הזרקת וריד פורטל של אורגנואידים לסרטן המעי הגס לחקר סטרומה גרורות בכבד

Summary

הזרקת וריד פורטל של אורגנואידים מסרטן המעי הגס (CRC) יוצרת גרורות כבד עשירות בסטרומה. מודל עכבר זה של גרורות כבד CRC מייצג כלי שימושי לחקר אינטראקציות בין גידול לסטרומה ולפיתוח טיפולים חדשניים המכוונים לסטרומה כגון טיפולים גנטיים בתיווך וירוסים הקשורים לאדנו.

Abstract

גרורות בכבד של סרטן המעי הגס (CRC) הן הגורם המוביל למוות הקשור לסרטן. פיברובלסטים הקשורים לסרטן (CAFs), מרכיב מרכזי במיקרו-סביבה של הגידול, ממלאים תפקיד מכריע בהתקדמות CRC גרורתית ומנבאים פרוגנוזה לקויה של המטופלים. עם זאת, חסרים מודלים משביעי רצון של עכברים כדי לחקור את ההצלבה בין תאים סרטניים גרורתיים לבין CAFs. כאן אנו מציגים שיטה לחקור כיצד התקדמות גרורות בכבד מווסתת על ידי הנישה הגרורתית וייתכן שניתן לרסן אותה על ידי טיפול מכוון סטרומה. הזרקת ורידים פורטלית של אורגנואידים CRC יצרה תגובה דסמופלסטית, אשר שחזרה בנאמנות את ההיסטולוגיה העשירה בפיברובלסטים של גרורות כבד CRC אנושיות. מודל זה היה ספציפי לרקמות עם עומס גידול גבוה יותר בכבד בהשוואה למודל הזרקה תוך-טחולית, מה שמפשט את ניתוחי ההישרדות של העכברים. על ידי הזרקת אורגנואידים של גידולים המבטאים לוציפראז, ניתן היה לנטר קינטיקה של גדילת הגידול על ידי הדמיית in vivo . יתר על כן, מודל פרה-קליני זה מספק פלטפורמה שימושית להערכת היעילות של טיפולים המכוונים למזנכים של הגידול. אנו מתארים שיטות לבחון אם העברה בתיווך נגיף הקשור לנגיף של גן סטרומלי מעכב גידול להפטוציטים יכולה לשפץ את המיקרו-סביבה של הגידול ולשפר את הישרדות העכברים. גישה זו מאפשרת פיתוח והערכה של אסטרטגיות טיפוליות חדשניות לעיכוב גרורות בכבד של CRC.

Introduction

סרטן המעי הגס (CRC) הוא הגורם העיקרי לתמותה מסרטן ברחבי העולם¹. יותר ממחצית מחולי ה-CRC מפתחים גרורות בכבד המתרחשות באמצעות הפצת וריד הפורטל¹. נכון לעכשיו, אין טיפולים יעילים שיכולים לרפא גרורות מתקדמות בכבד, ורוב החולים נכנעים למחלה גרורתית.

הנישה הגרורתית או המיקרו-סביבה של הגידול ממלאת תפקיד מפתח בהשתקה ובצמיחה של תאי CRC מופצים². פיברובלסטים הקשורים לסרטן (CAFs), מרכיב בולט במיקרו-סביבה של הגידול, מקדמים או מרסנים את התקדמות הסרטן באמצעות הפרשת גורמי גדילה, שיפוץ המטריצה החוץ-תאית (ECM) וויסות נופי מערכת החיסון והאנגיוגנזה ^3,4,5. CAFs גם מעניקים עמידות לכימותרפיה ולאימונותרפיות³. יתר על כן, CAFs מווסתים את ההתחלה וההתקדמות של גרורות בכבד CRC ומנבאים פרוגנוזה בחולים עם CRC 3,6,7,8. לפיכך, גורמים הקשורים ל- CAF יכולים להיות מנוצלים לפיתוח אסטרטגיות טיפוליות לעיכוב גרורות בכבד CRC. עם זאת, היעדר מודלים משביעי רצון של עכברים לחקר סטרומה של הגידול הגרורתי היווה מכשול מרכזי לפיתוח טיפולים ממוקדי סטרומה.

נכון לעכשיו, מודלים של בעלי חיים לחקר גרורות בכבד CRC כוללים מודלים ראשוניים של CRC המפתחים באופן ספונטני גרורות בכבד ומודלים של השתלת תאים סרטניים לתוך הכבד. מודלים ראשוניים של עכברי CRC, כגון מודלים של עכברים מהונדסים גנטית והזרקה מעי גסה של תאים סרטניים, מראים רק לעתים רחוקות גרורות לכבד 9,10,11,12. יתר על כן, גם אם נצפתה גרורתה בכבד, מודלים אלה מראים חביון ארוך מהאינדוקציה של הגידול הראשוני ועד גרורות, ועלולים למות מנטל הגידול הראשוני¹². כדי ליצור ביעילות גרורות בכבד CRC, תאי CRC בתרבית מושתלים בכבד באמצעות שלוש גישות הזרקה: הזרקה תוך-הטחולית, הזרקה תוך-פרנכימית ישירה לתוך הכבד והזרקת וריד פורטלי. תאים סרטניים שהוזרקו באופן תוך-ספלני התפשטו לווריד הטחול, לווריד הפורטלי, ובסופו של דבר לכבד^13,14. עם זאת, הזריקה התוך-טחולית מניבה יחס נטילת גידול נמוך יותר בהשוואה למודלים אחרים של השתלה^15,16. עם הזרקה תוך-טחולית, הסרה כירורגית של הטחול מבוצעת כדי למנוע צמיחת סרטן בטחול, מה שעלול לפגוע בהבשלת תאי מערכת החיסון¹⁷. יתר על כן, הזרקה תוך-טחולית יכולה גם לגרום לצמיחה לא מכוונת של הגידול בטחול ובחלל הבטן¹⁸, מה שמסבך את ניתוחי הגרורות בכבד. הזרקה תוך-פרנכימלית ישירה לתוך הכבד גורמת ביעילות לגרורות בכבד 16,19,20. עם זאת, גישה זו אינה משחזרת באופן מלא שלב ביולוגי של גרורות בכבד המתרחש באופן טבעי באמצעות הפצת ורידים בפורטל. באמצעות הזרקה ישירה לתוך הכבד, כניסה של תאים סרטניים לתוך לא פורטל, אבל מחזור הדם המערכתי יכול גם לגרום למספר גרורות ריאה גדולות¹⁶. למרות שרוב החולים עם גרורות בכבד CRC מראים מספר גושים של גידולים בכבד²¹, הזרקה ישירה לאונת כבד ספציפית מייצרת מסת גידול אחת^19,20. הזרקת וריד פורטלי או הזרקת ורידים מזנטריים, למרות שהיא מאתגרת מבחינה טכנית, מאפשרת העברה יעילה של תאי גידול לתוך הכבד באופן שמשחזר את דפוסי הגדילה שנראו בחולים¹⁷. אסטרטגיה זו יכולה למזער את האפשרות של גרורות באתר משני ומאפשרת צמיחה מהירה של תאים סרטניים בכבד, תוך פישוט ניתוחי הישרדות של עכברים.

מבחינה היסטורית, קווי תאים של סרטן המעי הגס כגון עכבר MC-38, HT-29 אנושי ו- SW-620 שימשו ליצירת מודלים של עכברים של גרורות בכבד^22,23. עם זאת, קווי תאים אלה של סרטן המעי הגס אינם גורמים לתגובה סטרומלית דסמופלסטית. תכולה סטרומלית נמוכה בגידולים מקשה על חקר התפקידים הביולוגיים של פיברובלסטים הקשורים לסרטן. ההתקדמות האחרונה באורגנואידים של CRC ובהשתלתם הציעה פלטפורמות שימושיות להערכת תפקידים חיוניים של הסטרומה בהתקדמות הסרטן²⁴. השתלת כבד של אורגנואידים CRC מייצרת מיקרו-סביבה של גידול עשיר בפיברובלסטים וסיפקה תובנות חדשניות על מחקר סטרומלי ^6,25. נכון לעכשיו, הזרקת ורידים פורטלית או מזנטרית של אורגנואידים הפכה לגישה סטנדרטית זהב ליצירת גרורות בכבד CRC 6,25,26,27,28. עם זאת, למיטב ידיעתנו, אף מאמר קודם לא תיאר שיטות מפורטות להזרקת ורידים פורטליים של גידולים במעי הגס. כאן, אנו מציגים מתודולוגיה לשימוש בהזרקת ורידים פורטלית של אורגנואידים מסוג CRC כדי לפתח טיפול חדשני בהכוונת סטרומה בתיווך נגיף אדנו (AAV).

הפטוציטים הם מרכיב חשוב של המיקרו-סביבה של הגידול הגרורתי בכבד וממלאים תפקיד קריטי בהתקדמות סרטן גרורתי²⁹. בהשראת ההצלחה של גישות ריפוי גנטי AAV להשראת ביטוי חלבונים בהפטוציטים בחולים שאינם ניאופלסטיים^30,31, חקרנו גישה דומה אך מכוונת לשנות את המיקרו-סביבה של גידולי הכבד ב-CRC²⁵. ככזה, אנו מתארים כאן גם את הזרקת וריד הזנב של AAV8 כדי לגרום לביטוי של חלבונים אנטי-סרטניים כדי לשנות את המיקרו-סביבה של גידולי הכבד. הסרוטיפ AAV8, המיועד על ידי בחירה של חלבון קפסיד נגיפי במהלך ייצור הנגיף, מוביל ליעילות טרנסדוקציה גבוהה במיוחד של הפטוציטים (כלומר, ביטוי גנים ממוקד במיקרו-סביבה של גידולי הכבד)³². בעבר הראינו כי Islr (משפחת-על אימונוגלובולינים המכילה חזרה עשירה בלאוצין) הוא גן ספציפי ל-CAF המעורר איתות של חלבון מורפוגנטי בעצמות (BMP), מפחית את צמיחת הגידולים של CRC ומקדם התמיינות תאי גזע במעיים Lgr5^{+ 25}. בדקנו אם ביטוי יתר בתיווך AAV8 של הגן הסטרומלי מרסן הסרטן, Islr, בהפטוציטים יכול להחליש את התקדמות גרורות הכבד על ידי ביצוע הזרקת ורידים פורטליים של גידולי CRC בעכברים שטופלו ב-AAV8-Islr.

במאמר זה, אנו מתארים לראשונה את הליך הזרקת ורידי הזנב של AAV טרופי כבד. לאחר מכן, אנו מתארים שיטה להכנת תאים סרטניים והזרקת ורידים פורטליים לעכברים שטופלו ב-AAV. לבסוף, אנו מציגים גישות לניטור התקדמות הגידול הגרורתי כדי להעריך את היעילות של טיפולים מכווני סטרומה.

Protocol

כל ההליכים בבעלי חיים במאמר זה נבדקו ואושרו על ידי הוועדה לאתיקה של בעלי חיים במכון הבריאות והמחקר הרפואי של דרום אוסטרליה (מספר אישור, SAM322).

1. הזרקת וריד זנב של וירוס הקשור לאדנו

הערה: יש לטפל בנגיף הקשור ל-Adeno (AAV) כביו-האזרד תחת הנחיות בטיחות ביולוגית ברמה 1. אנא עיין בפרוטוקול שפורסם להכנת AAV, טיהור וטיטרציה³³. AAV הפטוציטים-טרופיים, AAV8³⁴, המקודדים את הגן מקדם ציטומגלווירוס (CMV) מקדם-Islr , שימש במחקר זה²⁵. כדי לגרום לביטוי יתר בתיווך AAV, מינון AAV עשוי לדרוש אופטימיזציה בהתאם לפעילות המקדם, הגן ומשקל העכבר.

1. דיללו וקטור AAV ל-150 μL aliquots המכילים 1.0 x 10¹¹ גנומים נגיפיים, תוך שימוש במי מלח סטריליים עם מאגר פוספט (PBS) והשארתו על קרח. יש ללבוש ציוד מגן אישי כדי להתמודד עם ה- AAV.
   הערה: מחזור ההקפאה וההפשרה החוזרים ונשנים מקטין את הטיטר של הנגיף ויש להימנע ממנו. הפתרון הוויראלי המלאי צריך להיות מאוחסן במקפיא של -80 מעלות צלזיוס.
2. הפעילו תיבת חום (תא לחימום בעלי חיים) כדי לחמם מראש ל-35 מעלות צלזיוס.
3. החזיקו עכבר והניחו קרם הרדמה מקומי לכל אורך הזנב לפחות 15 דקות לפני הזרקת וריד הזנב.
   הערה: זהו צעד אופציונלי וייתכן שלא יהיה בו צורך אם הוא אינו נדרש על ידי ועדת האתיקה של בעלי החיים של המכון. פעל בהתאם לפרוטוקול שאושר על ידי ועדת האתיקה המקומית של בעלי חיים. בניסוי זה²⁵, עכבר Rosa26-Cas9 שימש להזרקת AAV והזרקת וריד פורטלי לאחר מכן של אורגנואידים CRC. בהתחשב בכך שהגידולים ששימשו במחקר זה נגזרו מעכבר Rosa26-Cas9 (רקע גנטי C57BL/6 x 129), זן עכבר זה שימש גם כמושתלים חיסוניים וסינגניים של השתלת הגידול. נעשה שימוש בעכברי רוזה26-Cas9 זכרים ונקבות (בני 6 עד 24 שבועות).
4. מכניסים את העכבר לתוך תיבת החום. השאירו את העכבר עד 15 דקות כדי לחמם ולהרחיב את ורידי הזנב.
5. אבטח בעדינות את העכבר במעצור מכרסמים. הניחו את הזנב מתחת למנורת חום כדי להבטיח התרחבות מלאה של ורידי הזנב.
6. ציירו 150 μL של AAV מדולל (מוכן בשלב 1.1) לתוך מזרק סטרילי בחלל נמוך עם מחט 27-30 G.
7. הזיזו את מנורת החום וזהו את וריד הזנב הצדדי הממוקם בצידי הזנב. שים מתח קל על הזנב עם האצבעות, כך שהזנב הופך ישר.
8. לאט לאט להכניס 2-3 מ"מ של המחט, להתפצל למעלה, לתוך הווריד. המחט צריכה להיות כמעט מקבילה לזנב (עד 15° מהזנב).
   הערה: ניתן להבחין בזרימת דם למזרק אם המחט ממוקמת בהצלחה לתוך הווריד.
9. להזריק לאט. אם מורגשת התנגדות או נפיחות בעור נצפתה, הסר את המחט והכנס מחדש מעל האתר הראשון או לווריד הצדדי האחר.
10. יש להמתין כ-5 שניות לאחר השלמת ההזרקה, ולאחר מכן להסיר באיטיות את המחט. מיד להפעיל לחץ עדין על אתר ההזרקה עם גזה נקייה או מגבת נייר עד הדימום מפסיק.
11. שחררו בעדינות את העכבר לתוך הכלוב שלו. עקוב אחר החיה כדי לוודא שהדימום נעצר.
    הערה: ניתן להעריך ביטוי יתר של גנים בכבד 1 עד 2 שבועות לאחר הזרקת וריד זנב AAV. ניתן לאשר זאת, למשל, על ידי הכלאה של RNA in situ (ISH), אימונוהיסטוכימיה (IHC), כתם מערבי, או תגובת שרשרת פולימראז כמותית בזמן אמת (qRT-PCR; איור 1א,ב). במחקר²⁵ שפורסם בעבר, AAV8-Islr שימש לביטוי יתר של גן איסלר עכבר בהפטוציטים, וביטוי יתר זוהה על ידי RNA ISH (איור 1A,B).

2. הכנת תאים לאורגנואידים של סרטן המעי הגס

הערה: אורגנואידים של CRC המשמשים לניסוי זה מכילים אך ורק תאי אפיתל. תרבית ויצירת אורגנואידים של CRC תוארו בעבר^25,35. בקיצור, תאי אפיתל קולוניאליים רגילים בודדו מהמעי הגס של עכבר Rosa26-Cas9 באמצעות חיץ בידוד קריפטה (5 mM EDTA (אתילנדיאמינטטראצטט) ב- PBS קר כקרח), ולאחר מכן הוטמעו במדיום מטריצת ממברנת מרתף, ותרביתם בתווך גדילה אורגנואידי כמתואר בהפניה³⁵. לאחר מכן, מוטציות Apc ו-Trp53 הוכנסו לתאי האפיתל של המעי הגס על ידי ביטוי יתר של רנ"א חד-כיווניים המכוונים נגד Apc ו-Trp53 באמצעות פרוטוקול הביטוי lentivirus. שיבוטים אורגנואידים בודדים נבחרו בקפידה²⁵. מחשב^Δ/Δו- Trp53^{Δ/Δ אורגנואידים} של סרטן המעי הגס (AP tumoroids), הוזרקו כ-5.0 x 10⁵ תאים בודדים ב-100 μL של PBS עם 10 μM Y-27632 לתוך וריד הפורטל לכל עכבר, עם תרבית אורגנואידית והכנת תאים בודדים המתוארים להלן.

1. תרבית האורגנואידים של CRC במטריצת ממברנת המרתף כיפות בינוניות בצלחת של 24 בארות או צלחת של 10 ס"מ 3-5 ימים לפני הזרקת הווריד הפורטלי כדי להשיג אורגנואידים בקוטר 50-400 מיקרומטר.
2. הכינו כמות מספקת של תמיסת ניתוק תאים על ידי הוספת ריכוז Y-27632 לריכוז של 10 מיקרומטר, מספיק כדי לעכל את מספר האורגנואידים שעוברים תרבית לצורך ההזרקה. חמה מראש באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס.
   הערה: תמיסת ניתוק התאים המשמשת בפרוטוקול זה היא תערובת אנזים רקומביננטית של דיסוציאציה של תאים ומשמשת כתחליף לטריפסין בתרבית אורגנואידית (ראו טבלת חומרים). הוא מפחית את הנזק התאי הנגרם על ידי דיסוציאציה של תאים בהשוואה לטריפסין³⁶. Y-27632 הוא מעכב רו קינאז ומעכב מוות של תאים הנגרמים על ידי דיסוציאציה, ובכך מגביר את ההישרדות של תאים^{בודדים 37}.
   1. להזרקה לעד חמישה עכברים, הכינו שני צינורות המכילים 40 מ"ל של תמיסת ניתוק התאים לעיכול 10-24 x 50 מיקרול' של כיפות מטריצת ממברנה במרתף כאשר כל כיפה מכילה כ-300 אורגנואידים (קוטר של 50-400 מיקרומטר), כלומר, כל עכבר מוזרק עם 2-4.8 כיפות של אורגנואידים (שווה ערך לכ-600-1440 אורגנואידים). מספר האורגנואידים הדרושים כדי להשיג מספר תא מספיק תלוי בקו האורגנואידים, ולכן יש לייעל אותו.
      הערה: צינור 40 מ"ל השני מאפשר עיכול חוזר עם תמיסת ניתוק תאים טרייה כדי להשיג תאים בודדים מנותקים.
3. בזהירות לשאוף את המדיום האורגנואידי מכל באר.
4. הוסיפו 1 מ"ל של PBS קר כקרח לכל באר בצלחת של 24 בארות. אם משתמשים במנה של 10 ס"מ, הוסיפו למנה 10 מ"ל של PBS קר כקרח.
5. לגרד את מדיום מטריצת קרום המרתף באמצעות קצה פיפטה P1000. העבר את ה-PBS/סלרי בינוני לצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל.
6. יש לשטוף כל באר באותה כמות של PBS כדי לאסוף שברי מטריצת ממברנת מרתף ולהוסיף לצינור(ים) של 15 מ"ל.
7. דגירה במשך 5 דקות על קרח. דגירה זו מסייעת להמיס את מדיום מטריצת קרום המרתף.
8. צנטריפוגה את הצינור ב 400 x g במשך 5 דקות ב 4 °C (64 °F).
9. לשאוף את supernatant להבטיח לא להפריע את המדיום גלולה ואת התאים.
10. הוסיפו 5 מ"ל של תמיסת ניתוק תאים שחוממה מראש שהוכנה בשלב 2.2 לכדורית, החזירו את הכדור 10 פעמים והעבירו אותו בחזרה לצינור 50 מ"ל המכיל תמיסת ניתוק תאים טרייה ומחוממת מראש.
11. הניחו את הצינור באמבט המים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. אינקובציה למשך 5 דקות
12. צנטריפוגה את הצינור ב 400 x g במשך 3 דקות ב 4 °C (64 °F).
13. חזור על שלבים 2.9-2.11.
    הערה: עיכול אנזימטי חוזר ונשנה מאפשר דיסוציאציה יעילה של תאים לתאים בודדים.
14. בדוק אם האורגנואידים מנותקים לתאים בודדים על ידי צנרת 100 μL לתוך צלחת של 96 בארות ותצפית תחת מיקרוסקופ. אם אורגנואידים רבים מראים גושי תאים המורכבים מיותר מארבעה תאים, ייתכן שיהיה צורך בדגירה ארוכה יותר עם תמיסת ניתוק התאים ודיסוציאציה פיזית על ידי טריטורציה עם פיפטה של 10 מ"ל.
15. ברגע שרוב התאים הם תאים בודדים, הוסיפו 4 מ"ל של סרום בקר עוברי (FBS) לתרחיף התאים של 40 מ"ל כדי לעצור את העיכול. יש לשטוף מסננת של 40 מיקרומטר עם PBS של 5 מ"ל.
16. מעבירים את תרחיף התא דרך מסננת התא לתוך צינור איסוף של 50 מ"ל כדי להסיר את כל גושי התאים.
17. צנטריפוגה את הצינור ב 400 x g במשך 5 דקות ב 4 °C (64 °F).
18. לשאוף את הסופרנאטנט. הוסיפו 10 מ"ל של PBS קר לכדור התא והעבירו אותו לצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל.
19. צנטריפוגה את הצינור ב 400 x g במשך 5 דקות ב 4 °C (64 °F).
20. לשאוף את הסופרנאטנט. בצעו החייאה של הכדור ב-500 μL קר PBS עם 10 μM Y-27632. ספרו את התאים.
21. התאם את ריכוז התא ל- 5.0 x 10⁵ תאים בודדים / 100 μL, באמצעות PBS עם 10 μM Y-27632. מניחים את הצינור על קרח עד לביצוע הזרקת וריד הפורטל.
    הערה: מומלץ להזריק תאים מנותקים תוך 4 שעות של דיסוציאציה.

3. הזרקת וריד פורטל של אורגנואידים CRC

הערה: כל כלי הניתוח והגאוזים הכירורגיים חייבים להיות אוטוקלבים או מעוקרים לפני הניתוח. פרוטוקול זה שונה מפרוטוקול קודם¹⁷. בניסוי זה²⁵, הזרקת ורידים פורטליים בוצעה באמצעות עכברי Rosa26-Cas9 שטופלו ב-AAV-mRuby2 או AAV-Islr בשלב 1.

1. הכינו אזור כירורגי אספטי באמצעות וילונות סטריליים על משטח חימום.
2. הכינו כלי ניתוח (מספריים ומלקחיים), ספוג כירורגי והמוסטטי, תפר פוליגלקטין 4-0, ניצני כותנה, מהדקי עור, אפליקטור מהדק, מי מלח, בופרנורפין ומחט 33 גרם המחוברת למזרק המילטון. חותכים את הספוג ההמוסטי לחתיכות של 1.0 ס"מ על 1.0 ס"מ.
3. התאם את מיקום מקור האור כדי להאיר את האזור הניתוחי.
4. יש להזריק לעכבר משקל גוף של 0.1 מ"ג/ק"ג של בופרנורפין תת עורית לצורך טיפול בכאב כירורגי.
5. להרדים את העכבר עם איזופלורן בתא הרדמה. ריכוז איזופלורן לאינדוקציה ותחזוקה הם בדרך כלל 5% ו -2.5%, בהתאמה. בדוק את היעדר התגובה לצביטת הבוהן לפני תחילת ההליך הבא.
6. לגלח את הבטן האמצעית עד העליונה של העכבר באמצעות מכונת גילוח חשמלית. הגילוח צריך להתבצע באזור מרוחק מהאזור הכירורגי האספטי כדי למנוע זיהום שיער באתר.
7. נקו את אתר החתך לסירוגין עם בטאדין ו-80% אתנול כדי לעקר את האזור הכירורגי. חזרו על הפעולה שלוש פעמים.
8. מניחים את העכבר על כרית חימום במצב שכיבה עם הרדמה איזופלורנית תחזוקה. מניחים וילון כירורגי עם חור מעל הבטן של העכבר.
9. הרימו את עור הבטן עם מלקחיים ועשו חתך עור של 2-3 ס"מ בקו האמצע עם מספריים, חותכים את העור בלבד (לא את הצפק הבסיסי). החתך צריך לנוע מאמצע הבטן ועד לתהליך ה-xiphoid של עצם החזה. החתך לא צריך ללכת מעל הקצה התחתון של תהליך xiphoid.
10. להרים באופן מלא את דופן הצפק עם מלקחיים ולעשות חתך דומה 2-3 ס"מ לצפק עם מספריים. הימנע חיתוך המעי ואת הסרעפת.
11. משרים את הגזה הכירורגית במי מלח חמים ומניחים אותה בצד שמאל של החתך (בצד שמאל של גוף העכבר; לימינו של המנתח).
12. משכו בעדינות את האיברים הפנימיים (המעי הדק והמעי הגס) החוצה באמצעות ניצן כותנה ספוג במי מלח. מניחים את המעיים על הגזה ספוגה במי מלח.
    הערה: יש לשלוף תחילה את המעיים בצד שמאל של העכבר (כלומר, מעיים מימינו של המנתח), ולאחר מכן לשלוף את המעיים בצד ימין של העכבר (כלומר, מעיים משמאלו של המנתח).
13. התאם את מיקום המעיים כדי לדמיין את וריד הפורטל. מכסים את המעיים בגאזה רטובה נוספת כדי לשמור על לחות המעיים.
14. משכו בעדינות את המעי לצד שמאל עם הגזה הרטובה והחלו מתח עדין על שמאל. זה מקל על הדמיה של וריד הפורטל (איור 2A).
    הערה: אם ההדמיה של וריד הפורטל קשה, התאמה עדינה של מיקום הבטן עם ניצן כותנה רטוב עשויה לעזור להדמיה.
15. בעדינות פיפטה תרחיף סרטני מספר פעמים כדי לקבל תרחיף תא הומוגני. לאט לאט משכו 100 μL של מתלי התא לתוך מזרק המילטון המחובר למחט של 33 גרם. הימנעו מבועות אוויר.
16. הכניסו באיטיות את המחט, התרחבו, לתוך וריד הפורטל. עומק ההחדרה לאורך המחט צריך להיות 3-4 מ"מ, כאשר זווית המחט כמעט מקבילה לווריד הפורטל.
    הערה: יש לבצע את ההזרקה לחלק המדומיין היטב של וריד הפורטל (בדרך כלל עד 2 ס"מ הרחק מההילום הכבד). הימנע מתזוזה של המחט לאחר שהיא מוכנסת במלואה לווריד הפורטל.
17. להזריק תאי גידול במשך 30 שניות. ההזרקה צריכה להתבצע באיטיות כדי למנוע חסימה של וריד הפורטל. אם ההזרקה מוצלחת, צבע הכבד משתנה באופן זמני מאדום ללבן.
18. הסר את המחט באיטיות. מיד להפעיל לחץ עדין על מקום ההזרקה עם ניצן כותנה יבשה ולהמתין 5 דקות.
19. מוציאים את ניצן הכותנה ובמקביל מורחים ספוג המוסטטי על מקום ההזרקה. החזיקו ספוג המוסטטי עם ניצן כותנה או מלקחיים והפעילו לחץ עדין במשך 5 דקות נוספות.
20. הסר את הלחץ לספוג המוסטטי ואשר כי אין דימום מאתר ההזרקה.
    הערה: אין צורך להסיר את הספוג ההמוסטטי הנספג ביולוגית. ניסיון להסיר את הגזה עלול לגרום לדימום חוזר מאתר ההזרקה.
21. אם מתרחש דימום, מיד לבצע hemostasis בלחץ עם ניצן כותנה במשך כ 10 דקות. לאחר מכן, יש למרוח ספוג המוסטטי נוסף למשך 5 דקות נוספות.
    הערה: אם נצפה אובדן דם בלתי נשלט, יש להרדים את העכבר על פי הפרוטוקול שאושר על ידי ועדת האתיקה של בעלי חיים של המכון.
22. הסר את הגזוזים הכירורגיים על המעיים. באמצעות מזרק מלא 5 מ"ל מלוחים, להשפריץ מלח על המעיים כדי למנוע הידבקות איברים.
    הערה: אין להחיל מלח על אתר הזרקת הוורידים בפורטל. זה עלול לגרום לדימום מחדש.
23. הניחו בעדינות את המעיים בחזרה בתוך חלל הבטן.
24. לתפור את הצפק באמצעות 4-0 תפרים פוליגלקטין.
25. להרים את שני צידי העור עם מלקחיים. יש למרוח מהדקי עור כדי לסגור את החתך בעור. היזהרו לא להדק את המעי.
26. כבו את האיזופלורן אך המשיכו להפעיל את זרימת החמצן. נטר בזהירות את העכבר. כאשר העכבר מתעורר, הניחו את העכבר בכלוב ריק על משטח חימום. העכבר מתעורר בדרך כלל תוך 5 דקות.
27. עקוב בקפידה אחר העכבר עד שהוא בהכרה ואמבולציה כרגיל.
28. תת עורית להזריק 0.1 מ"ג/ק"ג בופרנורפין לעכבר 4 שעות לאחר הניתוח.
29. הזריקו 0.1 מ"ג/ק"ג בופרנורפין לעכבר כל 24 שעות במשך היומיים הבאים.
30. יש לעקוב בקפידה אחר העכברים מדי יום במשך שבוע לאחר הניתוח. בדוק תפרים וריפוי פצעים.
31. ימים לאחר הניתוח, יש להסיר מהדקי עור באמצעות מסיר מהדק.

4. הערכת קינטיקה של גדילת גידולים על ידי הדמיה ביולומינסנטית in vivo

הערה: אם משתמשים בגידולים המבטאים Firefly להזרקה, ניתן לעקוב אחר התקדמות הגידול הגרורתי מדי שבוע על ידי הדמיית in vivo כמתואר^38,39. לוציפראז המתבטא על ידי תאים סרטניים יכול לעורר תגובות חיסוניות נגד התאים הסרטניים ולהגביל את צמיחת הגידול⁴⁰. לפיכך, נדרשת זהירות בניתוח פנוטיפים חיסוניים והתקדמות סרטן במודל עכברי באמצעות תאי גידול המבטאים לוציפראז.

1. הכינו תמיסה של 30 מ"ג/מ"ל של D-לוציפרין באמצעות PBS סטרילי. הגן עליו מפני אור. יש לאחסן D-לוציפרין באליקוטים בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
2. לגלח את הבטן ואת בית החזה עם מכונת גילוח אלקטרונית. ניתן לעשות זאת עד יום אחד לפני הדמיית in vivo .
3. הזריקו לעכברים משקל גוף של 150 מ"ג/ק"ג של D-לוציפרין באופן תוך-צפקי (כלומר, אם משקל גוף העכבר הוא 30 גרם, הזריקו 150 μL של תמיסת D-לוציפרין).
4. מניחים את העכברים בתא הרדמה ומרדים אותם. השתמש ב-5% מהאיזופלורן לאינדוקציה וב-2%-3% לתחזוקה.
5. דקות מאוחר יותר, הניחו את העכברים במצב רוחבי (צד ימין למעלה). רכוש תמונות ביולומינסנציה באמצעות מערכת הדמיה in vivo (IVIS) כפי שתואר קודם לכן^38,39.
   הערה: עכברים יציבים יותר במצב רוחבי בהשוואה לתנוחת השכיבה. לכן, מיקום רוחבי עדיף כדי לקבל תמונת זוהר ממישור מוקד עקבי.
6. הניחו את העכברים בכלוב ריק ועקבו אחר החלמתם.
7. הגדר אזורי עניין בבטן העליונה באמצעות תוכנת Living Image כמתואר³⁸. לכמת את השטף הכולל כפונדקאית למספר תאי הגידול.

5. ניתוח הישרדות ואיסוף רקמות

1. עקוב בקפידה אחר עכברים לתסמינים קליניים של גרורות כגון בטן מעוותת.
2. המתת עכבר על ידי שאיפת CO₂ ברגע שהוא מגיע לנקודות קצה הומאניות.
   הערה: השתמש בנקודת קצה של מחקר שאושרה על ידי הוועדה לאתיקה של בעלי חיים במכון. כדי לקבוע נקודת קצה הומאנית, נעשה שימוש בגיליון רשומה קלינית; הציונים חושבו על ידי נקודה אחת שניתנה לנוכחות של כל אחת מהתצפיות הבאות: ירידה במשקל > 15%, תנוחה מחובקת, פרווה פרועה, התייבשות, ירידה בתנועה, בטן מעוותת או צער פנים. ברגע שהגיעו לציון 3, העכברים הומתו באופן הומאני.
3. מיד לאחר המתת חסד, בצע קיבוע פרפוזיה טרנסקרדיאלית עם 30-50 מ"ל של 10% פורמלין במכסה אדים, כמתואר⁴¹. לעשות כמה חתכים קטנים (עד 1 ס"מ כל אחד) עם מספריים לתוך החלק הרגיל של הכבד לפני זלוף כדי ליצור שקעים עבור דם ופורמלין. עם הזלוף, צבע הכבד ישתנה מאדום לחום.
   הערה: אם מיקרומטסטזות באזורי כבד מקרוסקופיים תקינים הן נושא למחקר, אנו ממליצים לחוקרים לא לחתוך את הכבד, אלא לחתוך את הווריד קאווה המעולה במקום זאת. עם זאת, כאשר השתמשנו בשיטה זו, קיבוע של הכבד נראה גרוע יותר בהשוואה לחיתוך הכבד. במיוחד אם הכלאה של RNA in situ (ISH) מתוכננת להתבצע על חתכים בכבד, אנו ממליצים לבצע חתכים בכבד לפני הזרקה תוך-לבבית של פורמלין, כמתואר לעיל. זה מאפשר קיבוע מספיק של רקמת הכבד, וכתוצאה מכך שמירה על שלמות הרנ"א עבור ISH.
4. מכניסים את רקמות הכבד והריאות ל-10% פורמלין ומקבעים את הלילה. החלף את הפורמלין ב-70% אתנול, ולאחר מכן הטמעת פרפין.
5. בצע צביעת המטוקסילין ואוזין כדי להעריך באופן היסטולוגי את אזור הגידול. לבצע אימונוהיסטוכימיה עבור סמנים סטרומליים של עניין. בצע את הכתמת Picro-Sirus Red כדי להעריך אזורים חיוביים לקולגן.
   הערה: ניתן להשתמש בתוכנת ImageJ⁴² כדי לכמת אימונוהיסטוכימיה ונתוני צביעה של Picro-Sirius Res. ניתן להשתמש בפונקציית דה-קונבולוציה של צבע ובכלי פיברוזיס MRI כדי להעריך 3,3'-Diaminobenzidine (DAB)-אזורים חיוביים ואזורים חיוביים אדומים של Picro-Sirius, בהתאמה.

תוצאות

כדי לגרום לביטוי יתר בתיווך AAV של גן סטרומלי מרסן גידול, Islr 4,25,43,44, בהפטוציטים, הזרקנו תוך ורידי AAV8 המקודד על ידי איסלר. 1.0 x 10¹¹ גנומים נגיפיים (vg) של AAV8-Islr, או כבקרה, AAV8-mRuby2, הוזרקו לווריד זנב העכבר הבוגר (...

Discussion

במחקר זה, הראינו כי הזרקת ורידים פורטליים של אורגנואידים CRC של עכברים יוצרת באופן משוחזר גרורות כבד עשירות בפיברובלסטים המחקות תכונות היסטולוגיות של גרורות כבד CRC אנושיות. יתר על כן, בשילוב עם טיפולים מכווני סטרומה כגון ריפוי גנטי בתיווך AAV8, מודל פרה-קליני זה משמש ככלי שימושי להערכת השפעות...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% Formalin	Sigma	HT501128
15 mL centrifuge tube	Corning	430791
33-gauge needle	TSK	LDS-33013	For portal vein injection
4-0 vicryl suture	ETHICON	J494G
40-µm cell strainer	Corning	431750
5 mL Syringe	BD	302130	Used to apply saline to the intestine after portal vein injection
50 mL centrifuge tube	Corning	430829
50 mL syringe	TERUMO	SS*50LE	Luer lock syringe for perfusion fixation
70% Isopropyl alcohol wipe	Briemar	5730
Anaesthesia machine	Darvall	9356
αSMA antibody	DAKO	M0851	Clone 1A4. 1/500 dilution for immunohistochemistry
Buprenorphine	TROY	N/A	ilium Temvet Injection, 300 µg/ml Buprenorphine
Cotton buds	Johnson & Johnson	N/A	Johnson's pure cotton bud applicators. Need to be autoclaved before use.
D-luciferin	Biosynth	L-8220
Electric shaver			Sold by multiple suppliers
Forceps			Sold by multiple suppliers
Hamilton syringe	HAMILTON	81020	For portal vein injection
Heat box (animal warming chamber)	Datesand	MK3
Heat lamp			Sold by multiple suppliers
Hemostatic sponge	Pfizer	09-0891-04-015	Gelfoam absorbable gelatin sponge, USP, 12-7 mm
India ink	Talens	44727000
Injection syringe and needle	BD	326769	For tail vein injection
Islr probe (RNAscope)	ACD	450041
Isoflurane	Henry Schein	988-3244
IVIS Spectrum In Vivo Imaging System	Perkin Elmer	124262
Living Image Software	Perkin Elmer	128113
Matrigel	Corning	356231
MRI fibrosis tool	N/A	N/A	https://github.com/MontpellierRessourcesImagerie/imagej_macros_and_scripts/wiki/MRI_Fibrosis_Tool
Phosphate-buffered saline (PBS)	Sigma	D8537
RNAscope kit	ACD	322300
Rodent restrainer			Sold by multiple suppliers
Rosa26-Cas9 mouse	The Jackson Laboratory	024858
Saline	Pfizer	PHA19042010
Scissors			Sold by multiple suppliers
Skin staplers	Able Scientific	AS59028	9 mm wound clips
Stapler applicator	Able Scientific	AS59026	9 mm wound clip applicator
Stapler remover	Able Scientific	AS59037	Wound clip remover
Surgical drape	Multigate	29-220
Surgical gauze	Sentry Medical	GS001
Topical anesthesia cream	EMLA	N/A	EMLA 5% cream, 25 mg/g lignocaine and 25 mg/g prilocaine
TrypLE Express	Gibco	12605028	Recombinant cell-dissociation enzyme mix
Y-27632	Tocris	1254