидов CRC были ранее описаны25,35. Короче говоря, нормальные эпителиальные клетки толстой кишки были выделены из толстой кишки мыши Rosa26-Cas9 с использованием буфера изоляции крипты (5 мМ ЭДТА (этилендиаминеттраацетат) в ледяном PBS), а затем внедрены в матричную среду базальной мембраны и культивированы в органоидной среде роста, как описано в ссылке35. Затем мутации Apc и Trp53 были введены в эпителиальные клетки толстой кишки путем сверхэкспрессии однонаправленных РНК, которые нацелены на Apc и Trp53 с использованием протокола экспрессии лентивируса. Одиночные органоидные клоны были отобранывручную 25. Органоиды рака толстой кишки pc Δ/Δи Trp53Δ/Δ (опухоли AP) вводили в виде 5,0 х 105 одиночных клеток в 100 мкл PBS с 10 мкМ Y-27632 в воротную вену на мышь, с органоидной культурой и одноклеточной подготовкой, описанной ниже.

  1. Культивируйте органоиды CRC в матричной среде куполов базальной мембраны в 24-луночной пластине или 10-сантиметровой посуде за 3-5 дней до инъекции воротной вены с получением органоидов диаметром 50-400 мкм.
  2. Приготовьте достаточное количество раствора для отслоения клеток, добавив Y-27632 к концентрации 10 мкМ, достаточную для переваривания количества органоидов, культивируемых для инъекции. Предварительно согреть на водяной бане при температуре 37 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор для отсоединения клеток, используемый в настоящем протоколе, представляет собой рекомбинантную смесь ферментов диссоциации клеток и используется в качестве заменителя трипсина в органоидной культуре (см. Таблицу материалов). Он уменьшает повреждение клеток, вызванное диссоциацией клеток, по сравнению с трипсином36. Y-27632 является ингибитором Rho-киназы и ингибирует диссоциативную гибель клеток, тем самым увеличивая выживаемость одиночных клеток37.
    1. Для инъекции до пяти мышей готовят две трубки, содержащие 40 мл раствора для отсоединения клеток, для переваривания 10-24 х 50 мкл куполов матрицы базальной мембраны, причем каждый купол содержит приблизительно 300 органоидов (диаметр 50-400 мкм), т. е. каждой мыши вводят 2-4,8 купола органоидов (что эквивалентно примерно 600-1440 органоидам). Количество органоидов, необходимое для получения достаточного количества клеток, зависит от органоидной линии и, следовательно, должно быть оптимизировано.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Вторая трубка объемом 40 мл позволяет повторно переваривать со свежим раствором для отслоения клеток для получения диссоциированных одиночных клеток.
  3. Тщательно аспирируйте органоидную среду из каждой лунки.
  4. Добавьте 1 мл ледяного PBS в каждую скважину в 24-луночной плите. Если используется блюдо размером 10 см, добавьте в блюдо 10 мл ледяного PBS.
  5. Сотрите матричную среду базальной мембраны с помощью наконечника пипетки P1000. Переложите pBS/среднюю суспензию в центрифужную трубку объемом 15 мл.
  6. Промыть каждую лунку одинаковым количеством PBS, чтобы собрать фрагменты матрицы базальной мембраны и добавить к трубке (трубам) 15 мл.
  7. Инкубировать в течение 5 мин на льду. Эта инкубация помогает растворить матричную среду базальной мембраны.
  8. Центрифугируйте трубку при 400 х г в течение 5 мин при 4 °C.
  9. Аспирируйте супернатант, следя за тем, чтобы не нарушать гранулированную среду и клетки.
  10. Добавьте 5 мл предварительно нагретого раствора для отсоединения клеток, приготовленного на стадии 2.2, к грануле, повторно суспендируйте гранулу 10 раз и переложите ее обратно в пробирку объемом 50 мл, содержащую свежий, предварительно нагретый раствор для отсоединения клеток.
  11. Поместите трубку на водяную баню с температурой 37 °C. Инкубировать в течение 5 мин.
  12. Центрифугируйте трубку при 400 х г в течение 3 мин при 4 °C.
  13. Повторите шаги 2.9-2.11.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Повторное ферментативное пищеварение позволяет эффективно диссоциировать клетки на отдельные клетки.
  14. Проверьте, диссоциируются ли органоиды на отдельные клетки, пипетируя 100 мкл в 96-луночную пластину и наблюдая под микроскопом. Если многие органоиды показывают клеточные сгустки, состоящие из более чем четырех клеток, может потребоваться более длительная инкубация с раствором отслоения клеток и физическая диссоциация путем тритурации пипеткой 10 мл.
  15. Как только большинство клеток станут одиночными клетками, добавьте 4 мл фетальной бычьей сыворотки (FBS) в 40 мл клеточной суспензии, чтобы остановить пищеварение. Промыть 40-мкм клеточный ситечко с 5 мл PBS.
  16. Пропустите клеточную суспензию через клеточный ситечко в трубку для сбора 50 мл, чтобы удалить любые клеточные сгустки.
  17. Центрифугируйте трубку при 400 х г в течение 5 мин при 4 °C.
  18. Аспирировать супернатанта. Добавьте 10 мл холодного PBS в гранулу ячейки и переложите ее в 15 мл центрифужной трубки.
  19. Центрифугируйте трубку при 400 х г в течение 5 мин при 4 °C.
  20. Аспирировать супернатанта. Повторно суспендировать гранулу в 500 мкл холодной PBS с 10 мкМ Y-27632. Подсчитайте ячейки.
  21. Отрегулируйте концентрацию в клетках до 5,0 x 105 отдельных клеток/100 мкл, используя PBS с 10 мкМ Y-27632. Поместите трубку на лед до тех пор, пока не будет выполнена инъекция воротной вены.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется вводить диссоциированные клетки в течение 4 ч после диссоциации.

3. Инъекция органоидов CRC в воротную вену

ПРИМЕЧАНИЕ: Все хирургические инструменты и хирургические марли должны быть автоклавированы или стерилизованы перед операцией. Этот протокол модифицирован по сравнению с предыдущим протоколом17. В этом эксперименте25 инъекцию в воротную вену проводили с использованием мышей Rosa26-Cas9, получавших AAV-mRuby2 или AAV-Islr на этапе 1.

  1. Подготовьте асептическую хирургическую область с помощью стерильных штор на грелке.
  2. Подготовьте хирургические инструменты (ножницы и щипцы), хирургическую и кровоостанавливающую губку, 4-0 полиглактиновой шов, ватные палочки, степлеры кожи, степлерный аппликатор, физиологический раствор, бупренорфин и иглу 33 г, прикрепленную к шприцу Гамильтона. Нарежьте гемостатическую губку на кусочки размером 1,0 см х 1,0 см.
  3. Отрегулируйте положение источника света, чтобы осветить хирургическую область.
  4. Вводят 0,1 мг/кг массы тела бупренорфина подкожно мыши для хирургического лечения боли.
  5. Обезболить мышь изофлураном в анестезиологической камере. Концентрация изофлурана для индукции и поддержания обычно составляет 5% и 2,5% соответственно. Проверьте отсутствие реакции на защемление пальца ноги перед началом следующей процедуры.
  6. Побрейте середину до верхней части брюшка мыши электробритвой. Бритье должно выполняться в области, удаленной от асептической хирургической области, чтобы избежать загрязнения волос в этом месте.
  7. Очистите место разреза, чередуя с бетадином и 80% этанолом для стерилизации хирургической области. Повторите три раза.
  8. Поместите мышь на грелку в лежачем положении с поддерживающей изофлурановой анестезией. Поместите хирургическую драпировку с отверстием над брюшком мыши.
  9. Поднимите кожу живота щипцами и сделайте ножницами разрез кожи 2-3 см по средней линии, разрезая только кожу (не подлежащую брюшину). Разрез должен варьироваться от середины живота до мечевидного отростка грудины. Разрез не должен идти выше нижнего конца мечевидного отростка.
  10. Полностью приподнимите стенку брюшины щипцами и сделайте ножницами аналогичный 2-3 см разрез брюшины. Избегайте разрезания кишечника и диафрагмы.
  11. Замочите хирургическую марлю теплым физиологическим раствором и поместите ее на левую сторону разреза (на левую сторону тела мыши; справа от хирурга).
  12. Аккуратно вытяните внутренние органы (тонкий и толстый кишечник) с помощью ватной палочки, пропитанной физиологическим раствором. Поместите кишечник на марлю, пропитанную физиологическим раствором.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Левосторонняя кишка мыши (т.е. кишка справа от хирурга) должна быть сначала вытащена, а затем правая сторона кишечника мыши (т.е. кишечник слева от хирурга) может быть вытащена.
  13. Отрегулируйте положение кишечника, чтобы визуализировать воротную вену. Накройте кишечник дополнительной влажной марлей, чтобы сохранить кишечник влажным.
  14. Осторожно потяните кишечник в левую сторону мокрой марлей и наложите мягкое натяжение влево. Это облегчает визуализацию воротной жилы (рисунок 2А).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если визуализация воротной вены затруднена, то в визуализации может помочь аккуратная корректировка положения желудка с помощью влажной ватной палочки.
  15. Аккуратно пипетку суспензию опухолей несколько раз получить для получения однородной клеточной суспензии. Медленно вытяните 100 мкл клеточной суспензии в шприц Гамильтона, прикрепленный к игле 33 G. Избегайте пузырьков воздуха.
  16. Медленно вставьте иглу, скос вверх, в воротную вену. Глубина введения вдоль иглы должна составлять 3-4 мм, при этом угол иглы почти параллельен воротной вене.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Инъекция должна быть выполнена в хорошо визуализированную часть воротной вены (обычно на расстоянии до 2 см от печеночного хилума). Избегайте движения иглы после того, как она будет полностью вставлена в воротную вену.
  17. Вводят опухолевые клетки в течение 30 с. Инъекцию следует выполнять медленно, чтобы предотвратить окклюзию воротной вены. Если инъекция прошла успешно, цвет печени временно меняется с красного на белый.
  18. Медленно извлеките иглу. Немедленно нанесите мягкое давление на место инъекции сухой ватной палочкой и подождите 5 мин.
  19. Снимите ватную палочку и одновременно нанесите гемостатическую губку на место инъекции. Подержите кровоостанавливающую губку ватной палочкой или щипцами и приложите мягкое давление еще 5 мин.
  20. Снимите давление на кровоостанавливающую губку и подтвердите, что кровотечения из места инъекции нет.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Биорассасывающуюся гемостатическую губку не нужно удалять. Попытка удалить марлю может вызвать повторное кровотечение из места инъекции.
  21. При возникновении кровотечения немедленно выполняют гемостаз давлением ватной палочкой в течение примерно 10 мин. Затем нанесите дополнительную кровоостанавливающую губку еще на 5 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если наблюдается неконтролируемая кровопотеря, мышь должна быть усыплена согласно протоколу, утвержденному комитетом по этике животных института.
  22. Удалите хирургические марли на кишечнике. Используя шприц, наполненный физиологическим раствором 5 мл, брызните физиологическим раствором в кишечник, чтобы предотвратить адгезию органов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не наносите физиологический раствор на место инъекции воротной вены. Это может вызвать повторное кровотечение.
  23. Аккуратно поместите кишечник обратно внутрь брюшной полости.
  24. Зашить брюшину с помощью 4-0 полиглактиновых швов.
  25. Поднимите обе стороны кожи щипцами. Нанесите степлеры для кожи, чтобы закрыть разрез кожи. Будьте осторожны, чтобы не скрепить кишечник.
  26. Выключите изофлуран, но поддерживайте поток кислорода. Внимательно следите за мышью. Когда мышь проснется, поместите мышь в пустую клетку на грелку. Мышь обычно просыпается в течение 5 минут.
  27. Внимательно следите за мышью, пока она не станет в сознании и нормально амбулирует.
  28. Подкожно вводят 0,1 мг/кг бупренорфина мыши через 4 ч после операции.
  29. Вводить 0,1 мг/кг бупренорфина мышам каждые 24 ч в течение последующих 2 дней.
  30. Тщательно следите за мышами ежедневно в течение недели после операции. Проверьте швы и заживление ран.
  31. через несколько дней после операции удалите степлеры кожи с помощью степлера.

4. Оценка кинетики роста опухоли методом биолюминесцентной визуализации in vivo

ПРИМЕЧАНИЕ: Если для инъекций используются опухоли, экспрессирующие светлячка, метастатическая прогрессия опухоли может контролироваться еженедельно с помощью визуализации in vivo, как описано38,39. Люцифераза, экспрессируемая раковыми клетками, может вызывать иммунные реакции против раковых клеток и ограничивать рост опухоли40. Таким образом, осторожность оправдана при анализе иммунных фенотипов и прогрессирования рака в мышиной модели с использованием люцифераз-экспрессирующих опухолевых клеток.

  1. Приготовьте раствор D-люциферина 30 мг/мл, используя стерильный PBS. Защитите его от света. D-люциферин следует хранить в аликвотах при -20 °C до начала использования.
  2. Побрейте брюшко и грудную клетку электронной бритвой. Это можно сделать за 1 день до визуализации in vivo .
  3. Вводят 150 мг/кг массы тела D-люциферина внутрибрюшинно мышам (т.е. если масса тела мыши составляет 30 г, вводят 150 мкл раствора D-люциферина).
  4. Поместите мышей в анестезиологическую камеру и обезбольте их. Используйте 5% изофлурана для индукции и 2%-3% для поддержания.
  5. мин позже поместите мышей в боковое положение (правой стороной вверх). Получение изображений биолюминесценции с помощью системы визуализации in vivo (IVIS), как описано ранее38,39.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мыши более устойчивы в боковом положении по сравнению с лежачим положением. Поэтому боковое положение предпочтительнее для получения люминесцентного изображения из последовательной фокальной плоскости.
  6. Поместите мышей в пустую клетку и следите за их восстановлением.
  7. Определите интересующие области в верхней части живота с помощью программного обеспечения Living Image, как описано38. Количественная оценка общего потока в качестве суррогата для количества опухолевых клеток.

5. Анализ выживаемости и сбор тканей

  1. Тщательно контролируйте мышей на предмет клинических симптомов метастазов, таких как растянутый живот.
  2. Усыплите мышь путем вдыхания CO2 , как только она достигнет гуманных конечных точек.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте конечную точку исследования, одобренную комитетом по этике животных института. Для определения гуманной конечной точки использовался лист клинической записи; Баллы были рассчитаны по одному баллу, который давался за наличие каждого из следующих наблюдений: потеря веса > 15%, сгорбленная осанка, взъерошенная шерсть, обезвоживание, снижение движения, растянутый живот или лицевая гримаса. Как только был достигнут балл 3, мышей гуманно усыпили.
  3. Сразу после эвтаназии выполняют транскардиальную перфузионную фиксацию 30-50 мл 10% формалина в вытяжке, как описано41. Сделайте несколько небольших разрезов (до 1 см каждый) ножницами в нормальную часть печени перед перфузией для выработки выходов крови и формалина. При перфузии цвет печени изменится с красного на коричневый.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если микрометастазы в макроскопически нормальных областях печени являются предметом исследования, мы рекомендуем исследователям не резать печень, а вместо этого разрезать верхнюю полую вену. Однако, когда мы использовали этот метод, фиксация печени кажется хуже по сравнению с разрезанием печени. Особенно, если гибридизацию РНК in situ (ISH) планируется проводить на участках печени, мы рекомендуем делать разрезы в печени перед внутрисердечной инъекцией формалина, как описано выше. Это обеспечивает достаточную фиксацию ткани печени, что приводит к сохранению целостности РНК для ISH.
  4. Поместите печень и легочные ткани в 10% формалин и зафиксируйте на ночь. Замените формалин 70% этанолом с последующим встраиванием парафина.
  5. Выполняют окрашивание гематоксилином и эозином для гистологической оценки площади опухоли. Выполните иммуногистохимию для стромальных маркеров, представляющих интерес. Выполните окрашивание Picro-Sirus Red для оценки коллаген-положительных областей.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Программное обеспечение42 ImageJ может быть использовано для количественной оценки иммуногистохимии и данных окрашивания Picro-Sirius Res. Функция деконволюции цвета и инструмент МРТ-фиброза могут быть использованы для оценки 3,3'-диаминобензидиновых (DAB)-положительных областей и пикро-Сириуса красных-положительных областей соответственно.

Результаты

Чтобы индуцировать AAV-опосредованную сверхэкспрессию сдерживающего опухоль стромального гена Islr 4,25,43,44 в гепатоцитах, мы внутривенно вводили Islr-кодирующий AAV8. 1,0 х 1011 вирусных геномов (vg) AAV8-Islr, или

Обсуждение

В этом исследовании мы показали, что инъекция органоидов CRC мыши в воротную вену воспроизводимо генерирует богатые фибробластами метастазы в печень, которые имитируют гистологические особенности печеночных метастазов CRC человека. Кроме того, в сочетании с терапией, направленной на ст?...

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Это исследование было поддержано грантами Национального совета по здравоохранению и медицинским исследованиям (APP1156391 для D.L.W., S.L.W.) (APP1081852 в D.L.W., APP1140236 в S.L.W., APP1099283 в D.L.W.,); Cancer Council SA Beat Cancer Project от имени своих доноров и правительства штата Южная Австралия через Департамент здравоохранения (MCF0418 to S.L.W., D.L.W.); грант на научные исследования (B) (20H03467 to M.T.) по заказу Министерства образования, культуры, спорта, науки и техники Японии; AMED-CREST (Японское агентство медицинских исследований и разработок, Core Research for Evolutional Science and Technology (19gm0810007h0104 and 19gm1210008s0101 to A.E.); Проект по исследованию рака и терапевтической эволюции (P-CREATE) от AMED (19cm0106332h0002 до A.E.); Японская программа содействия развитию науки за рубежом для молодых исследователей (для H.K.), стипендия Научного фонда Takeda (для H.K.), Greaton International Ph.D. Scholarship (для H.K.), Стипендия Lions Medical Research Foundation (для K.G.).

Мы благодарим д-ра Лешека Лисовского из Центра векторной и геномной инженерии (VGEF), Детского медицинского научно-исследовательского института (CMRI) (Новый Южный Уэльс, Австралия) за создание рекомбинантных векторов AAV.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
10% FormalinSigmaHT501128
15 mL centrifuge tubeCorning430791
33-gauge needleTSKLDS-33013For portal vein injection
4-0 vicryl sutureETHICONJ494G
40-µm cell strainerCorning431750
5 mL SyringeBD302130Used to apply saline to the intestine after portal vein injection
50 mL centrifuge tubeCorning430829
50 mL syringeTERUMOSS*50LELuer lock syringe for perfusion fixation
70% Isopropyl alcohol wipeBriemar5730
Anaesthesia machineDarvall9356
αSMA antibodyDAKOM0851Clone 1A4. 1/500 dilution for immunohistochemistry
BuprenorphineTROYN/Ailium Temvet Injection, 300 µg/ml Buprenorphine
Cotton budsJohnson & JohnsonN/AJohnson's pure cotton bud applicators. Need to be autoclaved before use.
D-luciferinBiosynthL-8220
Electric shaverSold by multiple suppliers
ForcepsSold by multiple suppliers
Hamilton syringeHAMILTON81020For portal vein injection
Heat box (animal warming chamber)DatesandMK3
Heat lampSold by multiple suppliers
Hemostatic spongePfizer09-0891-04-015Gelfoam absorbable gelatin sponge, USP, 12-7 mm
India inkTalens44727000
Injection syringe and needleBD326769For tail vein injection
Islr probe (RNAscope)ACD450041
IsofluraneHenry Schein988-3244
IVIS Spectrum In Vivo Imaging SystemPerkin Elmer124262
Living Image SoftwarePerkin Elmer128113
MatrigelCorning356231
MRI fibrosis toolN/AN/Ahttps://github.com/MontpellierRessourcesImagerie/imagej_macros_and_scripts/wiki/MRI_Fibrosis_Tool
Phosphate-buffered saline (PBS)SigmaD8537
RNAscope kitACD322300
Rodent restrainerSold by multiple suppliers
Rosa26-Cas9 mouseThe Jackson Laboratory024858
SalinePfizerPHA19042010
ScissorsSold by multiple suppliers
Skin staplersAble ScientificAS590289 mm wound clips
Stapler applicatorAble ScientificAS590269 mm wound clip applicator
Stapler removerAble ScientificAS59037Wound clip remover
Surgical drapeMultigate29-220
Surgical gauzeSentry MedicalGS001
Topical anesthesia creamEMLAN/AEMLA 5% cream, 25 mg/g lignocaine and 25 mg/g prilocaine
TrypLE ExpressGibco12605028Recombinant cell-dissociation enzyme mix
Y-27632Tocris1254

Ссылки

  1. Zarour, L. R., et al. Colorectal cancer liver metastasis: Evolving paradigms and future directions. Cell and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 3 (2), 163-173 (2017).
  2. Peinado, H., et al. Pre-metastatic niches: organ-specific homes for metastases. Nature Reviews. Cancer. 17 (5), 302-317 (2017).
  3. Kobayashi, H., et al. Cancer-associated fibroblasts in gastrointestinal cancer. Nature Reviews. Gastroenterology & Hepatology. 16 (5), 282-295 (2019).
  4. Mizutani, Y., et al. Meflin-positive cancer-associated fibroblasts inhibit pancreatic carcinogenesis. Cancer Research. 79 (20), 5367-5381 (2019).
  5. Gieniec, K. A., Butler, L. M., Worthley, D. L., Woods, S. L. Cancer-associated fibroblasts-heroes or villains. British Journal of Cancer. 121 (4), 293-302 (2019).
  6. Tauriello, D. V. F., et al. TGFbeta drives immune evasion in genetically reconstituted colon cancer metastasis. Nature. 554 (7693), 538-543 (2018).
  7. Calon, A., et al. Dependency of colorectal cancer on a TGF-beta-driven program in stromal cells for metastasis initiation. Cancer Cell. 22 (5), 571-584 (2012).
  8. Shen, Y., et al. Reduction of liver metastasis stiffness improves response to cevacizumab in metastatic colorectal cancer. Cancer Cell. 37 (6), 800-817 (2020).
  9. Romano, G., Chagani, S., Kwong, L. N. The path to metastatic mouse models of colorectal cancer. Oncogene. 37 (19), 2481-2489 (2018).
  10. Roper, J., et al. In vivo genome editing and organoid transplantation models of colorectal cancer and metastasis. Nature Biotechnology. 35 (6), 569-576 (2017).
  11. Lannagan, T. R. M., et al. Genetic editing of colonic organoids provides a molecularly distinct and orthotopic preclinical model of serrated carcinogenesis. Gut. 68 (4), 684-692 (2019).
  12. Lannagan, T. R., Jackstadt, R., Leedham, S. J., Sansom, O. J. Advances in colon cancer research: in vitro and animal models. Current Opinion in Genetics & Development. 66, 50-56 (2021).
  13. Soares, K. C., et al. A preclinical murine model of hepatic metastases. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (91), e51677 (2014).
  14. Yazdani, H. O., Tohme, S. Murine model of metastatic liver tumors in the setting of ischemia reperfusion injury. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (150), e59748 (2019).
  15. Frampas, E., et al. The intraportal injection model for liver metastasis: advantages of associated bioluminescence to assess tumor growth and influences on tumor uptake of radiolabeled anti-carcinoembryonic antigen antibody. Nuclear Medicine Communications. 32 (2), 147-154 (2011).
  16. O'Rourke, K. P., et al. Transplantation of engineered organoids enables rapid generation of metastatic mouse models of colorectal cancer. Nature Biotechnology. 35 (6), 577-582 (2017).
  17. Goddard, E. T., Fischer, J., Schedin, P. A portal vein injection model to study liver metastasis of breast cancer. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (118), e54903 (2016).
  18. Lee, W. Y., Hong, H. K., Ham, S. K., Kim, C. I., Cho, Y. B. Comparison of colorectal cancer in differentially established liver metastasis models. Anticancer Research. 34 (7), 3321-3328 (2014).
  19. Kollmar, O., Schilling, M. K., Menger, M. D. Experimental liver metastasis: standards for local cell implantation to study isolated tumor growth in mice. Clinical & Experimental Metastasis. 21 (5), 453-460 (2004).
  20. McVeigh, L. E., et al. Development of orthotopic tumour models using ultrasound-guided intrahepatic injection. Scientific Reports. 9 (1), 9904 (2019).
  21. Engstrand, J., Nilsson, H., Stromberg, C., Jonas, E., Freedman, J. Colorectal cancer liver metastases - a population-based study on incidence, management and survival. BMC Cancer. 18 (1), 78 (2018).
  22. Thalheimer, A., et al. The intraportal injection model: a practical animal model for hepatic metastases and tumor cell dissemination in human colon cancer. BMC Cancer. 9, 29 (2009).
  23. Limani, P., et al. Selective portal vein injection for the design of syngeneic models of liver malignancy. American Journal of Physiology Gastrointestinal and Liver Physiology. 310 (9), 682-688 (2016).
  24. Lau, H. C. H., Kranenburg, O., Xiao, H., Yu, J. Organoid models of gastrointestinal cancers in basic and translational research. Nature Reviews. Gastroenterology & Hepatology. 17 (4), 203-222 (2020).
  25. Kobayashi, H., et al. The balance of stromal BMP signaling mediated by GREM1 and ISLR drives colorectal carcinogenesis. Gastroenterology. 160 (4), 1224-1239 (2021).
  26. Fumagalli, A., et al. Genetic dissection of colorectal cancer progression by orthotopic transplantation of engineered cancer organoids. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (12), 2357-2364 (2017).
  27. Fumagalli, A., et al. Plasticity of Lgr5-Negative Cancer Cells Drives Metastasis in Colorectal Cancer. Cell Stem Cell. 26 (4), 569-578 (2020).
  28. de Sousa e Melo, F., et al. A distinct role for Lgr5(+) stem cells in primary and metastatic colon cancer. Nature. 543 (7647), 676-680 (2017).
  29. Lee, J. W., et al. Hepatocytes direct the formation of a pro-metastatic niche in the liver. Nature. 567 (7747), 249-252 (2019).
  30. Dunbar, C. E., et al. Gene therapy comes of age. Science. 359 (6372), 4672 (2018).
  31. George, L. A., et al. Hemophilia B gene therapy with a high-specific-activity factor IX variant. The New England Journal of Medicine. 377 (23), 2215-2227 (2017).
  32. Colella, P., Ronzitti, G., Mingozzi, F. Emerging issues in AAV-mediated in vivo gene therapy. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 8, 87-104 (2018).
  33. Fripont, S., Marneffe, C., Marino, M., Rincon, M. Y., Holt, M. G. Production, purification, and quality control for adeno-associated virus-based vectors. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (143), e58960 (2019).
  34. Sands, M. S. AAV-mediated liver-directed gene therapy. Methods in Molecular Biology. 807, 141-157 (2011).
  35. O'Rourke, K. P., Ackerman, S., Dow, L. E., Lowe, S. W. Isolation, culture, and maintenance of mouse intestinal stem cells. Bio-protocol. 6 (4), 1733 (2016).
  36. Ellerstrom, C., Strehl, R., Noaksson, K., Hyllner, J., Semb, H. Facilitated expansion of human embryonic stem cells by single-cell enzymatic dissociation. Stem Cells. 25 (7), 1690-1696 (2007).
  37. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  38. Oshima, G., et al. Advanced animal model of colorectal metastasis in liver: Imaging techniques and properties of metastatic clones. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (117), e54657 (2016).
  39. Anker, J. F., Mok, H., Naseem, A. F., Thumbikat, P., Abdulkadir, S. A. A bioluminescent and fluorescent orthotopic syngeneic murine model of androgen-dependent and castration-resistant prostate cancer. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (133), e57301 (2018).
  40. Baklaushev, V. P., et al. Luciferase expression allows bioluminescence imaging but imposes limitations on the orthotopic mouse (4T1) model of breast cancer. Scientific Reports. 7 (1), 7715 (2017).
  41. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (65), e3564 (2012).
  42. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  43. Hara, A., et al. Roles of the mesenchymal stromal/stem cell marker meflin in cardiac tissue repair and the development of diastolic dysfunction. Circulation Research. 125 (4), 414-430 (2019).
  44. Hara, A., et al. Meflin defines mesenchymal stem cells and/or their early progenitors with multilineage differentiation capacity. Genes to Cells. 26 (7), 495-512 (2021).
  45. Wang, H., et al. RNAscope for in situ detection of transcriptionally active human papillomavirus in head and neck squamous cell carcinoma. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (85), e51426 (2014).
  46. Lattouf, R., et al. Picrosirius red staining: a useful tool to appraise collagen networks in normal and pathological tissues. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 62 (10), 751-758 (2014).
  47. Lugli, A., et al. Recommendations for reporting tumor budding in colorectal cancer based on the International Tumor Budding Consensus Conference (ITBCC) 2016. Modern Pathology. 30 (9), 1299-1311 (2017).
  48. Sangisetty, S. L., Miner, T. J. Malignant ascites: A review of prognostic factors, pathophysiology and therapeutic measures. World Journal of Gastrointest Surgery. 4 (4), 87-95 (2012).
  49. Jung, B., Staudacher, J. J., Beauchamp, D. Transforming growth factor beta superfamily signaling in development of colorectal cancer. Gastroenterology. 152 (1), 36-52 (2017).
  50. Hapach, L. A., Mosier, J. A., Wang, W., Reinhart-King, C. A. Engineered models to parse apart the metastatic cascade. NPJ Precision Oncology. 3, 20 (2019).
  51. Jackstadt, R., et al. Epithelial NOTCH signaling rewires the tumor microenvironment of colorectal cancer to drive poor-prognosis subtypes and metastasis. Cancer Cell. 36 (3), 319-336 (2019).
  52. Lo, Y. -. H., Karlsson, K., Kuo, C. J. Applications of organoids for cancer biology and precision medicine. Nature Cancer. 1 (8), 761-773 (2020).
  53. van de Wetering, M., et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).
  54. Ben-David, U., et al. Genetic and transcriptional evolution alters cancer cell line drug response. Nature. 560 (7718), 325-330 (2018).
  55. Kattenhorn, L. M., et al. Adeno-associated virus gene therapy for liver disease. Human Gene Therapy. 27 (12), 947-961 (2016).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

175

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены