Visualisation de la formation de volants membranaires à l’aide de la microscopie électronique à balayage

Résumé

La macropinocytose est un processus endocytaire hautement conservé initié par la formation de projections membranaires en feuille riches en F-actine, également connues sous le nom de volants membranaires. L’augmentation du taux d’internalisation du soluté macropinocytotique a été impliquée dans diverses conditions pathologiques. Ce protocole présente une méthode pour quantifier la formation de volants membranaires in vitro à l’aide de la microscopie électronique à balayage.

Résumé

L’ébouriffement membranaire est la formation de protubérances mobiles de membranes plasmiques contenant un maillage de filaments d’actine nouvellement polymérisés. Les volants membranaires peuvent se former spontanément ou en réponse à des facteurs de croissance, des cytokines inflammatoires et des esters de phorbol. Certaines des protubérances membranaires peuvent se réorganiser en volants membranaires circulaires qui fusionnent à leurs marges distales et forment des coupelles qui se ferment et se séparent dans le cytoplasme sous forme de grandes vacuoles hétérogènes appelées macropinosomes. Au cours du processus, les volants piègent le liquide extracellulaire et les solutés qui s’internalisent dans les macropinosomes. La microscopie électronique à balayage (MEB) à haute résolution est une technique d’imagerie couramment utilisée pour visualiser et quantifier la formation de volants membranaires, les protubérances circulaires et les coupelles macropinocytaires fermées à la surface de la cellule. Le protocole suivant décrit les conditions de culture cellulaire, la stimulation de la formation de volants membranaires in vitro et la façon de fixer, de déshydrater et de préparer les cellules à l’imagerie à l’aide du MEB. La quantification des volants membranaires, la normalisation des données et les stimulateurs et inhibiteurs de la formation de volants membranaires sont également décrits. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés sur le rôle de la macropinocytose dans les processus physiologiques et pathologiques, à étudier de nouvelles cibles qui régulent la formation des volants membranaires et à identifier des stimulateurs physiologiques encore non caractérisés ainsi que de nouveaux inhibiteurs pharmacologiques de la macropinocytose.

Introduction

La macropinocytose est un processus endocytaire responsable de l’internalisation d’une grande quantité de liquide extracellulaire et de son contenu via la formation de protubérances membranaires dynamiques et entraînées par l’actine appelées volants membranaires¹. Beaucoup de ces volants membranaires forment des coupelles qui se ferment et fusionnent sur la cellule et se séparent de la membrane plasmique sous forme de gros endosomes intracellulaires hétérogènes également connus sous le nom de macropinosomes¹. Bien que la macropinocytose soit induite par des facteurs de croissance tels que le facteur de stimulation des colonies de macrophages (M-CSF) et le facteur de croissance épidermique (EGF) dans un large éventail de types de cellules, un processus unique et dépendant du calcium connu sous le nom de macropinocytose constitutive a également été observé dans les cellules immunitaires innées 2,3,4,5,6,7,8.

Il a été démontré que la capacité des cellules à internaliser le matériel extracellulaire par macropinocytose joue un rôle important dans divers processus physiologiques allant de l’absorption des nutriments à la capture des agents pathogènes et à la présentation des antigènes ^9,10,11. Cependant, parce que ce processus est non sélectif et inductible, il a également été impliqué dans un certain nombre de conditions pathologiques. En effet, des études antérieures ont suggéré que la macropinocytose joue un rôle important dans la maladie d’Alzheimer, la maladie de Parkinson, le cancer, la néphrolithiase et l’athérosclérose 12,13,14,15,16. De plus, il a été démontré que certaines bactéries et certains virus utilisent la macropinocytose pour pénétrer dans les cellules hôtes et induire une infection^17,18. Fait intéressant, la stimulation de la macropinocytose peut également être exploitée pour l’administration ciblée d’agents thérapeutiques dans diverses maladies^19,20.

Des études antérieures ont exploré la macropinocytose en quantifiant les marqueurs de phase fluide intériorisés marqués par fluorescence en l’absence et en présence d’agents pharmacologiques qui inhibent la macropinocytose à l’aide de la cytométrie en flux et de l’imagerie confocale^21,22. Les outils pharmacologiques actuellement disponibles qui inhibent la macropinocytose sont limités et comprennent 1) des inhibiteurs de polymérisation de l’actine (cytochalasine D et latrunculines), 2) des bloqueurs PI3K (LY-290042 et wortmannine) et 3) des inhibiteurs des échangeurs d’hydrogène sodique (NHE) (amiloride et EIPA)5,14,15,23,24,25 . Cependant, comme ces inhibiteurs ont des effets indépendants de l’endocytose, il est difficile de déterminer sélectivement la contribution de la macropinocytose à l’absorption du soluté et à la pathogenèse de la maladie, en particulier in vivo²¹.

La microscopie électronique à balayage (MEB) est un type de microscope électronique qui produit des images à ultra-haute résolution de cellules à l’aide d’un faisceau focalisé d’électrons²⁶. Dans la recherche sur la macropinocytose, l’imagerie SEM est considérée comme la technique de référence pour visualiser les caractéristiques topographiques et morphologiques de la membrane plasmique, quantifier la formation de volants membranaires et étudier leur progression vers l’internalisation des macropinosomes. En outre, la microscopie électronique à balayage combinée à la quantification de l’absorption du soluté, en présence et en l’absence de bloqueurs de macropinocytose, fournit une stratégie fiable pour examiner l’internalisation du soluté macropinocytotique in vitro. Cet article fournit un protocole détaillé sur la façon de préparer les cellules pour le SEM, de visualiser la surface cellulaire, de quantifier la formation de volants et d’examiner leurs progrès vers la fermeture de la coupe et l’internalisation des macropinosomes.

Protocole

REMARQUE: Ce qui suit est un protocole général utilisé pour quantifier la formation de volants membranaires dans les macrophages RAW 264.7 à l’aide de la microscopie SEM. Une optimisation peut être nécessaire pour différents types de cellules.

1. Lignée cellulaire et culture cellulaire

1. Cultiver des macrophages RAW 264,7 dans le milieu Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco complété par 10% (vol/vol) de sérum fœtal bovin (FBS) inactivé par la chaleur, 100 UI/mL de pénicilline et 100 μg/mL de streptomycine dans un incubateur humidifié à 37 °C et 5 % de CO₂. Remplacez les supports de croissance tous les deux jours.
2. Lorsque les cellules deviennent confluentes à 80%, lavez la plaque deux fois à l’aide de PBS stérile.
3. Détacher les cellules en ajoutant 1 000 μL de trypsine-EDTA à 0,5 % et incuber la plaque de culture cellulaire pendant 3 à 5 min dans un incubateur humidifié à 37 °C.
4. Examinez la plaque au microscope optique pour confirmer la dissociation cellulaire. Ajouter 10 mL de milieux de croissance contenant 10 % de FBS pour inactiver la trypsine.
5. Recueillir la suspension cellulaire dans un tube conique de 50 mL et centrifuger à 400 x g pendant 5 min à température ambiante. Resuspendez doucement les cellules dans le milieu de culture cellulaire complet et déterminez le nombre de cellules et la viabilité à l’aide de la coloration au bleu de trypan (0,4%).
   REMARQUE: La viabilité cellulaire minimale recommandée pour cette expérience est de >90%.
6. Placez des couvercles de verre stériles dans les puits d’une plaque de 24 puits à l’aide de pinces autoclavées. Ensemencez les cellules sur des couvercles à une densité de 1 x 10⁶ cellules/mL et incubez la plaque pendant la nuit dans un incubateur humidifié à 37 °C et 5 % de CO₂.
7. Changer le milieu de chaque puits avec un milieu complet frais de 500 μL avant le traitement. Prétraiter les macrophages avec du véhicule (DMSO ou d’autres solvants utilisés pour dissoudre l’EIPA) ou l’inhibiteur de la macropinocytose 5-(N-éthyl-N-isopropyl)-amiloride (EIPA, 25 μM²¹) pendant 30 min.
8. Traiter les cellules avec un véhicule et des stimulateurs de macropinocytose pour favoriser l’ébouriffement de la membrane: phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA, 1 μM, 30 min²¹) et facteur de stimulation des colonies de macrophages (M-CSF, 100 ng / mL, 30 min³).
   REMARQUE: Des inhibiteurs alternatifs [par exemple, la latrunculine A (1 μM, 30 min) ou la cytochalasine D (1 μM, 30 min)] et des stimulateurs [par exemple, facteur de croissance épidermique (EGF, 100 ng / mL, 10 min) ou facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGF, 100 ng / mL, 15 min)] de macropinocytose peuvent également être utilisés pour caractériser la macropinocytose chez les macrophages et d’autres types de cellules^{16,27, 28,29}. Les cellules peuvent nécessiter une famine sérique pendant la nuit avant le traitement avec des stimulateurs physiologiques de la macropinocytose. Il est important de noter que les concentrations et les temps d’incubation les plus efficaces devront être déterminés pour stimuler la macropinocytose dans d’autres types de cellules.

2. Fixation SEM

1. Après le traitement, aspirez les milieux des puits et lavez les couvercles avec du PBS glacé deux fois.
2. Fixer les cellules (4 % de paraformaldéhyde et 2 % de glutaraldéhyde dans 0,1 M de cacodylate de sodium) pendant 30 min à température ambiante, suivie d’une incubation nocturne dans le fixateur à 4 °C.
3. Lavez et incubez délicatement les couvercles avec 500 μL de réactifs suivants sans perturber la monocouche cellulaire.
   1. Laver une fois dans 0,1 M de cacodylate de sodium et incuber pendant 15 min.
   2. Laver deux fois avec dH₂O avec 10 min d’incubation dans chaque lavage.
   3. Laver deux fois avec de l’éthanol à 25% avec 10 min d’incubation dans chaque lavage.
   4. Laver deux fois avec de l’éthanol à 50% avec 10 min d’incubation dans chaque lavage.
   5. Laver deux fois avec de l’éthanol à 75% avec 10 min d’incubation dans chaque lavage.
   6. Laver deux fois avec de l’éthanol à 80% avec 10 min d’incubation dans chaque lavage.
   7. Laver deux fois avec de l’éthanol à 95% avec 10 min d’incubation dans chaque lavage.
   8. Laver deux fois avec de l’éthanol à 100%. Effectuez 10 min d’incubation dans chaque lavage.
      REMARQUE: Le changement / remplacement des réactifs doit être effectué rapidement pour éviter le séchage à l’air des cellules. Les couvercles peuvent être laissés dans de l’éthanol à 100% pendant plusieurs jours à 4 °C. Pour un stockage à long terme, ajoutez de l’éthanol supplémentaire à 100 % et couvrez les puits avec un parafilm pour éviter le séchage à l’air de l’échantillon.

3. Séchage des points critiques

1. Placez les couvercles dans un sécheur à points critiques et couvrez-les avec de l’éthanol à 100%. Appuyez sur le bouton d’alimentation et ouvrez le réservoir de CO₂ .
2. Appuyez sur le bouton Refroidir pendant environ 30 s jusqu’à ce que la température diminue à 0 °C. Appuyez sur le bouton Remplir jusqu’à ce qu’une bulle apparaisse dans la fenêtre de la chambre.
3. Appuyez sur le bouton Purge jusqu’à ce que l’odeur d’éthanol de l’échappement de purge disparaisse. Appuyez à nouveau sur le bouton Refroidir jusqu’à ce que la température diminue à 0 °C.
4. Appuyez sur les boutons Fill et Purge pour les éteindre et fermer le réservoir de CO₂ . Appuyez sur le bouton Cool pour l’éteindre et appuyez sur le bouton Heat .
5. Réglez la température à 42 °C et la pression à 1 200 psi. Une fois la pression et la température stabilisées, appuyez sur le bouton Bleed pour permettre à la pression de diminuer lentement.
6. Une fois que la pression de la chambre atteint 150 psi, appuyez sur le bouton Vent et attendez que la pression diminue à 0 psi. Éteignez le séchoir à points critiques et retirez les couvercles.
7. Montez des couvercles sur des supports d’échantillons en aluminium SEM à l’aide de languettes d’adhésif carbone et soumis à un revêtement de pulvérisation à l’aide d’or / palladium dans un enduit de pulvérisation.
8. Allumez le bouton d’alimentation et attendez que l’aspirateur atteigne 30 mTorr. Rincez la chambre pour éliminer l’humidité et l’air en éteignant l’interrupteur à gaz et en tournant la vanne de gaz Fine dans le sens inverse des aiguilles d’une montre.
9. Une fois que le vide augmente à 200 mTorr éteignez l’interrupteur à gaz et attendez que le vide atteigne 30 mTorr. Répétez cette étape 3 fois.
10. Appuyez sur le bouton Minuterie et ajustez le bouton Tension jusqu’à ce que la jauge indique 10 mA. Retirez les couvercles enduits de la chambre.
    REMARQUE: Suivez les instructions du fabricant pour effectuer le séchage aux points critiques et le revêtement par pulvérisation de l’échantillon.

4. Imagerie et quantification

1. Insérez des couvercles d’échantillon dans la chambre d’un microscope électronique à balayage. Fermez la porte et appuyez sur le bouton Evac .
2. Ouvrez le logiciel d’opération SEM. Réglez la tension d’accélération sur 15 kv et la distance de travail sur 10 mm.
3. Appuyez sur le bouton Coordonnées et déplacez-vous autour du contrôleur jusqu’à ce que les cellules apparaissent au centre de l’écran d’observation. Réglez le grossissement sur 3 500x et imagez l’échantillon en cliquant sur le bouton Photo.
   REMARQUE: Utilisez un niveau de grossissement plus élevé (8 500x à 16 000x) pour montrer la membrane plasmique avec plus de détails.
4. Prenez des images d’au moins 10 endroits aléatoires sur les couvercles, en vous assurant que chaque champ microscopique contient plusieurs cellules. Enregistrez les images en tant que fichiers .tif.
5. À partir des images, localisez les volants de membrane, définis comme des plis saillants en forme de couverture de la membrane plasmique, d’une taille supérieure à 500 nm (Figure 1). Comptez le nombre de volants par cellule.
   REMARQUE : Les volants en forme de C ont été identifiés comme des protubérances membranaires incurvées qui ne fusionnaient pas à leurs extrémités latérales [(Figure 1 (traitement M-CSF) et Figure 2B]. Des volants de membrane circulaire fusionnés, avant leur fermeture, ont été identifiés comme des ventouses macropinocytotiques (figure 2C).
6. Normaliser le nombre de volants membranaires au nombre total de cellules dans le champ microscopique évalué. Répétez cette analyse pour les échantillons de chaque groupe.

Résultats

Ici, nous décrivons les résultats de la technique présentée. Les images SEM représentatives montrées à la figure 1 montrent la formation de volants membranaires dans les macrophages RAW 264.7 après un traitement par PMA et M-CSF. Les images ont d’abord été capturées à un grossissement de 3 500x à des fins de quantification, puis à des niveaux de grossissement plus élevés (8 500x à 16 000x) pour montrer la membrane plasmique avec plus de détails. Le prétraitement des macr...

Discussion

Le protocole d’imagerie SEM actuel fournit un outil pour visualiser et quantifier la formation de volants membranaires, les protubérances circulaires et les coupes macropinocytaires à la surface de la cellule in vitro. Bien que le protocole actuel se concentre sur les macrophages, des études ont montré que la formation de volants membranaires se produit également sur divers autres types de cellules, y compris les cellules dendritiques, les fibroblastes^{, les} neurones et les cellules...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5% Trypsin-EDTA	Gibco	15400-054
2% Glutaraldehyde	Electron Microscopy Sciences	16320
4% Paraformaldehyde	Santa Cruz Biotechnology	281692
5-(N-ethyl-N-isopropyl)-Amiloride	Sigma Life Science	A3085
Accuri C6 Flow Cytometer
Carbon Adhesive Tabs	Electron Microscopy Sciences	77825-09
Dimethyl Sulfoxide	Corning	25-950-CQC
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Cytiva Life Sciences	SH30022.01
Falcon 24-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Cell Culture Plate	Falcon	353047
Fetal Bovine Serum	Gemini Bio	900-108
FitC-dextran	Thermo Fisher Scientific	D1823
FM 4-64	Thermo Fisher Scientific	T13320
HERAcell 150i CO2 incubator	Thermo Fisher Scientific	51026282
Hummer Model 6.2 Sputter Coater	Anatech USA	58565
JSM-IT500HR scanning electron microscope
Microscope Cover Glass	Thermo Fisher Scientific	12-545-82
Pen Strep	Gibco	15140-122
phorbol 12-myristate 13-acetate	Millipore Sigma	524400
RAW 264.7 macrophage	ATCC	ATCC TIB-71
Recombinant Human M-CSF	Peprotech	300-25
Samdri-790 Critical Point Dryer	Tousimis Research Corporation	8778B
SEM Aluminum Specimen Mounts	Electron Microscopy Sciences	75220
Sodium Cacodylate	Electron Microscopy Sciences	12300
Texas red-dextra	Thermo Fisher Scientific	D1864
Trypan Blue Solution	Thermo Fisher Scientific	15250061
Zeiss LSM 780 confocal microscope