Taramalı Elektron Mikroskobu ile Membran Fırfırı Oluşumunu Görselleştirme

Özet

Makropinositoz, membran fırfırları olarak da bilinen F-aktin bakımından zengin tabaka benzeri membran projeksiyonlarının oluşumu ile başlatılan oldukça korunmuş bir endositik işlemdir. Makropinositotik solut içselleştirme oranının artması çeşitli patolojik durumlarda rol oynamıştır. Bu protokol, taramalı elektron mikroskobu kullanarak membran fırfırı oluşumunu in vitro olarak ölçmek için bir yöntem sunar.

Özet

Membran karıştırma, yeni polimerize aktin filamentlerinin bir ağını içeren hareketli plazma membran çıkıntılarının oluşumudur. Membran fırfırları kendiliğinden veya büyüme faktörlerine, inflamatuar sitokinlere ve forbol esterlerine yanıt olarak oluşabilir. Membran çıkıntılarının bazıları, distal kenarlarında kaynaşan dairesel membran fırfırları halinde yeniden organize olabilir ve makropinozomlar adı verilen büyük, heterojen vakuoller olarak sitoplazmaya kapanan ve ayrılan kaplar oluşturabilir. İşlem sırasında, fırfırlar hücre dışı sıvıyı ve makropinozomlar içinde içselleşen çözünürleri yakalar. Yüksek çözünürlüklü taramalı elektron mikroskobu (SEM), hücre yüzeyindeki membran fırfırı oluşumunu, dairesel çıkıntıları ve kapalı makropinositik kapları görselleştirmek ve ölçmek için yaygın olarak kullanılan bir görüntüleme tekniğidir. Aşağıdaki protokol, hücre kültürü koşullarını, membran fırfırı oluşumunun in vitro olarak uyarılmasını ve SEM kullanarak görüntüleme için hücrelerin nasıl düzeltileceğini, dehidre edileceğini ve hazırlanacağını açıklamaktadır. membran karıştırmanın miktarı, veri normalizasyonu ve membran fırfırı oluşumunun uyarıcıları ve inhibitörleri de açıklanmaktadır. Bu yöntem, makropinositozun fizyolojik ve patolojik süreçlerdeki rolü hakkındaki temel soruları cevaplamaya, membran fırfırı oluşumunu düzenleyen yeni hedefleri araştırmaya ve henüz tanımlanmamış fizyolojik stimülatörlerin yanı sıra makropinositozun yeni farmakolojik inhibitörlerini tanımlamaya yardımcı olabilir.

Giriş

Makrokinositoz, membran fırfırları¹ adı verilen dinamik ve aktin güdümlü plazma membran çıkıntılarının oluşumu yoluyla büyük miktarda hücre dışı sıvının ve içeriğinin içselleştirilmesinden sorumlu endositik bir işlemdir. Bu zar fırfırlarının çoğu, hücreye kapanan ve tekrar kaynaşan ve plazma zarından makropinozomlar 1 olarak da bilinen büyük, heterojen hücre içi endozomlar^olarak ayrılan bardaklar oluşturur. Makropinositoz, çok çeşitli hücre tiplerinde makrofaj koloni uyarıcı faktör (M-CSF) ve epidermal büyüme faktörü (EGF) gibi büyüme faktörleri tarafından indüklenmesine rağmen, doğuştan gelen immün hücrelerde 2,3,4,5,6,7,8 olarak bilinen ek bir benzersiz^, kalsiyum bağımlı süreç de gözlenmiştir.

Hücrelerin makropinositoz yoluyla hücre dışı materyali içselleştirme yeteneğinin, besin alımından patojen yakalamaya ve antijen sunumuna kadar çeşitli fizyolojik süreçlerde önemli bir rol oynadığı gösterilmiştir 9,10,11. Bununla birlikte, bu süreç seçici olmadığı ve indüklenebilir olduğu için, bir dizi patolojik duruma da dahil olmuştur. Nitekim, önceki çalışmalar makropinositozun Alzheimer hastalığı, Parkinson hastalığı, kanser, nefrolitiyazis ve aterosklerozda önemli bir rol oynadığını ileri sürmüştür 12,13,14,15,16. Ayrıca, bazı bakteri ve virüslerin konakçı hücrelere girmek ve enfeksiyonu indüklemek için makropinositozu kullandıkları gösterilmiştir^17,18. İlginçtir ki, makropinositozun uyarılması, çeşitli hastalık koşullarında terapötik ajanların hedefe yönelik olarak verilmesi için de^{kullanılabilir19,20}.

Önceki çalışmalar, makropinositozu inhibe eden farmakolojik ajanların yokluğunda ve varlığında ekstraktüre floresan etiketli sıvı faz belirteçlerini primer primer ve konfokal görüntüleme kullanarak nicelleştirerek makropinositozu araştırmıştır^21,22. Makropinositozu inhibe eden mevcut farmakolojik araçlar, 1) aktin polimerizasyon inhibitörleri (sitokalasin D ve latrunkülinler), 2) PI3K blokerleri (LY-290042 ve wortmannin) ve 3) sodyum hidrojen eşanjörlerinin (NHE) (amilorid ve EIPA) inhibitörleri ^ile sınırlıdır ve bunlardan oluşur ^{5,14,15,23,24,25} . Ancak bu inhibitörlerin endositozdan bağımsız etkileri olduğu için makropinositozun özellikle in vivo²¹ olmak üzere solute alım ve hastalık patogenezine katkısını seçici olarak belirlemek zordur.

Taramalı elektron mikroskobu (SEM), odaklanmış bir elektron demeti kullanarak hücrelerin ultra yüksek çözünürlüklü görüntülerini üreten bir elektron mikroskobu türüdür²⁶. Makropinositoz araştırmalarında, SEM görüntüleme, plazma zarının topografik ve morfolojik özelliklerini görselleştirmek, membran fırfırı oluşumunu ölçmek ve makropinozom içselleştirmeye doğru ilerlemelerini araştırmak için altın standart teknik olarak kabul edilmektedir. Ayrıca, taramalı elektron mikroskobu, makropinositoz blokerlerinin varlığında ve yokluğunda, çözünen alımının nicelleştirilmesi ile birlikte, makropinositotik çözünen içselleştirmeyi in vitro olarak incelemek için güvenilir bir strateji sağlar. Bu yazıda, hücrelerin SEM için nasıl hazırlanacağı, hücre yüzeyinin görselleştirileceği, fırfırlı oluşumunun nasıl ölçüleceği ve fincan kapanışı ve makropinozom içselleştirme yönündeki ilerlemelerinin nasıl inceleneceği konusunda ayrıntılı bir protokol sunulmaktadır.

Protokol

NOT: Aşağıdakiler, SEM mikroskobu kullanılarak RAW 264.7 makrofajlarında membran fırfırı oluşumunu ölçmek için kullanılan genel bir protokoldür. Farklı hücre tipleri için optimizasyon gerekebilir.

1. Hücre hattı ve hücre kültürü

1. Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamında (DMEM) %10 (hacim/hacim) ısıyla inaktive edilmiş Fetal Sığır Serumu (FBS), 100 IU/mL penisilin ve 100 μg/mL streptomisin ile desteklenmiş RAW 264.7 makrofajlarını nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 °C'de ve %5 CO_2'de büyütün. Büyüme medyasını her geçen gün değiştirin.
2. Hücreler% 80 birleştiğinde, steril PBS kullanarak plakayı iki kez yıkayın.
3. 1.000 μL% 0.5 tripsin-EDTA ekleyerek hücreleri ayırın ve hücre kültürü plakasını 37 ° C'de nemlendirilmiş bir inkübatörde 3-5 dakika boyunca inkübe edin.
4. Hücre ayrışmasını doğrulamak için plakayı bir ışık mikroskobu altında inceleyin. Tripsini etkisiz hale getirmek için %10 FBS içeren 10 mL büyüme ortamı ekleyin.
5. Hücre süspansiyonunu 50 mL'lik bir konik tüp içinde toplayın ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 400 x g'de santrifüj yapın. Tüm hücre kültürü ortamındaki hücreleri nazikçe askıya alın ve Trypan Blue (% 0.4) boyamasını kullanarak hücre sayısını ve canlılığını belirleyin.
   NOT: Bu deney için önerilen minimum hücre canlılığı %>90'dır.
6. Steril cam kapakları, otoklavlanmış forseps kullanarak 24 delikli bir plakanın kuyucuklarına yerleştirin. Tohum hücreleri, 1 x 10⁶ hücre / mL yoğunlukta kapaklar üzerine kayar ve plakayı 37 ° C'de ve% 5 CO_2'de nemlendirilmiş bir inkübatörde gece boyunca inkübe eder.
7. İşlemden önce her bir kuyucuğun ortamını taze 500 μL tam medya ile değiştirin. Makrofajlara araç (DMSO veya EIPA'yı çözmek için kullanılan diğer çözücüler) veya makropinositoz inhibitörü 5-(N-etil-N-izopropil)-Amilorid (EIPA, 25 μM²¹) ile 30 dakika boyunca ön işlem yapın.
8. Membran karışıklığını teşvik etmek için hücreleri makropinositoz aracı ve uyarıcıları ile tedavi edin: forbol 12-miristat 13-asetat (PMA, 1 μM, 30 dakika²¹) ve makrofaj kolonisi uyarıcı faktör (M-CSF, 100 ng / mL, 30 dakika³).
   NOT: Makropinositozun alternatif inhibitörleri [örneğin, latrunkülin A (1 μM, 30 dakika) veya sitokalasin D (1 μM, 30 dakika)] ve uyarıcılar [örneğin, epidermal büyüme faktörü (EGF, 100 ng / mL, 10 dakika) veya trombosit kaynaklı büyüme faktörü (PDGF, 100 ng / mL, 15 dakika)] makropinositozu karakterize etmek için de kullanılabilir^{16,27, 28,29}. Hücreler, makropinositozun fizyolojik uyarıcıları ile tedaviden önce gece boyunca serum açlığı gerektirebilir. Diğer hücre tiplerinde makropinositozu uyarmak için en etkili konsantrasyonların ve kuluçka sürelerinin belirlenmesi gerektiğine dikkat etmek önemlidir.

2. SEM sabitleme

1. Tedaviden sonra, ortamı kuyulardan aspire edin ve kapakları buz gibi soğuk PBS ile iki kez yıkayın.
2. Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca hücreleri (0.1 M sodyum kakodilat içinde% 4 paraformaldehit ve% 2 glutaraldehit) sabitleyin, ardından 4 ° C'de fiksatif içinde gece boyunca inkübasyon.
3. Hücre tek tabakasını bozmadan kapak kapaklarını 500 μL aşağıdaki reaktiflerle nazikçe yıkayın ve inkübe edin.
   1. 0.1 M sodyum kakodilatta bir kez yıkayın ve 15 dakika boyunca inkübe edin.
   2. Her yıkamada 10 dakikalık inkübasyonla dH₂O ile iki kez yıkayın.
   3. Her yıkamada 10 dakikalık inkübasyonla% 25 etanol ile iki kez yıkayın.
   4. Her yıkamada 10 dakikalık inkübasyonla% 50 etanol ile iki kez yıkayın.
   5. Her yıkamada 10 dakikalık inkübasyonla% 75 etanol ile iki kez yıkayın.
   6. Her yıkamada 10 dakikalık inkübasyonla% 80 etanol ile iki kez yıkayın.
   7. Her yıkamada 10 dakikalık inkübasyonla% 95 etanol ile iki kez yıkayın.
   8. % 100 etanol ile iki kez yıkayın. Her yıkamada 10 dakikalık inkübasyon yapın.
      NOT: Reaktiflerin değiştirilmesi/değiştirilmesi, hücrelerin hava ile kurumasını önlemek için hızlı bir şekilde yapılmalıdır. Kapaklar 4 °C'de birkaç gün boyunca% 100 etanol içinde bırakılabilir. Uzun süreli depolama için, ilave %100 etanol ekleyin ve numunenin havayla kurumasını önlemek için kuyuları parafilm ile örtün.

3. Kritik nokta kurutma

1. Kapak fişlerini Kritik Nokta Kurutucuya yerleştirin ve% 100 etanol ile örtün. Güç düğmesine basın ve CO₂ tankını açın.
2. Sıcaklık 0 °C'ye düşene kadar Serin düğmesine yaklaşık 30 s basın. Bölme penceresinde bir kabarcık görünene kadar Doldur düğmesine basın.
3. Temizleme egzozundan gelen etanol kokusu kaybolana kadar Temizle düğmesine basın. Sıcaklık 0 °C'ye düşene kadar Serin düğmesine tekrar basın.
4. Doldurmak ve Temizle düğmelerini kapatmak ve CO₂ deposunu kapatmak için düğmesine basın. Kapatmak için Soğut düğmesine basın ve Isı düğmesine basın.
5. Sıcaklığı 42 °C'ye ve basıncı 1.200 psi'ye ayarlayın. Basınç ve sıcaklık dengelendikten sonra, basıncın yavaşça düşmesine izin vermek için Boşaltma düğmesine basın.
6. Oda basıncı 150 psi'ye ulaştığında, Havalandırma düğmesine basın ve basınç 0 psi'ye düşene kadar bekleyin. Kritik nokta kurutucuyu kapatın ve kapak kapaklarını çıkarın.
7. Karbon Yapışkan tırnaklar kullanılarak SEM alüminyum numune montajları üzerine montaj kapakları kayar ve bir püskürtme kaplayıcısında altın/paladyum kullanılarak püskürtme kaplamasına tabi tutulur.
8. Güç düğmesini açın ve vakum 30 mTorr'a ulaşana kadar bekleyin. Gaz anahtarını kapatıp Fine gaz valfini saat yönünün tersine çevirerek nemi ve havayı gidermek için odayı yıkayın.
9. Vakum 200 mTorr'a yükseldiğinde gaz anahtarını kapatın ve vakum 30 mTorr'a ulaşana kadar bekleyin. Bu adımı 3 kez tekrarlayın.
10. Zamanlayıcı düğmesine basın ve gösterge 10 mA okuyana kadar Voltaj düğmesini ayarlayın. Kaplamalı kapak kapaklarını odadan çıkarın.
    NOT: Numunenin kritik nokta kurutma ve püskürtme kaplamasını gerçekleştirmek için üreticinin talimatlarına uyun.

4. Görüntüleme ve niceleme

1. Numune kapaklarını taramalı elektron mikroskobunun odasına yerleştirin. Kapıyı kapatın ve Evac düğmesine basın.
2. SEM işletim yazılımını açın. Hızlanan voltajı 15 kv'ye ve çalışma mesafesini 10 mm'ye ayarlayın.
3. Koordinatlar düğmesine basın ve hücreler gözlem ekranının ortasında görünene kadar kontrol cihazının etrafında hareket edin. Büyütmeyi 3.500x olarak ayarlayın ve Fotoğraf düğmesini tıklatarak örneği görüntüleyin.
   NOT: Plazma zarını daha ayrıntılı olarak göstermek için daha yüksek bir büyütme düzeyi (8.500x ila 16.000x) kullanın.
4. Kapak fişlerinde en az 10 rastgele konumdan görüntü çekerek her mikroskobik alanın birden fazla hücre içerdiğinden emin olun. Görüntüleri .tif dosyaları olarak kaydedin.
5. Görüntülerden, plazma zarının çıkıntılı battaniye benzeri kıvrımları olarak tanımlanan, 500 nm'den büyük bir boyuta sahip membran fırfırlarını bulun (Şekil 1). Hücre başına fırfırlı sayısını sayın.
   NOT: C-şekilli fırfırlar, lateral uçlarında kaynaşmayan kavisli membran çıkıntıları olarak tanımlanmıştır [(Şekil 1 (M-BOS tedavisi) ve Şekil 2B]. Kaynaşmış dairesel membran fırfırları, kapanmadan önce, makropinositotik kaplar olarak tanımlandı (Şekil 2C).
6. Membran fırfırlarının sayısını, değerlendirilen mikroskobik alandaki toplam hücre sayısına normalleştirin. Her gruptan örnekler için bu analizi tekrarlayın.

Sonuçlar

Burada, sunulan teknikten elde edilen sonuçları açıklıyoruz. Şekil 1'de gösterilen temsili SEM görüntüleri, PMA ve M-CSF ile tedaviyi takiben RAW 264.7 makrofajlarında membran fırfırı oluşumunu göstermektedir. Görüntüler ilk önce nicelleştirme amacıyla 3.500x'lik bir büyütmede ve daha sonra plazma zarını daha ayrıntılı olarak göstermek için daha yüksek büyütme seviyelerinde (8.500x ila 16.000x) yakalandı. Makrofajların makropinositoz inhibitörü EIPA ile ...

Tartışmalar

Mevcut SEM görüntüleme protokolü, in vitro hücre yüzeyindeki membran fırfırı oluşumunu, dairesel çıkıntıları ve makropinositik kapları görselleştirmek ve ölçmek için bir araç sağlar. Mevcut protokol makrofajlara odaklanmasına rağmen, çalışmalar membran fırfırı oluşumunun dendritik hücreler, fibroblastlar, nöronlar ve kanser hücreleri ^{11,12,14,21,30}

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5% Trypsin-EDTA	Gibco	15400-054
2% Glutaraldehyde	Electron Microscopy Sciences	16320
4% Paraformaldehyde	Santa Cruz Biotechnology	281692
5-(N-ethyl-N-isopropyl)-Amiloride	Sigma Life Science	A3085
Accuri C6 Flow Cytometer
Carbon Adhesive Tabs	Electron Microscopy Sciences	77825-09
Dimethyl Sulfoxide	Corning	25-950-CQC
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Cytiva Life Sciences	SH30022.01
Falcon 24-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Cell Culture Plate	Falcon	353047
Fetal Bovine Serum	Gemini Bio	900-108
FitC-dextran	Thermo Fisher Scientific	D1823
FM 4-64	Thermo Fisher Scientific	T13320
HERAcell 150i CO2 incubator	Thermo Fisher Scientific	51026282
Hummer Model 6.2 Sputter Coater	Anatech USA	58565
JSM-IT500HR scanning electron microscope
Microscope Cover Glass	Thermo Fisher Scientific	12-545-82
Pen Strep	Gibco	15140-122
phorbol 12-myristate 13-acetate	Millipore Sigma	524400
RAW 264.7 macrophage	ATCC	ATCC TIB-71
Recombinant Human M-CSF	Peprotech	300-25
Samdri-790 Critical Point Dryer	Tousimis Research Corporation	8778B
SEM Aluminum Specimen Mounts	Electron Microscopy Sciences	75220
Sodium Cacodylate	Electron Microscopy Sciences	12300
Texas red-dextra	Thermo Fisher Scientific	D1864
Trypan Blue Solution	Thermo Fisher Scientific	15250061
Zeiss LSM 780 confocal microscope