使用扫描电子显微镜可视化膜褶皱形成

摘要

大旋毛细胞增多症是一种高度保守的内吞作用过程，由形成富含F的片状膜突起（也称为膜褶皱）而引发。大旋细胞溶质内化速率增加与各种病理疾病有关。该协议提出了一种使用扫描电子显微镜 在体外 量化膜褶皱形成的方法。

摘要

膜褶皱是含有新聚合的肌动蛋白丝网状物的运动质膜突起的形成。膜褶皱可能自发形成或响应于生长因子、炎性细胞因子和磷脂醇酯。一些膜突起可能重组成圆形膜褶皱，在其远端边缘融合并形成杯子，这些杯子关闭并分离成称为大的异质液泡，称为大孔蛋白酶体。在此过程中，褶皱会捕获细胞外液和内化在大蛋白酶体内的溶质。高分辨率扫描电子显微镜（SEM）是一种常用的成像技术，用于可视化和量化细胞表面上的膜褶皱形成，圆形突起和封闭的大毛细胞杯。以下方案描述了细胞培养条件， 体外 膜褶皱形成的刺激，以及如何固定，脱水和制备用于使用SEM成像的细胞。该方法可以帮助回答有关大毛细胞增多症在生理和病理过程中的作用的关键问题，研究调节膜褶皱形成的新靶点，并鉴定尚未表征的生理刺激物以及巨棘球增多症的新型药理学抑制剂。

引言

大毛细胞增多症是一种内吞过程，负责通过形成动态和肌动蛋白驱动的质膜突起（称为膜褶皱¹）内化大量细胞外液及其含量。许多这些膜褶皱形成杯子，这些杯子关闭并融合回细胞上，并与质膜分离成大而异质的细胞内体，也称为大蛋白酶体¹。虽然在多种细胞类型中，巨噬细胞增多症是由巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）和表皮生长因子（EGF）等生长因子诱导的，但在先天免疫细胞²，³，⁴，^{5，6，7，8}中也观察到另一种独特的钙依赖性过程，称为组成性大羽细胞增多症。

细胞通过大羽核细胞增多症内化细胞外物质的能力已被证明在从营养吸收到病原体捕获和抗原呈递的各种生理过程中起重要作用^9，10，11。然而，由于这一过程是非选择性和可诱导的，它也与许多病理条件有关。事实上，以前的研究表明，巨旋毛细胞增多症在阿尔茨海默病，帕金森病，癌症，肾结石和动脉粥样硬化中起重要作用^{12，13，14，15，16}。此外，某些细菌和病毒已被证明利用大羽翼虫病进入宿主细胞并诱导感染^17，18。有趣的是，巨旋细胞增多症的刺激也可用于在各种疾病条件下靶向递送治疗剂^19，20。

以前的研究已经探索了大旋毛细胞增多症，方法是使用流式细胞术和共聚焦成像在不存在和存在抑制大羽细胞增多症的药理学药物的情况下定量内化荧光标记的液相标志物^21，22。目前可用的抑制大旋毛细胞增多症的药理学工具仅限于并包括1）肌动蛋白聚合抑制剂（细胞查拉菌素D和latrunculins），2）PI3K阻滞剂（LY-290042和麦芽素）和3）钠氢交换剂（NHE）抑制剂（阿米洛利和EIPA）^{5，14，15，23，24，25}.然而，由于这些抑制剂具有内吞作用的独立作用，因此很难选择性地确定大毛细胞增多对溶质摄取和疾病发病机制的贡献，特别是在 体内²¹中。

扫描电子显微镜（SEM）是一种电子显微镜，它使用聚焦的电子束²⁶产生细胞的超高分辨率图像。在大毛细胞增多症研究中，SEM成像被认为是可视化质膜的形貌和形态特征，量化膜褶皱形成并研究其向大胰岛素体内化进展的金标准技术。此外，在存在和不存在大毛细胞增多症阻滞剂的情况下，扫描电子显微镜结合溶质摄取的定量，为体 外检查大羽细胞溶质内化提供了可靠的策略。本文提供了有关如何为SEM制备细胞，可视化细胞表面，量化褶皱形成以及检查其向杯封和大胰岛素体内化进展的详细方案。

研究方案

注意:以下是用于使用SEM显微镜定量RAW 264.7巨噬细胞中膜褶皱形成的通用方案。可能需要针对不同的细胞类型进行优化。

1. 细胞系和细胞培养

1. 在Dulbecco的改良鹰培养基（DMEM）中生长RAW 264.7巨噬细胞，并在37°C和5%CO₂的加湿培养箱中补充10%（体积/体积）热灭活胎牛血清（FBS），100 IU / mL青霉素和100μg/ mL链霉素。每隔一天更换一次生长培养基。
2. 当细胞融合80%时，使用无菌PBS洗涤板两次。
3. 通过加入1，000μL0.5%胰蛋白酶-EDTA分离细胞，并将细胞培养板在37°C的加湿培养箱中孵育3-5分钟。
4. 在光学显微镜下检查板以确认细胞解离。加入10mL含有10%FBS的生长培养基以灭活胰蛋白酶。
5. 将细胞悬浮液收集在50mL锥形管中，并在室温下以400× g 离心5分钟。轻轻地将细胞重悬于完整的细胞培养基中，并使用台盼蓝（0.4%）染色测定细胞计数和活力。
   注意:该实验的推荐最小细胞活力为>90%。
6. 使用高压灭菌的镊子将无菌玻璃盖玻片放入24孔板的孔中。将细胞以1×10⁶ 细胞/ mL的密度将种子细胞放在盖玻片上，并将板在37°C和5%CO₂的加湿培养箱中孵育过夜。
7. 在处理前用新鲜的500μL完整培养基更换每个孔的培养基。用载体（DMSO或其他用于溶解EIPA的溶剂）或大旋细胞增多症抑制剂5-（N-乙基-N-异丙基）-阿米洛利（EIPA，25μM²¹）预处理巨噬细胞30分钟。
8. 用大旋毛细胞增多症的载体和刺激物处理细胞以促进膜皱褶:佛波bol 12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯（PMA，1μM，30分钟²¹）和巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF，100ng / mL，30分钟³）。
   注意:大棘球菌病的替代抑制剂[例如，拉龙古菌素 A （1 μM，30 分钟）或细胞查拉辛 D （1 μM，30 min）] 和刺激剂 [例如，表皮生长因子 （EGF， 100 ng/mL， 10 分钟）或血小板衍生生长因子 （PDGF， 100 ng/mL， 15 min）] 也可用于表征巨噬细胞和其他细胞类型的大棘皮细胞增多症^{16，27，28，29}.在用大棘球增多症的生理刺激物治疗之前，细胞可能需要过夜血清饥饿。重要的是要注意，必须确定最有效的浓度和孵育时间，以刺激其他细胞类型的大旋毛细胞增多症。

2. 扫描电镜固定

1. 处理后，从孔中吸出培养基，并用冰冷的PBS清洗盖玻片两次。
2. 在室温下固定细胞（4%多聚甲醛和2%戊二醛在0.1M二甲酸钠中）30分钟，然后在4°C下在固定剂中孵育过夜。
3. 轻轻洗涤并用500μL以下试剂孵育盖玻片，而不会干扰细胞单层。
   1. 在0.1M二甲肱酸钠中洗涤一次，孵育15分钟。
   2. 用dH₂O洗涤两次，每次洗涤10分钟。
   3. 用25%乙醇洗涤两次，每次洗涤10分钟孵育。
   4. 用50%乙醇洗涤两次，每次洗涤10分钟孵育。
   5. 用75%乙醇洗涤两次，每次洗涤10分钟孵育。
   6. 用80%乙醇洗涤两次，每次洗涤10分钟孵育。
   7. 用95%乙醇洗涤两次，每次洗涤10分钟孵育。
   8. 用100%乙醇洗涤两次。在每次洗涤中进行10分钟的孵育。
      注意:应快速更换/更换试剂，以防止细胞风干。盖玻片可以在4°C下在100%乙醇中放置数天。 对于长期储存，添加额外的100%乙醇并用parafilm覆盖孔，以防止样品的空气干燥。

3. 临界点干燥

1. 将盖玻片放入临界点干燥器中，并用100%乙醇盖住。按 电源 按钮并打开 CO₂ 油箱。
2. 按住 冷却 按钮约30秒，直到温度降至0°C。 按"填充"按钮，直到腔室窗口中出现气泡。
3. 按下 "吹扫 "按钮，直到吹扫排气中的乙醇气味消失。再次 按下冷却 按钮，直到温度降至 0 °C。
4. 按下 "填充 "和" 清除 "按钮以将其关闭并关闭 CO₂ 油箱。按下" 冷却 "按钮将其关闭，然后按" 加热 "按钮。
5. 将温度设置为42°C，压力设置为1，200 psi。压力和温度稳定后，按下 "排气 "按钮，使压力缓慢下降。
6. 一旦腔室压力达到150 psi，按下 排气 按钮并等待压力降至0 psi。关闭临界点干燥器并取下盖玻片。
7. 使用 碳粘合剂 片在SEM铝试样安装座上安装盖玻片，并在溅射涂布机中使用金/钯进行溅射镀膜。
8. 打开 电源 按钮，等待真空度达到 30 mTorr。冲洗腔室以通过关闭气体开关并逆时针旋转 精细气体 阀来去除湿度和空气。
9. 一旦真空度增加到200 mTorr，请关闭气体开关，等待真空度达到30 mTorr。重复此步骤 3 次。
10. 按下 定时器 按钮并调整 电压 旋钮，直到仪表读数为10 mA。从腔室中取出涂层盖玻片。
    注意:按照制造商的说明对样品进行临界点干燥和溅射镀膜。

4. 成像和定量

1. 将样品盖玻片插入扫描电子显微镜的腔室中。关上门，然后按 依凡克 按钮。
2. 打开扫描电镜操作软件。将加速电压设置为15 kv，工作距离设置为10 mm。
3. 按 坐标按钮 并在控制器周围移动，直到单元格出现在观察屏幕的中心。将放大倍率设置为 3，500 倍，然后单击"照片"按钮对样品进行成像。
   注意:使用更高级别的放大倍率（8，500x至16，000x）以显示更详细的质膜。
4. 从盖玻片上的至少10个随机位置拍摄图像，确保每个微观场包含多个细胞。将图像另存为.tif文件。
5. 从图像中，定位膜褶皱，定义为质膜的突出的毯子状褶皱，尺寸大于500nm（图1）。计算每个单元格的褶皱数。
   注意:C形褶皱被鉴定为弯曲的膜突起，其侧端没有融合[（图1 （M-CSF处理）和 图2B]。熔融的圆形膜褶皱在闭合之前被鉴定为大旋毛细胞杯（图2C）。
6. 将膜褶皱的数量归一化为所评估的微观场中的细胞总数。对每组的样本重复此分析。

结果

在这里，我们描述了所呈现技术的结果。 图1 所示的代表性SEM图像显示，在用PMA和M-CSF处理后，RAW 264.7巨噬细胞中形成膜褶皱。首先以3，500x的放大倍率捕获图像以进行定量，然后在更高的放大倍率（8，500x至16，000x）下捕获图像，以显示更详细的质膜。用大旋细胞增多症抑制剂EIPA预处理巨噬细胞减弱膜褶皱形成（图1）。与大毛细胞增多症相关的质膜?...

讨论

目前的SEM成像方案提供了一种工具，用于可视化和量化体 外细胞表面的膜褶皱形成，圆形突起和大毛细胞杯。虽然目前的方案侧重于巨噬细胞，但研究表明，膜褶皱的形成也发生在各种其他细胞类型上，包括树突状细胞，成纤维细胞，神经元和癌细胞^{11，12，14，21，30}...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5% Trypsin-EDTA	Gibco	15400-054
2% Glutaraldehyde	Electron Microscopy Sciences	16320
4% Paraformaldehyde	Santa Cruz Biotechnology	281692
5-(N-ethyl-N-isopropyl)-Amiloride	Sigma Life Science	A3085
Accuri C6 Flow Cytometer
Carbon Adhesive Tabs	Electron Microscopy Sciences	77825-09
Dimethyl Sulfoxide	Corning	25-950-CQC
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Cytiva Life Sciences	SH30022.01
Falcon 24-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Cell Culture Plate	Falcon	353047
Fetal Bovine Serum	Gemini Bio	900-108
FitC-dextran	Thermo Fisher Scientific	D1823
FM 4-64	Thermo Fisher Scientific	T13320
HERAcell 150i CO2 incubator	Thermo Fisher Scientific	51026282
Hummer Model 6.2 Sputter Coater	Anatech USA	58565
JSM-IT500HR scanning electron microscope
Microscope Cover Glass	Thermo Fisher Scientific	12-545-82
Pen Strep	Gibco	15140-122
phorbol 12-myristate 13-acetate	Millipore Sigma	524400
RAW 264.7 macrophage	ATCC	ATCC TIB-71
Recombinant Human M-CSF	Peprotech	300-25
Samdri-790 Critical Point Dryer	Tousimis Research Corporation	8778B
SEM Aluminum Specimen Mounts	Electron Microscopy Sciences	75220
Sodium Cacodylate	Electron Microscopy Sciences	12300
Texas red-dextra	Thermo Fisher Scientific	D1864
Trypan Blue Solution	Thermo Fisher Scientific	15250061
Zeiss LSM 780 confocal microscope