Visualisierung der Membranrüschenbildung mittels Rasterelektronenmikroskopie

Zusammenfassung

Macropinozytose ist ein hochkonservierter endozytischer Prozess, der durch die Bildung von F-Aktin-reichen blattartigen Membranprojektionen, auch bekannt als Membranrüschen, ausgelöst wird. Eine erhöhte Rate der makropinozytotischen Internalisierung gelöster Stoffe wurde mit verschiedenen pathologischen Zuständen in Verbindung gebracht. Dieses Protokoll stellt eine Methode zur Quantifizierung der Membranrüschenbildung in vitro mittels Rasterelektronenmikroskopie dar.

Zusammenfassung

Membran-Ruffling ist die Bildung von beweglichen Plasmamembranvorsprüngen, die ein Geflecht aus neu polymerisierten Aktinfilamenten enthalten. Membranrüschen können sich spontan oder als Reaktion auf Wachstumsfaktoren, entzündliche Zytokine und Phorbolester bilden. Einige der Membranvorsprünge können sich zu kreisförmigen Membranrüschen reorganisieren, die an ihren distalen Rändern verschmelzen und Becher bilden, die sich als große, heterogene Vakuolen, die Makropinosomen genannt werden, schließen und in das Zytoplasma trennen. Während des Prozesses fangen Rüschen extrazelluläre Flüssigkeit und gelöste Stoffe ein, die sich in Makropinosomen verinnerlichen. Die hochauflösende Rasterelektronenmikroskopie (REM) ist ein häufig verwendetes bildgebendes Verfahren zur Visualisierung und Quantifizierung von Membranrüschenbildung, kreisförmigen Vorsprüngen und geschlossenen makropinozytären Bechern auf der Zelloberfläche. Das folgende Protokoll beschreibt die Zellkulturbedingungen, die Stimulation der Membranrüschenbildung in vitro und die Fixierung, Dehydrierung und Vorbereitung von Zellen für die Bildgebung mit REM. Die Quantifizierung von Membranrüschen, Datennormalisierung sowie Stimulatoren und Inhibitoren der Membranrüschenbildung werden ebenfalls beschrieben. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen über die Rolle der Makropinozytose in physiologischen und pathologischen Prozessen zu beantworten, neue Ziele zu untersuchen, die die Bildung von Membranrüschen regulieren, und noch nicht charakterisierte physiologische Stimulatoren sowie neuartige pharmakologische Inhibitoren der Makropinozytose zu identifizieren.

Einleitung

Macropinozytose ist ein endozytärer Prozess, der für die Internalisierung einer großen Menge extrazellulärer Flüssigkeit und ihres Gehalts durch die Bildung von dynamischen und aktingetriebenen Plasmamembranvorsprüngen, den sogenannten Membranrüschen,^{verantwortlich ist 1}. Viele dieser Membranrüschen bilden Tassen, die sich schließen und wieder mit der Zelle verschmelzen und sich von der Plasmamembran als große, heterogene intrazelluläre Endosomen^, auch Makropinosomen 1 genannt, trennen. Obwohl die Makropinozytose durch Wachstumsfaktoren wie den Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor (M-CSF) und den epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) in einer Vielzahl von Zelltypen induziert wird, wurde ein weiterer einzigartiger, kalziumabhängiger Prozess, der als konstitutive Makropinozytose bekannt ist, auch in angeborenen Immunzellen^beobachtet 2,3,4,5,6,7,8.

Es hat sich gezeigt, dass die Fähigkeit von Zellen, extrazelluläres Material durch Makropinozytose zu internalisieren, eine wichtige Rolle in einer Vielzahl von physiologischen Prozessen spielt, die von der Nährstoffaufnahme über den Erregerfang bis hin zur Antigenpräsentation^reichen 9,10,11. Da dieser Prozess jedoch nicht selektiv und induzierbar ist, wurde er auch mit einer Reihe von pathologischen Zuständen in Verbindung gebracht. Tatsächlich deuteten frühere Studien darauf hin, dass die Makropinozytose eine wichtige Rolle bei der Alzheimer-Krankheit, der Parkinson-Krankheit, Krebs, Nephrolithiasis und Atherosklerose^spielt 12,13,14,15,16. Darüber hinaus haben bestimmte Bakterien und Viren gezeigt, dass sie Makropinozytose nutzen, um in Wirtszellen einzudringen und eine Infektion zu induzieren^17,18. Interessanterweise kann die Stimulation der Makropinozytose auch für die gezielte Abgabe von Therapeutika bei verschiedenen Krankheitszuständen genutzt werden^19,20.

Frühere Studien haben die Makropinozytose untersucht, indem internalisierte fluoreszenzmarkierte Fluidphasenmarker in Abwesenheit und Vorhandensein von pharmakologischen Wirkstoffen, die die Makropinozytose hemmen, mittels Durchflusszytometrie und konfokaler Bildgebung^{quantifiziert wurden 21,22}. Derzeit verfügbare pharmakologische Werkzeuge, die die Makropinozytose hemmen, sind beschränkt auf und umfassen 1) Aktinpolymerisationsinhibitoren (Cytochalasin D und Latrunculine), 2) PI3K-Blocker (LY-290042 und Wortmannin) und 3) Inhibitoren von Natrium-Wasserstoff-Austauschern (NHE) (Amilorid und EIPA)5,14,15,23,24,25 . Da diese Inhibitoren jedoch endozytoseunabhängige Wirkungen haben, ist es schwierig, den Beitrag der Makropinozytose zur Aufnahme von gelösten Stoffen und zur Krankheitspathogenese selektiv zu bestimmen, insbesondere in vivo²¹.

Die Rasterelektronenmikroskopie (REM) ist eine Art Elektronenmikroskop, das ultrahochauflösende Bilder von Zellen mit einem fokussierten Elektronenstrahl²⁶ erzeugt. In der Makropinozytoseforschung gilt die REM-Bildgebung als die Goldstandardtechnik, um topographische und morphologische Eigenschaften der Plasmamembran zu visualisieren, die Bildung von Membranrüschen zu quantifizieren und ihr Fortschreiten zur Makropinosomenverinnerlichung zu untersuchen. Darüber hinaus bietet die Rasterelektronenmikroskopie in Kombination mit der Quantifizierung der Aufnahme gelöster Stoffe in Gegenwart und Abwesenheit von Makropinozytoseblockern eine zuverlässige Strategie zur Untersuchung der makropinozytotischen Internalisierung gelöster Stoffe in vitro. Dieses Papier enthält ein detailliertes Protokoll, wie Zellen auf REM vorbereitet, die Zelloberfläche visualisiert, die Rüschenbildung quantifiziert und ihr Fortschritt in Richtung Cup-Verschluss und Makropinosom-Internalisierung untersucht werden.

Protokoll

HINWEIS: Das Folgende ist ein allgemeines Protokoll zur Quantifizierung der Membranrüschenbildung in RAW 264.7-Makrophagen mittels REM-Mikroskopie. Für verschiedene Zelltypen kann eine Optimierung erforderlich sein.

1. Zelllinie und Zellkultur

1. Züchten Sie RAW 264,7 Makrophagen in Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM), ergänzt mit 10% (vol/vol) hitzeinaktiviertem fetalem Rinderserum (FBS), 100 I.E./ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C und 5% CO₂. Ersetzen Sie Wachstumsmedien jeden zweiten Tag.
2. Wenn die Zellen zu 80% konfluieren, waschen Sie die Platte zweimal mit sterilem PBS.
3. Die Zellen werden durch Zugabe von 1.000 μL 0,5% Trypsin-EDTA abgelöst und die Zellkulturplatte für 3-5 min in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C inkubiert.
4. Untersuchen Sie die Platte unter einem Lichtmikroskop, um die Zelldissoziation zu bestätigen. Fügen Sie 10 ml Wachstumsmedien hinzu, die 10% FBS enthalten, um Trypsin zu inaktivieren.
5. Sammeln Sie die Zellsuspension in einem 50 ml konischen Röhrchen und zentrifugieren Sie bei 400 x g für 5 min bei Raumtemperatur. Suspendieren Sie die Zellen sanft im gesamten Zellkulturmedium und bestimmen Sie die Zellzahl und Lebensfähigkeit mit Trypan Blue (0,4%) Färbung.
   HINWEIS: Die empfohlene Mindestzelllebensfähigkeit für dieses Experiment beträgt >90%.
6. Platzieren Sie sterile Glasabdeckungen in Vertiefungen einer 24-Well-Platte mit autoklavierten Pinzetten. Samen Sie Zellen auf Deckgläser mit einer Dichte von 1 x 10⁶ Zellen/ml und inkubieren Sie die Platte über Nacht in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C und 5% CO₂.
7. Wechseln Sie das Medium jeder Vertiefung vor der Behandlung mit frischen 500 μL Vollmedien. Vorbehandlung von Makrophagen mit Vehikel (DMSO oder anderen Lösungsmitteln zur Auflösung von EIPA) oder dem Makropinozytoseinhibitor 5-(N-ethyl-N-isopropyl)-Amilorid (EIPA, 25 μM²¹) für 30 min.
8. Behandeln Sie Zellen mit Vehikel und Stimulatoren der Makropinozytose, um das Membran-Ruffling zu fördern: Phorbol 12-Myrisat 13-Acetat (PMA, 1 μM, 30 min²¹) und Makrophagenkolonie-stimulierender Faktor (M-CSF, 100 ng / ml, 30 min³).
   HINWEIS: Alternative Inhibitoren [z. B. Latrunculin A (1 μM, 30 min) oder Cytochalasin D (1 μM, 30 min)] und Stimulatoren [z. B. epidermaler Wachstumsfaktor (EGF, 100 ng/ml, 10 min) oder von Blutplättchen abgeleiteter Wachstumsfaktor (PDGF, 100 ng/ml, 15 min)] der Makropinozytose können auch zur Charakterisierung der Makropinozytose bei Makrophagen und anderen Zelltypen^{verwendet werden 16,27, 28,29} Zellen können vor der Behandlung mit physiologischen Stimulatoren der Makropinozytose über Nacht Serumhunger erfordern. Es ist wichtig zu beachten, dass die effektivsten Konzentrationen und Inkubationszeiten bestimmt werden müssen, um die Makropinozytose in anderen Zelltypen zu stimulieren.

2. SEM-Fixierung

1. Nach der Behandlung die Medien aus den Vertiefungen absaugen und Deckgläser zweimal mit eiskaltem PBS waschen.
2. Fixieren Sie Zellen (4% Paraformaldehyd und 2% Glutaraldehyd in 0,1 M Natriumcacodylat) für 30 min bei Raumtemperatur, gefolgt von einer Inkubation über Nacht im Fixiermittel bei 4 ° C.
3. Deckgläser mit 500 μL Folgereagenzien schonend waschen und inkubieren, ohne die Zellmonoschicht zu stören.
   1. Einmal in 0,1 M Natriumcacodylat waschen und 15 min inkubieren.
   2. Zweimal mit dH₂O waschen mit 10 min Inkubation in jeder Wäsche.
   3. Zweimal mit 25% Ethanol mit 10 min Inkubation in jeder Wäsche waschen.
   4. Zweimal mit 50% Ethanol waschen mit 10 min Inkubation in jeder Wäsche.
   5. Zweimal mit 75% Ethanol waschen mit 10 min Inkubation in jeder Wäsche.
   6. Waschen Sie zweimal mit 80% Ethanol mit 10 Minuten Inkubation in jeder Wäsche.
   7. Waschen Sie zweimal mit 95% Ethanol mit 10 Minuten Inkubation in jeder Wäsche.
   8. Zweimal mit 100% Ethanol waschen. Führen Sie 10 Minuten Inkubation in jeder Wäsche durch.
      HINWEIS: Das Wechseln / Ersetzen von Reagenzien sollte schnell erfolgen, um ein Austrocknen der Zellen an der Luft zu verhindern. Deckgläser können in 100% Ethanol für mehrere Tage bei 4 °C belassen werden. Für die Langzeitlagerung fügen Sie zusätzliches 100% Ethanol hinzu und bedecken Sie die Vertiefungen mit Parafilm, um ein Austrocknen der Probe an der Luft zu verhindern.

3. Kritische Punktetrocknung

1. Legen Sie die Deckgläser in einen Critical Point Dryer und bedecken Sie sie mit 100% Ethanol. Drücken Sie die Power-Taste und öffnen Sie den CO_2-Tank .
2. Drücken Sie die Cool-Taste ca. 30 s lang, bis die Temperatur auf 0 °C sinkt. Drücken Sie die Taste "Füllen", bis im Kammerfenster eine Blase angezeigt wird.
3. Drücken Sie die Löschtaste , bis der Geruch von Ethanol aus dem Spülauspuff verschwindet. Drücken Sie die Taste Cool erneut, bis die Temperatur auf 0 °C sinkt.
4. Drücken Sie die Tasten Fill und Purge, um sie auszuschalten und den CO_2-Tank zu schließen. Drücken Sie die Taste Cool, um sie auszuschalten, und drücken Sie die Taste Heat .
5. Stellen Sie die Temperatur auf 42 °C und den Druck auf 1.200 psi ein. Sobald sich der Druck und die Temperatur stabilisiert haben, drücken Sie die Bleed-Taste , damit der Druck langsam abnimmt.
6. Sobald der Kammerdruck 150 psi erreicht hat, drücken Sie die Entlüftungstaste und warten Sie, bis der Druck auf 0 psi sinkt. Schalten Sie den kritischen Punkttrockner aus und entfernen Sie die Deckgläser.
7. Montieren Sie Deckgläser auf REM-Aluminiumprobenhalterungen mit Carbon-Klebelaschen und unterliegen einer Sputterbeschichtung mit Gold / Palladium in einem Sputterbeschichter.
8. Schalten Sie den Netzschalter ein und warten Sie, bis das Vakuum 30 mTorr erreicht. Spülen Sie die Kammer, um Feuchtigkeit und Luft zu entfernen, indem Sie den Gasschalter ausschalten und das Feingasventil gegen den Uhrzeigersinn drehen.
9. Sobald das Vakuum auf 200 mTorr ansteigt, schalten Sie den Gasschalter aus und warten Sie, bis das Vakuum 30 mTorr erreicht. Wiederholen Sie diesen Schritt 3 Mal.
10. Drücken Sie die Timer-Taste und stellen Sie den Spannungsregler so lange ein, bis das Messgerät 10 mA anzeigt. Entfernen Sie beschichtete Deckgläser aus der Kammer.
    HINWEIS: Befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers, um eine kritische Punkttrocknung und Sputterbeschichtung der Probe durchzuführen.

4. Bildgebung und Quantifizierung

1. Probendeckel in die Kammer eines Rasterelektronenmikroskops einführen. Schließen Sie die Tür und drücken Sie die Evac-Taste .
2. Öffnen Sie die SEM-Betriebssoftware. Stellen Sie die Beschleunigungsspannung auf 15 kV und den Arbeitsabstand auf 10 mm ein.
3. Drücken Sie die Taste Koordinaten und bewegen Sie sich um den Controller herum, bis die Zellen in der Mitte des Beobachtungsbildschirms angezeigt werden. Stellen Sie die Vergrößerung auf das 3.500-fache ein und stellen Sie die Probe ab, indem Sie auf die Schaltfläche Foto klicken.
   HINWEIS: Verwenden Sie eine höhere Vergrößerungsstufe (8.500x bis 16.000x), um die Plasmamembran in größeren Details zu zeigen.
4. Nehmen Sie Bilder von mindestens 10 zufälligen Stellen auf den Deckgläsern auf und stellen Sie sicher, dass jedes mikroskopische Feld mehrere Zellen enthält. Speichern Sie Bilder als .tif Dateien.
5. Aus den Bildern finden Sie Membranrüschen, definiert als hervorstehende deckenartige Falten der Plasmamembran mit einer Größe von mehr als 500 nm (Abbildung 1). Zählen Sie die Anzahl der Rüschen pro Zelle.
   HINWEIS: C-förmige Rüschen wurden als gekrümmte Membranvorsprünge identifiziert, die an ihren seitlichen Enden nicht verschmolzen [(Abbildung 1 (M-CSF-Behandlung) und Abbildung 2B]. Verschmolzene kreisförmige Membranrüschen wurden vor ihrem Verschluss als makropinozytotische Becher identifiziert (Abbildung 2C).
6. Normalisieren Sie die Anzahl der Membranrüschen auf die Gesamtzahl der Zellen im ausgewerteten mikroskopischen Feld. Wiederholen Sie diese Analyse für die Proben aus jeder Gruppe.

Ergebnisse

Hier beschreiben wir die Ergebnisse der vorgestellten Technik. Repräsentative REM-Bilder, die in Abbildung 1 gezeigt werden, zeigen die Bildung von Membranrüschen in RAW 264,7-Makrophagen nach der Behandlung mit PMA und M-CSF. Die Bilder wurden zuerst mit einer Vergrößerung von 3.500x zu Quantifizierungszwecken und dann mit höheren Vergrößerungsgraden (8.500x bis 16.000x) aufgenommen, um die Plasmamembran in größeren Details zu zeigen. Vorbehandlung von Makrophagen mit dem Makropino...

Diskussion

Das vorliegende REM-Bildgebungsprotokoll bietet ein Werkzeug zur Visualisierung und Quantifizierung von Membranrüschenbildung, kreisförmigen Vorsprüngen und makropinozytären Bechern auf der Zelloberfläche in vitro. Obwohl sich das aktuelle Protokoll auf Makrophagen konzentriert, haben Studien gezeigt, dass die Bildung von Membranrüschen auch bei verschiedenen anderen Zelltypen auftritt, darunter^dendritische Zellen, Fibroblasten, Neuronen und Krebszellen 11,12,14,21,30.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5% Trypsin-EDTA	Gibco	15400-054
2% Glutaraldehyde	Electron Microscopy Sciences	16320
4% Paraformaldehyde	Santa Cruz Biotechnology	281692
5-(N-ethyl-N-isopropyl)-Amiloride	Sigma Life Science	A3085
Accuri C6 Flow Cytometer
Carbon Adhesive Tabs	Electron Microscopy Sciences	77825-09
Dimethyl Sulfoxide	Corning	25-950-CQC
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Cytiva Life Sciences	SH30022.01
Falcon 24-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Cell Culture Plate	Falcon	353047
Fetal Bovine Serum	Gemini Bio	900-108
FitC-dextran	Thermo Fisher Scientific	D1823
FM 4-64	Thermo Fisher Scientific	T13320
HERAcell 150i CO2 incubator	Thermo Fisher Scientific	51026282
Hummer Model 6.2 Sputter Coater	Anatech USA	58565
JSM-IT500HR scanning electron microscope
Microscope Cover Glass	Thermo Fisher Scientific	12-545-82
Pen Strep	Gibco	15140-122
phorbol 12-myristate 13-acetate	Millipore Sigma	524400
RAW 264.7 macrophage	ATCC	ATCC TIB-71
Recombinant Human M-CSF	Peprotech	300-25
Samdri-790 Critical Point Dryer	Tousimis Research Corporation	8778B
SEM Aluminum Specimen Mounts	Electron Microscopy Sciences	75220
Sodium Cacodylate	Electron Microscopy Sciences	12300
Texas red-dextra	Thermo Fisher Scientific	D1864
Trypan Blue Solution	Thermo Fisher Scientific	15250061
Zeiss LSM 780 confocal microscope