RNA-seq数据中替代剪接和聚腺苷酸化的鉴定

摘要

选择性剪接（AS）和替代聚腺苷酸化（APA）扩大了转录本亚型及其产物的多样性。在这里，我们描述了生物信息学协议，以分析批量RNA-seq和3'末端测序测定，以检测和可视化不同实验条件下变化的AS和APA。

摘要

除了对RNA-Seq进行典型分析以测量实验/生物学条件下的差异基因表达（DGE）外，RNA-seq数据还可用于探索外显子水平的其他复杂调控机制。选择性剪接和聚腺苷酸化通过产生不同的亚型来调节转录后水平的基因表达，在基因的功能多样性中起着至关重要的作用，并且将分析限制在整个基因水平上可能会错过这一重要的调控层。在这里，我们演示了详细的分步分析，以使用Bioconductor和其他封装和功能（包括DEXSeq，Limma封装的diffSplice和rMATS）来识别和可视化不同条件下的差异外显子和聚腺苷酸化位点的使用。

引言

多年来，RNA-seq已被广泛用于估计差异基因表达和基因发现¹。此外，它还可用于估计由于表达不同亚型的基因而导致的不同外显子水平使用情况，从而有助于更好地了解转录后水平的基因调控。大多数真核基因通过交替剪接（AS）产生不同的亚型，以增加mRNA表达的多样性。AS事件可分为不同的模式：跳过完全外显子（SE），其中（“盒式”）外显子与其侧翼内含子一起从转录本中完全去除;当外显子两端存在两个或多个剪接位点时，备选（供体）5'剪接位点选择（A5SS）和备选方案3'（受体）剪接位点选择（A3SS）;当内含子保留在成熟的mRNA转录本中时保留内含子（RI）和相互排除外显子使用（MXE），其中一次只能保留两个可用外显子中的一个2^，3。替代聚腺苷酸化（APA）在使用替代聚（A）位点从单个转录本产生多种mRNA亚型4的基因表达中也起着^{重要作用。}大多数聚腺苷酸化位点（pA）位于3'非翻译区域（3'UTR），产生具有不同3'UTR长度的mRNA亚型。由于 3' UTR 是识别调控元件的中心枢纽，因此不同的 3' UTR 长度会影响 mRNA 的定位、稳定性和翻译⁵。有一类 3' 末端测序测定经过优化，可检测 APA，这些APA在协议⁶的细节上有所不....

研究方案

1. 安装分析中使用的工具和 R 包

1. Conda 是一个流行且灵活的包管理器，允许在所有平台上方便地安装包及其依赖项。使用“Anaconda”（conda包管理器）安装“conda”，可用于安装分析所需的工具/包。
2. 根据 https://www.anaconda.com/products/individual#Downloads 的系统要求下载“Anaconda”，并按照图形安装程序中的提示进行安装。通过在 Linux 命令行中键入以下内容，使用 'conda' 安装所有必需的软件包。
   conda install -c daler sratoolkit
conda install -c conda-forge parallel
conda install -c bioconda star bowtie fastqc rmats rmats2sashimiplot samtools fasterq-dump cutadapt bedtools deeptools
3. 若要下载协议中使用的所有 R 包，请在 R 控制台（通过键入“R”在 Linux 命令行上启动）或 Rstudio 控制台中键入以下代码。
   bioc_packages<- c("DEXSeq", "Rsubread", "EnhancedVolca....

结果

运行上述分步工作流程后，AS和APA分析输出和代表性结果以表格和数据图的形式生成，生成如下。

如：
AS分析的主要输出（差异拼接的补充表1;DEXSeq的表2）是显示不同条件差异用法的外显子列表，以及显示其一个或多个组成外显子的显着整体剪接活性的基因列表，按统计学显着性排名。补充表1，选项卡2显示了显着的外显?.......

讨论

在这项研究中，我们评估了基于外显子和基于事件的方法，以检测批量RNA-Seq和3'末端测序数据中的AS和APA。基于外显子的AS方法既产生差异表达的外显子列表，又产生按总体基因水平差异剪接活性的统计显着性排序的基因水平排名（表1-2，4-5）。对于diffSplice包，差异用法是通过在外显子水平上拟合加权线性模型来确定的，以估计外显子的差异对数倍数变化与同一基因内其他外显子的平.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Not relevent for computational study