JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Макропиноцитоз представляет собой высококонсервативный эндоцитарный процесс, инициируемый образованием F-актин-богатых листообразных мембранных проекций, также известных как мембранные оборки. Повышенная скорость макропиноцитотической интернализации растворенного вещества была вовлечена в различные патологические состояния. Этот протокол представляет собой метод количественной оценки образования мембранных оборок in vitro с использованием сканирующей электронной микроскопии.

Аннотация

Взъерошение мембраны представляет собой образование подвижных выступов плазматической мембраны, содержащих сетку из вновь полимеризованных актиновых нитей. Оборки мембран могут образовываться спонтанно или в ответ на факторы роста, воспалительные цитокины и сложные эфиры форбола. Некоторые из протрузий мембраны могут реорганизоваться в круглые оборки мембраны, которые сливаются на своих дистальных краях и образуют чашечки, которые закрываются и отделяются в цитоплазму в виде больших, гетерогенных вакуолей, называемых макропиносомами. Во время процесса оборки захватывают внеклеточную жидкость и растворенные вещества, которые интернализируются в макропиносомах. Сканирующая электронная микроскопия с высоким разрешением (SEM) является широко используемым методом визуализации для визуализации и количественной оценки образования мембранных оборков, круговых выступов и закрытых макропиноцитарных чашек на поверхности клетки. Следующий протокол описывает условия клеточной культуры, стимуляцию образования мембранных рюшей in vitro, а также способы фиксации, обезвоживания и подготовки клеток к визуализации с использованием SEM. Также описана количественная оценка взъерошивания мембраны, нормализация данных, а также стимуляторы и ингибиторы образования мембранных рюшей. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы о роли макропиноцитоза в физиологических и патологических процессах, исследовать новые мишени, регулирующие образование мембранных оборок, и выявить еще не охарактеризованные физиологические стимуляторы, а также новые фармакологические ингибиторы макропиноцитоза.

Введение

Макропиноцитоз представляет собой эндоцитарный процесс, ответственный за интернализацию большого количества внеклеточной жидкости и ее содержания путем образования динамических и актин-управляемых протрузий плазматической мембраны, называемых мембранными оборками1. Многие из этих мембранных оборок образуют чашечки, которые закрываются и сливаются обратно в клетку и отделяются от плазматической мембраны в виде больших, гетерогенных внутриклеточных эндосом, также известных как макропиносомы1. Хотя макропиноцитоз индуцируется факторами роста, такими как макрофагальный колониестимулирующий фактор (M-CSF) и эпидермальный фактор роста (EGF) в широком диапазоне типов клеток, дополнительный уникальный, кальций-зависимый процесс, известный как конститутивный макропиноцитоз, также наблюдался во врожденных иммунных клетках 2,3,4,5,6,7,8.

Было показано, что способность клеток интернализировать внеклеточный материал посредством макропиноцитоза играет важную роль в различных физиологических процессах, начиная от поглощения питательных веществ до захвата патогенов и представления антигена 9,10,11. Однако, поскольку этот процесс является неселективным и индуцируемым, он также был вовлечен в ряд патологических состояний. Действительно, предыдущие исследования показали, что макропиноцитоз играет важную роль в болезни Альцгеймера, болезни Паркинсона, раке, нефролитиазе и атеросклерозе 12,13,14,15,16. Кроме того, было показано, что некоторые бактерии и вирусы используют макропиноцитоз, чтобы проникнуть в клетки-хозяева и вызвать инфекцию17,18. Интересно, что стимуляция макропиноцитоза может быть также использована для адресной доставки терапевтических средств при различных заболеваниях19,20.

Предыдущие исследования изучали макропиноцитоз путем количественной оценки интернализованных флуоресцентно помеченных маркеров жидкой фазы в отсутствие и присутствие фармакологических агентов, которые ингибируют макропиноцитоз с использованием проточной цитометрии и конфокальной визуализации21,22. Доступные в настоящее время фармакологические средства, ингибирующие макропиноцитоз, ограничены и включают в себя 1) ингибиторы полимеризации актина (цитохалазин D и латрункулины), 2) блокаторы PI3K (LY-290042 и wortmannin) и 3) ингибиторы теплообменников натрия водорода (NHE) (амилорид и EIPA)5,14,15,23,24,25 . Однако, поскольку эти ингибиторы обладают независимыми от эндоцитоза эффектами, трудно выборочно определить вклад макропиноцитоза в поглощение растворенного вещества и патогенез заболевания, особенно in vivo21.

Сканирующая электронная микроскопия (SEM) - это тип электронного микроскопа, который производит изображения клеток со сверхвысоким разрешением с использованием сфокусированного пучка электронов26. В исследованиях макропиноцитоза визуализация SEM рассматривается как метод золотого стандарта для визуализации топографических и морфологических характеристик плазматической мембраны, количественной оценки образования мембранных оборок и исследования их прогрессирования в направлении интернализации макропиносом. Кроме того, сканирующая электронная микроскопия в сочетании с количественной оценкой поглощения растворенного вещества в присутствии и отсутствии блокаторов макропиноцитоза обеспечивает надежную стратегию для изучения интернализации макропиноцитотического растворенного вещества in vitro. В этой статье представлен подробный протокол о том, как подготовить клетки к SEM, визуализировать поверхность клеток, количественно оценить образование рюшей и изучить их прогресс в направлении закрытия чашки и интернализации макропиносом.

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Ниже приведен общий протокол, используемый для количественной оценки образования мембранных оборков в макрофагах RAW 264.7 с использованием микроскопии SEM. Оптимизация может потребоваться для различных типов клеток.

1. Клеточная линия и клеточная культура

  1. Выращивайте макрофаги RAW 264,7 в модифицированной орлиной среде (DMEM) Dulbecco, дополненные 10% (об/об) термоинактивированной фетальной бычьей сывороткой (FBS), 100 МЕ/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина в увлажненном инкубаторе при 37 °C и 5% CO2. Заменяйте питательные среды через день.
  2. Когда клетки станут на 80% сливающимися, промыть пластину два раза, используя стерильный PBS.
  3. Отделяют клетки путем добавления 1000 мкл 0,5% трипсина-ЭДТА и инкубируют пластину культуры клеток в течение 3-5 мин в увлажненном инкубаторе при 37 °C.
  4. Исследуйте пластину под световым микроскопом, чтобы подтвердить диссоциацию клеток. Добавьте 10 мл питательной среды, содержащей 10% FBS, чтобы инактивировать трипсин.
  5. Собрать клеточную суспензию в коническую трубку объемом 50 мл и центрифугу при 400 х г в течение 5 мин при комнатной температуре. Осторожно повторно суспендируйте клетки в полной питательной среде клеток и определите количество клеток и жизнеспособность с помощью окрашивания Trypan Blue (0,4%).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуемая минимальная жизнеспособность клеток для этого эксперимента составляет >90%.
  6. Поместите стерильные стеклянные крышки в колодцы из 24-луночной пластины с помощью автоклавных щипцов. Засейте клетки на покровные листы плотностью 1 х 106 клеток/мл и инкубируйте пластину в течение ночи в увлажненном инкубаторе при 37 °C и 5% CO2.
  7. Перед обработкой замените среду каждой лунки на свежую полную среду объемом 500 мкл. Предварительно обработать макрофаги носителем (ДМСО или другими растворителями, используемыми для растворения EIPA) или ингибитором макропиноцитоза 5-(N-этил-N-изопропил)-Амилоридом (EIPA, 25 мкМ21) в течение 30 мин.
  8. Обрабатывайте клетки носителями и стимуляторами макропиноцитоза для содействия взъерошению мембран: форбол 12-миристат 13-ацетат (PMA, 1 мкМ, 30 мин21) и макрофагальный колониестимулирующий фактор (M-CSF, 100 нг/мл, 30 мин3).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Альтернативные ингибиторы [например, латрункулин А (1 мкМ, 30 мин) или цитохалазин D (1 мкМ, 30 мин)] и стимуляторы [например, эпидермальный фактор роста (EGF, 100 нг/мл, 10 мин) или тромбоцитарный фактор роста (PDGF, 100 нг/мл, 15 мин)] макропиноцитоза могут также использоваться для характеристики макропиноцитоза в макрофагах и других типах клеток16,27, 28,29. Клеткам может потребоваться ночное сывороточное голодание перед лечением физиологическими стимуляторами макропиноцитоза. Важно отметить, что наиболее эффективные концентрации и время инкубации должны быть определены для стимуляции макропиноцитоза в других типах клеток.

2. Фиксация SEM

  1. После обработки дважды аспирируйте среду из колодцев и промывайте крышки ледяными ПБС.
  2. Фиксируют клетки (4% параформальдегида и 2% глутаральдегида в 0,1 М какодилата натрия) в течение 30 мин при комнатной температуре с последующей ночной инкубацией в фиксаторе при 4 °С.
  3. Аккуратно промыть и инкубировать покровы с 500 мкл следующих реагентов, не нарушая клеточный монослой.
    1. Промыть однократно в 0,1 М какодилата натрия и инкубировать в течение 15 мин.
    2. Дважды промыть с dH2O с 10 мин инкубации в каждой стирке.
    3. Дважды промыть 25% этанолом с 10 мин инкубации в каждой промывке.
    4. Дважды промыть 50% этанолом с 10 мин инкубации в каждой промывке.
    5. Дважды промыть 75% этанолом с 10 мин инкубации в каждой промывке.
    6. Дважды промыть 80% этанолом с 10 мин инкубации в каждой промывке.
    7. Дважды промыть 95% этанолом с 10 мин инкубации в каждой промывке.
    8. Дважды промыть 100% этанолом. Выполняйте 10 мин инкубации в каждой стирке.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Замена/замена реагентов должна производиться быстро, чтобы предотвратить высыхание клеток на воздухе. Покровные листы можно оставлять в 100% этаноле в течение нескольких дней при 4 °C. Для длительного хранения добавьте дополнительно 100% этанол и накройте колодцы парапленкой, чтобы предотвратить воздушную сушку образца.

3. Сушка в критической точке

  1. Поместите крышки в сушилку критической точки и накройте 100% этанолом. Нажмите кнопку питания и откройте резервуар CO2 .
  2. Нажимайте кнопку Cool в течение примерно 30 с, пока температура не снизится до 0 °C. Нажимайте кнопку «Заполнить», пока в окне камеры не появится пузырь.
  3. Нажимайте кнопку Purge до тех пор, пока запах этанола из выхлопных газов продувки не исчезнет. Нажмите кнопку Cool еще раз, пока температура не снизится до 0 °C.
  4. Нажмите кнопки «Заполнить» и «Очистить », чтобы выключить их и закрыть резервуар CO2 . Нажмите кнопку Cool , чтобы выключить ее, и нажмите кнопку Heat .
  5. Установите температуру на уровне 42 °C и давление на уровне 1 200 фунтов на квадратный дюйм. Как только давление и температура стабилизируются, нажмите кнопку «Выпуск за обрез », чтобы давление медленно снижалось.
  6. Как только давление в камере достигнет 150 фунтов на квадратный дюйм, нажмите кнопку Vent и подождите, пока давление не снизится до 0 фунтов на квадратный дюйм. Выключите сушилку в критической точке и снимите крышки.
  7. Монтируйте обшивки на алюминиевые крепления SEM с помощью карбоновых клеевых вкладок и подвергайте напылянию покрытия с использованием золота / палладия в напыляющемся покрытии.
  8. Включите кнопку питания и подождите, пока вакуум не достигнет 30 мТорр. Промывайте камеру, чтобы удалить влагу и воздух, выключив газовый выключатель и повернув газовый клапан Fine против часовой стрелки.
  9. Как только вакуум увеличится до 200 мТорр выключите газовый выключатель и подождите, пока вакуум не достигнет 30 мТорр. Повторите этот шаг 3 раза.
  10. Нажмите кнопку «Таймер» и отрегулируйте ручку напряжения до тех пор, пока датчик не покажет 10 мА. Снимите покрытые оболочкой чехлы из камеры.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Следуйте инструкциям производителя для выполнения сушки в критических точках и напыления покрытия образца.

4. Визуализация и количественная оценка

  1. Вставьте образцы крышки в камеру сканирующего электронного микроскопа. Закройте дверь и нажмите кнопку Evac .
  2. Откройте операционное программное обеспечение SEM. Установите ускоряющее напряжение на 15 кВ и рабочее расстояние на 10 мм.
  3. Нажмите кнопку «Координаты» и перемещайтесь вокруг контроллера, пока ячейки не появятся в центре экрана наблюдения. Установите увеличение в 3 500 раз и создайте образец, нажав кнопку «Фото».
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте более высокий уровень увеличения (от 8 500x до 16 000x), чтобы показать плазматическую мембрану более подробно.
  4. Делайте снимки по крайней мере из 10 случайных мест на крышках, убедившись, что каждое микроскопическое поле содержит несколько клеток. Сохраняйте изображения в виде .tif файлов.
  5. На снимках найдите мембранные оборки, определяемые как выступающие одеялоподобные складки плазматической мембраны, размером более 500 нм (рисунок 1). Подсчитайте количество оборок на ячейку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: С-образные оборки были идентифицированы как изогнутые мембранные выступы, которые не сливались на их боковых концах [(Рисунок 1 (обработка M-CSF) и Рисунок 2B]. Плавленые кольцевые мембранные оборки до их закрытия были идентифицированы как макропиноцитотические чашки (рисунок 2C).
  6. Нормализуйте количество оборок мембраны до общего числа клеток в оцениваемом микроскопическом поле. Повторите этот анализ для образцов из каждой группы.

Результаты

Здесь мы опишем результаты представленной методики. Репрезентативные изображения SEM, показанные на рисунке 1 , демонстрируют образование мембранных оборок в макрофагах RAW 264.7 после обработки PMA и M-CSF. Изображения были сначала сделаны с увеличением 3 500x для целей количеств...

Обсуждение

Настоящий протокол визуализации SEM предоставляет инструмент для визуализации и количественной оценки образования мембранных оборок, круговых выступов и макропиноцитарных чашек на поверхности клетки in vitro. Хотя текущий протокол фокусируется на макрофагах, исследования показали,...

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Авторы благодарят Либби Перри (Университет Августы) за помощь в подготовке проб SEM. Эта работа была поддержана Национальными институтами здравоохранения [R01HL139562 (G.C.) и K99HL146954 (B.S.)] и Американской кардиологической ассоциацией [17POST33661254 (B.S.)].

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
0.5% Trypsin-EDTAGibco15400-054
2% GlutaraldehydeElectron Microscopy Sciences16320
4% ParaformaldehydeSanta Cruz Biotechnology281692
5-(N-ethyl-N-isopropyl)-AmilorideSigma Life ScienceA3085
Accuri C6 Flow Cytometer
Carbon Adhesive TabsElectron Microscopy Sciences77825-09
Dimethyl SulfoxideCorning25-950-CQC
Dulbecco's Modified Eagle MediumCytiva Life SciencesSH30022.01
Falcon 24-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Cell Culture PlateFalcon353047
Fetal Bovine SerumGemini Bio900-108
FitC-dextranThermo Fisher ScientificD1823
FM 4-64Thermo Fisher ScientificT13320
HERAcell 150i CO2 incubatorThermo Fisher Scientific51026282
Hummer Model 6.2 Sputter CoaterAnatech USA58565
JSM-IT500HR scanning electron microscope
Microscope Cover GlassThermo Fisher Scientific12-545-82
Pen StrepGibco15140-122
phorbol 12-myristate 13-acetateMillipore Sigma524400
RAW 264.7 macrophageATCCATCC TIB-71
Recombinant Human M-CSFPeprotech300-25
Samdri-790 Critical Point DryerTousimis Research Corporation8778B
SEM Aluminum Specimen MountsElectron Microscopy Sciences75220
Sodium CacodylateElectron Microscopy Sciences12300
Texas red-dextraThermo Fisher ScientificD1864
Trypan Blue SolutionThermo Fisher Scientific15250061
Zeiss LSM 780 confocal microscope

Ссылки

  1. Bohdanowicz, M., Grinstein, S. Role of phospholipids in endocytosis, phagocytosis, and macropinocytosis. Physiological Reviews. 93 (1), 69-106 (2013).
  2. Canton, J. Macropinocytosis: New Insights Into Its Underappreciated Role in Innate Immune Cell Surveillance. Frontiers in Immunology. 9, 2286 (2018).
  3. Racoosin, E. L., Swanson, J. A. M-CSF-induced macropinocytosis increases solute endocytosis but not receptor-mediated endocytosis in mouse macrophages. Journal of Cell Science. 102, 867-880 (1992).
  4. Yoshida, S., et al. Differential signaling during macropinocytosis in response to M-CSF and PMA in macrophages. Frontiers in Physiology. 6, 8 (2015).
  5. Ghoshal, P., et al. Nox2-Mediated PI3K and Cofilin Activation Confers Alternate Redox Control of Macrophage Pinocytosis. Antioxidant and Redox Signal. 26 (16), 902-916 (2017).
  6. Bryant, D. M., et al. EGF induces macropinocytosis and SNX1-modulated recycling of E-cadherin. Journal of Cell Science. 120, 1818-1828 (2007).
  7. West, M. A., Bretscher, M. S., Watts, C. Distinct endocytotic pathways in epidermal growth factor-stimulated human carcinoma A431 cells. Journal of Cell Biology. 109 (6), 2731-2739 (1989).
  8. Hagiwara, M., Nakase, I. Epidermal growth factor induced macropinocytosis directs branch formation of lung epithelial cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 507 (1-4), 297-303 (2018).
  9. Commisso, C., et al. Macropinocytosis of protein is an amino acid supply route in Ras-transformed cells. Nature. 497 (7451), 633-637 (2013).
  10. Bosedasgupta, S., Pieters, J. Inflammatory stimuli reprogram macrophage phagocytosis to macropinocytosis for the rapid elimination of pathogens. PLoS Pathogens. 10 (1), 1003879 (2014).
  11. Liu, Z., Roche, P. A. Macropinocytosis in phagocytes: Regulation of MHC class-II-restricted antigen presentation in dendritic cells. Frontiers in Physiology. 6, 1 (2015).
  12. Zeineddine, R., Yerbury, J. J. The role of macropinocytosis in the propagation of protein aggregation associated with neurodegenerative diseases. Frontiers in Physiology. 6, 277 (2015).
  13. Yerbury, J. J. Protein aggregates stimulate macropinocytosis facilitating their propagation. Prion. 10 (2), 119-126 (2016).
  14. Jayashankar, V., Edinger, A. L. Macropinocytosis confers resistance to therapies targeting cancer anabolism. Nature Communication. 11 (1), 1121 (2020).
  15. Kanlaya, R., et al. Macropinocytosis is the major mechanism for endocytosis of calcium oxalate crystals into renal tubular cells. Cell Biochemistry and Biophysics. 67 (3), 1171-1179 (2013).
  16. Csanyi, G., et al. CD47 and Nox1 mediate dynamic fluid-phase macropinocytosis of native LDL. Antioxidants and Redox Signaling. 26 (16), 886-901 (2017).
  17. Francis, C. L., et al. Ruffles induced by Salmonella and other stimuli direct macropinocytosis of bacteria. Nature. 364 (6438), 639-642 (1993).
  18. Mercer, J., Helenius, A. Virus entry by macropinocytosis. Nature Cell Biology. 11 (5), 510-520 (2009).
  19. Liu, X., Ghosh, D. Intracellular nanoparticle delivery by oncogenic KRAS-mediated macropinocytosis. International Journal of Nanomedicine. 14, 6589-6600 (2019).
  20. Desai, A. S., Hunter, M. R., Kapustin, A. N. Using macropinocytosis for intracellular delivery of therapeutic nucleic acids to tumour cells. Philosophical Transactions of Royal Society of London B: Biological Sciences. 374 (1765), 20180156 (2019).
  21. Lin, H. P., et al. Identification of novel macropinocytosis inhibitors using a rational screen of Food and Drug Administration-approved drugs. British Journal of Pharmacology. 175 (18), 3640-3655 (2018).
  22. Singla, B., et al. PKCδ-Mediated Nox2 Activation Promotes Fluid-Phase Pinocytosis of Antigens by Immature Dendritic Cells. Frontiers in Immunology. 9, 537 (2018).
  23. Ivanov, A. I. Pharmacological inhibition of endocytic pathways: is it specific enough to be useful. Methods in Molecular Biology. 440, 15-33 (2008).
  24. Araki, N., et al. Effect of 3-methyladenine on the fusion process of macropinosomes in EGF-stimulated A431 cells. Cell Structure and Function. 31 (2), 145-157 (2006).
  25. Koivusalo, M., et al. Amiloride inhibits macropinocytosis by lowering submembranous pH and preventing Rac1 and Cdc42 signaling. Journal of Cell Biology. 188 (4), 547-563 (2010).
  26. Fischer, E. R., et al. Scanning electron microscopy. Current Protocols in Microbiology. , (2012).
  27. Yoshida, S., et al. Dorsal ruffles enhance activation of Akt by growth factors. Journal of Cell Science. 131 (22), (2018).
  28. Nakase, I., et al. Active macropinocytosis induction by stimulation of epidermal growth factor receptor and oncogenic Ras expression potentiates cellular uptake efficacy of exosomes. Science Reports. 5, 10300 (2015).
  29. Gold, S., et al. A clathrin independent macropinocytosis-like entry mechanism used by bluetongue virus-1 during infection of BHK cells. PLoS One. 5 (6), 11360 (2010).
  30. Mishra, R., Bhowmick, N. A. Visualization of Macropinocytosis in Prostate Fibroblasts. Bio- Protocols. 9 (10), (2019).
  31. Gordon, R. E. Electron microscopy: A brief history and review of current clinical application. Methods in Molecular Biology. 1180, 119-135 (2014).
  32. Mahankali, M., et al. The mechanism of cell membrane ruffling relies on a phospholipase D2 (PLD2), Grb2 and Rac2 association. Cell Signaling. 23 (8), 1291-1298 (2011).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

171

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены